Name: マウス洞房結節の高分解能光学マッピング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T11:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 学ぶマウス洞房結節の高分解能光学マッピング手法。Langendorff灌流心臓または分離心房標本を用いて、ペースメーカー異常や不整脈の機序を解明する電気生理学的手法です。

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私たちはウィスコンシン大学マディソン医科大学のスタートアップ（A.V.G.）の支援を受けています。

全ての実験は、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所（NIHパブ号80から23）に従って行きました。これらの研究で使用されているすべての方法およびプロトコルは、（公開番号85から23は、1996年改訂）NIHによって公開実験動物の管理と使用に関するガイドライン以下のウィスコンシン大学の動物実験プロトコル委員会によって承認されています。本研究で用いた全ての動物は、実験動物の管理と使用に関する指針に準拠して人道的な世話を受けました。 1.ハートの取り外しおよびランゲンドルフ灌流<ol><li>心分離、水浴、水ジャケットを使用して、37℃に暖かいタイロード液の前に。 </li><li> 5％イソフルラン/ 95％O 2と、マウスを麻酔。 </li><li>痛みの反射の消失を確認することにより、麻酔の適切なレベルを確認してください。 </li><li>開胸術を行います。湾曲した5.5 &quot;メイヨーはさみと5.5&quot;ケリーの止血用を使用して、胸を開きます胸部の前面に1cmのカットを作るためにCEPS。 <ol><li>迅速に（30秒以内）胸から心臓を抽出します。 「肺組織をつかむと4.3使用して心膜と一緒に肺、胸腺および心臓をカットするように湾曲アイリス鉗子「アイリスはさみを4を使用してください。直接心をつかむしないでください。 </li><li>酸素（95％O 2/5％CO 2）でそれを洗って、一定温度（36.8±0.4°C）は、タイロード液を変更しました。 128.2のNaCl、4.7のKCl、1.19のNaH 2 PO 4、1.05のMgCl 2、1.3のCaCl 2、20.0のNaHCO 3、および11.1グルコース（pHは7.35±0.05）：以下の溶液組成（mMの中）を使用します。 </li></ol></li><li>同じ溶液に浸しながら、肺、胸腺、および脂肪組織を識別します。慎重に心臓からそれらを分析。湾曲した3「Vannas - テュービンゲンはさみと4.3 &quot;＃5鉗子を使用してください。 </li><li>その後、大動脈を識別し、カスタムメイドの21 Gカニューレの上にカニューレを挿入。 2つの湾曲4.3」＃5Bの力を使用しますpsの。 </li><li>挿管後、同時に灌流;（〜50ml /分の流速で浴中）（〜5ml /分の流速でカニューレを通してこれは大動脈圧に基づいて調整されるべきである、以下参照）、表面かん流します実験全体を通して温め、そして濾過タイロード溶液で心。冠循環の目詰まりを防止するために、インライン11ミクロンのナイロンフィルターを通して灌流液を渡します。 </li><li>灌流ラインに三方活栓ルアーロックを介して接続された圧力変換器（または圧力計）を用いて、大動脈の圧力を監視し、60から80 mmHgの間に維持します。この範囲内で大動脈圧を維持するために必要な場合、灌流速度を調整します。 </li></ol>ランゲンドルフ灌流心臓全体からSANの2光学マッピング<ol><li> 計装 <ol><li>水平に心を置き、Pに直径0.1mmのピンを使用して、チャンバのシリコンコーティングされた底部に心室頂点をピン実験中reventストリーム誘発性運動。12 </li><li>左心房（LA）と僧帽弁（MV）、肺静脈を介して左心室（LV）に小（0.012 &quot;IDのx 0.005&quot;）シリコンチューブを挿入します。響きの結合組織に絹縫合糸（4-0）によりチューブを固定してください。 </li><li>その後方側が（ 図1A、 左パネル）を上にして心を置きます。 </li><li>直径0.1mm minutienピンを用いてチャンバのシリコン底部までのRA心耳（RAA）のエッジをピン。 RAの後面を平坦にし、それはカメラの焦点面に配置されることを可能にするために、そのレベルを調整します。これは、心房の最大表面積から光学的測定を可能にします。 </li><li>絹縫合糸（4-0）による縄優れた（SVC）および（IVC）下大静脈、シリコンコーティングチャンバの底部に縫合糸のもう一方の端を伸ばし、ピン（ 図3Aを参照してください）。縫合糸はブロックしないことを確認してください光学視野。 </li><li> RAAの端にカスタムメイドのペーシング電極を配置します。電極を作製するために、使用したシリコンを0.5mm、電極間距離は、直径0.25mmの銀線を被覆し、ペーシング端1mmの長さのためにシリコンを欠きます。その後、2 ECG 12ミリメートル針（29ゲージ）の右心室と左心室の底部近くモノポーラ電極を配置します。心室の頂点に近いグランドECG電極を配置します。 </li></ol></li><li> 染色 <ol><li>蛍光染料及び電気機械脱共役剤のブレビスタチンの両方が光に敏感であるため、暗い部屋で、以下に記載されているすべての手順を実行します。まず、ジメチルスルホキシド（2.5 mM）の、アリコートそれをストック溶液、1.25 mg / mlでのように（30μLずつ）電位感受性色素RH-237またはジ-4- ANNEPSを準備し、-20℃でアリコートを保存します。 </li><li>温めた（37℃）タイロード溶液1ml色素ストック溶液の5-10μLに希釈した後、冠動脈灌流ラインに注入イン・ラインルアー注入ポートを使用して5-7分間かけて。 </li><li>事前にストック溶液（ジメチルスルホキシド中で2 mg / mlで、6.8 mm）とブレビスタチンを準備し、4℃で保管してください。 </li><li>安定化の20分後、灌流液に温めた0.5mlの（37°C）ブレビスタチンを追加して温めた（37℃）タイロード液1mlでブレビスタチン0.1mlの希薄。次に、インラインルアー注入ポートを使用して5-7分かけて冠動脈灌流ラインに注入。 </li></ol></li></ol>単離された心房準備からSANの3光学マッピング<ol><li> 計装 <ol><li>全心の準備のためのステップ1.1から1.5で説明したように、単離された心房の準備のために、心を分離し、カニューレを挿入。 </li><li>離れた前方側から心室を解剖。 図1A、 右パネルを参照してください、詳細については、＃1を切りました 。 </li><li>三尖弁VAを切断することにより、RAを開きます。TV-SVC軸に沿っLVE（TV）。 図1A、 右パネルを参照してください、詳細については＃2をカット 。 </li><li> RAAを開くには稜終の内側手足をカット。 図1A、 右パネルを参照してください、＃3を切りました 。 </li><li> RAAの右下隅の端に、以前のカット＃3の正中線からのカットを行うことにより、前方心房自由壁を開き、シリコンコーティングチャンバの底部に心房自由壁を平らにし、ピン。 ＃4をカットし 、 図1（a）の白抜き矢印で示す方向を参照してください。心房への損傷を防止するために準備を固定するための心室組織の縁を保持します。 </li><li> LAの付属物（LAA）のMV-上隅に沿ってMVを切断することによりLA同様に、開きました。 </li><li> LAAを開くには、LAAの中央縁近くまで前方心房自由壁を通って、開かれたLAAの真ん中からカット。 </li><li>前方心房自由壁ALOを開きます同じ方向をngの、その後のSylgardコーティングされたチャンバーの底にそれを平らにし、ピン。 </li><li>部分的に心房間中隔組織を削除します。これがフォーカスされていない組織からの光信号の散乱を低減します。したがって、LAおよびRAだけでなく、SANおよび房室接合部（AVJ）の両方がこの準備（ 図1B）でアクセス可能です。 </li><li>心外膜と心内膜面の両方から灌流を可能にするためにシリコンコーティングチャンバの底部から約0.5ミリメートルによる最終準備を持ち上げます。 </li><li>お風呂の灌流のためのSVCおよび〜30ミリリットル/分の近くにある集束されたフローのための〜12ミリリットル/分の一定速度で加温した（37℃）タイロード溶液で準備を表面かん流します。 </li><li>解剖RAAの端にカスタムメイドペーシング銀/塩化銀2電極（直径0.25mm）を配置します。そして、それぞれ、2 ECG 12ミリメートル針（29G）RAAおよびLAA近い電極（単極）を配置。地面ECG当選者を配置AVJの近くに乗りました。 </li></ol></li><li> 染色 <ol><li>電位感受性色素（RH-237またはジ-4- ANNEPS）の直接適用を実行します。このために、暖めた（37℃）タイロード溶液1mmの色素ストック溶液を1-2μLに希釈し、ゆっくりと、1mmのピペットを使用して製剤の表面上に希釈された色素を放出します。 </li><li>また、全体の心の準備（ステップ2.2.1-2.2.2）のために上記と同様のランゲンドルフ灌流心臓の冠状動脈の灌流を介して電圧感受性色素を持つ心房染色を行います。 <ol><li>記載されているように冠動脈灌流染色した後、心房準備を隔離します。十分な蛍光レベルに到達するために必要なときに追加の表面染色を実行します。クイック心房分離は、色素を漂白しないと染色の品質には影響しません。 </li></ol></li><li>電気機械脱共役剤、ブレビスタチンと準備を固定化。 BLE 3-5μLを希釈温めておいた（37℃）タイロード溶液中の原液bbistatin、ゆっくり準備と周囲の溶液の表面に希釈したブレビスタチンをリリース。ブレビスタチンので13,14が準備し、染色時の光に長時間露光を避けるため、光に敏感であることが示されています。 </li><li>収縮を抑制するために必要な量の追加のブレビスタチンのアプリケーションを実行します。通常、3つの追加アプリケーション（各アプリケーション当たり3~5μL）まで正確にSANおよび心房活性化を再構成するために十分なモーションアーチファクトを抑制するために使用することができます。 </li><li>灌流液中で温めたブレビスタチンの追加の0.5ミリリットルを追加します。この手順の間、心房組織を染色する色素/ブレビスタチンを可能にするために30秒間灌流を一時停止します。 </li></ol></li></ol> 4.