共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

このプロトコルの全体的な目標は、顕微鏡を使用して糸状菌糸上の細菌バイオフィルムの形成を分析することです。この方法は、細菌のバイオフィルムが菌糸上でどのように形成されるか、それらがどれほど特異的であるか、そしてそれらが何でできているかなど、微生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ナノメートルからセンチメートルの範囲の複数のスケールで真菌菌糸上の細菌バイオフィルム形成を調査できることです。

この手順のデモンストレーションは、私の研究室のCora Miquel Guennocと、INRA PTEF Platformの電子顕微鏡エンジニアであるChristophe Roseが行います。まず、ペトリ皿と同じ直径のセロハン膜を調製し、沸騰したEDTAに30分間置きます。次に、脱イオン水を使用してシートをすすぎ、2回オートクレーブします。

真菌の前培養物を調製するには、EDTA前処理されたセロハン膜で覆われた寒天培地に真菌を接種します。最適な温度で培養物をインキュベートし、直径約1cmのコロニーを得る。培養前から、EDTAセロハン膜で覆われた適切な寒天培地のペトリ皿にメスを使用して培養前コロニーの外部領域を優しく引っ掻き、次に菌糸を寒天プレートに移します。

コロニーの直径が約1cmになるまで、プレートを最適な温度でインキュベートします。P.fluorescens BBc6などの細菌培養物を調製するには、滅菌ループを使用して寒天培地から2〜3個の個々の細菌コロニーを採取し、25ミリリットルのLBを接種します。培養物を最適な温度で一晩インキュベートします。バクテリアを一晩成長させた後、培養物を5, 000倍gで3分間遠心分離します。

次に、ペレットを25ミリリットルの滅菌0.1モルリン酸カリウム緩衝液に懸濁します。遠心分離を繰り返した後、同じバッファーを使用して、最終的な細菌濃度を10〜9細胞/mLに調整します。6ウェルマイクロプレートに5ミリリットルの細菌懸濁液を充填します。

滅菌カミソリの刃を使用して、真菌培養物のセロハン膜を正方形に切断し、各膜に単一のコロニーを配置します。次に、鉗子を使用して、菌糸を含むセロハン正方形を固体培地から慎重に取り除き、それらを細菌懸濁液の個々のウェルに移します。真菌のコロニーがセロハンから剥がれるまで、マイクロプレートを静かに振ってください。

次に、セロハンシートをはがし、真菌のコロニーをプレートに残します。マイクロプレートを20°Cで穏やかに攪拌しながら、使用する菌株と分析するステージに応じてしばらくインキュベートします。P.fluorescens BBc6 RA L.bicolorの場合、培養物を30分間インキュベートして初期段階のバイオフィルムを取得し、成熟したバイオフィルムの場合は最大16時間インキュベー

プランクトン性細菌および菌糸に静電的に付着した細菌を除去するには、強塩溶液で満たされた新しい6ウェルマイクロプレートに移して真菌をすすぎます。プレートを1分間静かに振ってください。真菌を、5ミリリットルの滅菌0.1モルリン酸カリウム緩衝液を含む新しい6ウェルマイクロプレートに移します。

プレートを2分間静かに振った後、真菌を新鮮な緩衝液に移します。真菌のコロニーを緩衝液に保ちながら、メスを使用してコロニーを約半分に切断します。染色するコロニーの半分を、1ミリリットルの滅菌水を含むシャーレに移し、Alexa Fluor 633に結合したコムギ胚芽凝集素などの真菌ネットワークを視覚化するための適切な蛍光色素を補充します。

次に、サンプルを暗闇でインキュベートします。染色後、サンプルを滅菌0.1モルリン酸カリウム緩衝液10ミリリットルが入ったシャーレ蓋に移してすすぎ、1分間静かに振とうします。スライドをペトリ皿の蓋に半分沈め、カット部分をスライドの上に浮かべるように繊細に配置します。

次に、スライドを緩衝液からゆっくりと持ち上げ、サンプルがスライドに穏やかに落ち着くようにします。最もデリケートな側面は、スライド上のサンプルの位置です。バイオフィルムの記述を避けるために、サンプルを位置決めする際にサンプルとスライドを浸漬し、イメージング前にサンプルをこれ以上動かさないようにする必要があります。

最後に、10マイクロリットルの退色防止封入剤をサンプルに加え、ガラスカバースリップで覆います。10倍または40倍の対物レンズを備えた共焦点レーザー顕微鏡でスライドを検査します。タイルスキャンとZスタック機能の組み合わせを使用して、真菌コロニーとバイオフィルムのグローバルな3Dビューを取得します。

電子顕微鏡検査を行うには、以前と同様に真菌を強塩溶液ですすいだ後、脱水ステップ中に塩結晶が形成されるのを防ぐために、真菌を緩衝液ではなく滅菌水に移します。バイオフィルムをサンプルホルダーに移し、余分な水分を取り除きます。次に、サンプルを可変圧力走査型電子顕微鏡のチャンバーに移します。

ペルチェ冷却ステージで、サンプルを摂氏マイナス50度まで凍結し、SEMチャンバー内で直接ゆっくりと凍結乾燥させ、100パスカルの可変圧力を15時間設定します。サンプルを取り出し、高真空の成膜システムに移します。次に、アルゴンプラズマの下にサンプルを2ナノメートルの白金でコーティングします。

コーティングされた試料を走査型電子顕微鏡、高分解能インレンズ検出器を使用した電界放出型電子銃、および1キロボルトの電子高圧で観察します。このバイオフィルムのメソスケール分析は、L.bicolor S238Nの菌糸上にP.fluorescens BBc6のバイオフィルムの不均一性分布を緑色で示しています(赤で示されています)。また、この分析により、一部のGFPタグ付き細菌のみが菌糸に付着した初期のステップ(赤で示されている)から、厚く成熟したバイオフィルムの形成まで、バイオフィルム形成の経時的な追跡が可能になりました。

ここに示すように、高解像度のメソスケール画像は、コロニー構造を取得するためのマイクロスケール分析にも使用されました。さらに、この高解像度の2D最大強度投影による3D共焦点画像の投影では、SYPRO Rubyによる特異的標識(赤)は、マトリックス中にタンパク質が存在することを示しており、GFP標識BBc6細菌とFUN-1標識真菌が濃い緑色で示されています。同じサンプルを脱水してコード化した後、SEMイメージングによりバイオフィルム構造のさらなる詳細を取得しました。

緑色の矢印はバイオフィルム内の細菌細胞を指し、黄色の矢印は真菌菌糸を指しています。この手法を習得すると、バイオフィルム形成と微生物の培養のためのインキュベーション時間を数えずに、1つのサンプルに対して約2時間半で完了します。この手順を試みる際には、この方法の成功は、わずか数層の菌糸で作られた非常に薄い真菌コロニーを得る能力に大きく依存することを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、突然変異誘発やin situハイブリダイゼーションなどの他の方法を使用して、バイオフィルムの機能的または化学的特性評価などの追加の質問に答えたり、複数種のバイオフィルムを研究したりすることができます。その開発後、この技術は、医学、環境科学、食品産業などの複数の分野の研究者が、真菌細菌の相互作用中のバイオフィルム形成を探求する道を開きました。このビデオを見た後、真菌菌糸上の細菌バイオフィルム形成を成長させ、分析する方法をよく理解しているはずです。