光学マッピングの設定します注：光学マッピングシステムの詳細な説明は他の場所に提供されている12。 <ol><li> TEMでカメラを使用poral 2,000フレーム/秒以上の解像度、及び100ミクロン/ピクセル以上の空間分解能に到達する集光レンズのシリーズ。これは、SAN活性化および結節内伝播を再構成するために必要とされます。 </li><li>振動溶液からモーションアーチファクトを低減するために、心臓/孤立性心房準備の上、溶液の表面に小さなカバーガラスを固定します。 </li><li>定電流、低ノイズのハロゲンランプが提供する励起光（520±45 nmの波長）を使用します。柔軟な二股ライトガイドを使用して準備にフィルタされた光ビームを向けます。 </li><li>ロングパスフィルタ（&gt; 715 nm）を発する蛍光をフィルタリングします。収集し、デジタル化し、カメラメーカーが提供するソフトウェアを使用しているコンピュータ上で、取得した蛍光シグナルを保存します。 </li></ol> 5.データ処理注記：光学的マッピングデータを収集し、異なる時点での蛍光強度の行列の列として格納されます。各画素represe特定の時点での組織標本上の特定の位置から採取した蛍光強度の測定をNTS。バックグラウンド蛍光は、自動的に、膜電位の変化によって生成され、微小電極システムによって測定された活動電位（APS）に対応して倒立蛍光変化のより良好な視覚化を可能にするために、画素毎に除去されます。画像分割、空間フィルタリング、時間フィルタリング、ベースラインドリフト除去を含む光学撮像データを処理における様々なステップの詳細、集束レビューに設けられている。15 <ol><li>手動で、または組織の境界を決定するための特別なアルゴリズム（例えば、閾値化、エッジ検出）15を用いて、1（含まれる画素）と0（除外画素）のバイナリマスクを作成し、シーケンス内の各フレームにマスクを適用します。このプロセスは、さらなる処理のために関心のある領域を強調した二値画像を作成します。 </li><li> OPTの信号対雑音比を改善するためにiCalのデータは、関心のある選択された領域内の信号をフィルタリングします。このため、空間的な（ すなわち 、所望の畳み込みビンまたはカーネルによって定義されるように、隣接する蛍光画素の平均値、例えば3×3または、ノイズの多いデータ、5×5の場合）、および/または時間フィルタリング（例えば、バターワース、チェビシェフ型を使用1、チェビシェフ型2、楕円等 ）（ 図2）。データを解釈する際に念頭に置いて、ろ過によって誘発されるアーティファクトの可能性をキープ。詳細については、レビューを参照してください。15 </li><li>必要なときに（元の信号にハイパスフィルタまたは多項式フィッティングを使用して）、光学録音でベースラインのドリフトを削除してから1に0（最小蛍光）から各画素信号を正規化（最大蛍光）。 </li><li>単一のAP伝播の全画素の活性化時間を含む時間ウィンドウを選択します。 Fはfluorescenで最大アップストローク誘導体（DF / dtの最大の時間として、各画素に、その起動時間を割り当てCE強度）。全画素活性化時間を使用して、等時間活性化マップを再構築します。各アイソクロンは、このように同時に作動ピクセルが表示されます。 </li><li> AP持続時間（APD）の分布マップを再構築するために、画素ごとに（例えば、再分極の80％で、APD 80）再分極の特定のレベルでの活性化時間と時間の間の持続時間を計算します。全ての画素APDの値を使用して、APD分布等時マップを再構築します。各アイソクロンは、このように同じAPDを持つピクセルが表示されます。 </li><li> APの伝播の伝導速度を計算するために、5.4で算出起動時間データに製剤の表面に合います。このために、多項式表面フィッティングまたはローカルカーネルの表面平滑化を使用し、フィット表面の勾配からローカル伝導速度ベクトルを算出します。 </li><li>再分極マップを作成するには、各ピクセルにその再分極時間を割り当て、最大の第2導関数として定義される（D 2 F / dtは2）OAP、または90％の再分極の時間の終わりに光信号の。 </li></ol>

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利益相反は宣言されません。

ランゲンドルフ灌流心臓全体で1）無傷のSAN、および2）SANは、単離された中で、心房の準備を開いた：ここでは、マウスのSAN製剤の2種類を発表しました。製剤のこれらの2つのタイプは、異なる実験的な目的を果たします。ランゲンドルフ灌流心臓全体の製造においては、無傷の心房構造は、心房細動と同様に再入頻脈性不整脈の間にSANと心房の間の相互作用などの複雑な心房性不整脈を研究することを可能にするどの保存されている。これとは対照的に6、孤立心房準備中、心房三次元解剖学的束が乱れている擬似二次元構造体に開口し、平坦化します。これは、心房不整脈原性を研究するための理想的ではない孤立性心房準備をするリエントラント経路の解剖学的構造に影響を与える可能性があります。しかし、調製のこのタイプを使用して、主要なペースメーカーの位置（単数または複数）の部位、結節内の伝導、およびAP伝播Patternを正確に可視化し、詳細に調べることができます。また、無傷の心房が単離された調製物で、全体の心房表面は光学的マッピングのために利用可能である一方で後方図によって限定されるように思われます。 ...

人間の生理学の理解を飛躍的に向上させる新しい科学のブレークスルーは、しばしば技術の進歩によって先行します。例えば、蛍光光学マッピングでは、細胞と組織の両方における複数の生理学的パラメータを調べることができます。1,2 解剖学的構造が電気生理学的機能および機能障害とどのように関連しているかについての理解が大幅に向上しました。心臓では、洞房結節(SAN)や房室接合部などの自然なペースメーカーと伝導系は、周囲の心房筋細胞によって絶縁されたリンパ節筋細胞で構成されています。3-5 このような組織は、特殊な電気的特性を持つ複雑な3次元構造を作り出します。これらのペースメーカー構造の構造的および機能的リモデリングの両方が、重要な電気生理学的不均一性を形成することが認識されています。6,7 このような不均一性がSAN機能障害や心房性不整脈形成を引き起こすメカニズムを理解することは、これらの疾患の臨床治療に劇的に役立つでしょう。それには、光学マッピングなど、電気信号の伝播を組織レベルで可視化する技術が必要です。
最近、蓄積された証拠により、心房電気生理学および病理学の研究における光学マッピングの進歩が証明されました。2 しかし、斬新で厳密な研究は、実験データの正確な解釈に依存しており、その有効性と安定性は慎重な実験プロトコルに依存しています。遺伝子改変マウスは、副鼻腔症候群、ペースメーカー異常、心房性不整脈などのヒト疾患のモデル動物として研究に広く利用されています。6,8-11 したがって、蛍光光学マッピングとトランスジェニックマウスモデルの組み合わせは、さまざまな病状に関連する心臓の電気的異常を研究するための強力なツールを提供します。この論文では、マウスSANとアトリウムの高解像度光学マッピングのためのプロトコルを紹介します。具体的には、さまざまな色素ローディングアプローチ、実験中の色素漂白に対する時間的影響、および心拍数の安定性について議論し、比較します。

<table><tbody><tr><td>ウォータージャケット</td><td>Radnoti</td><td>1660シリーズティッシュバス 大臓器または単一細胞分離手順用</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス/サーキュレーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>1016S</td><td></td></tr><tr><td>圧力増幅器</td><td>ADインスツルメンツ</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>EMD ミリポア ナイロンネットフィルター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NY1102500</td><td></td></tr><tr><td>圧力トランスデューサ</td><td>ADステンレス鋼</td>の微細なピン<td>MLT0670</td><td></td>計器</tr><tr><td>-直径0.1mm</td><td>のファインサイエンスツール</td><td>26002-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>灌流ポンプ</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメン</td>ツ <td>PERIPRO-4LS</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフュージョン・ポンプ</td><td>ワールド・プレシジョン</td>ズ <td>PERIPRO-4HS</td><td></td></tr><tr><td>バンナス・チュビンゲンハサミ&nbsp;</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメン</td>ツ <td>503379</td><td></td></tr><tr><td>デュモン鉗子</td><td>ワールド・プレ</td>シジョン・インスツルメンツ <td>501201・500085</td><td></td></tr><tr><td>・メイヨー・シザース</td><td>ワールド・プレシジョン・インス</td>ツルメンツ <td>501750</td><td></td></tr><tr><td>ケリー止血鉗子</td><td>ワールド・プレシジョン・イン</td>スツルメンツ <td>501241</td><td></td></tr><tr><td>アイリス</td>・ファイヤープ <td>ワールド・プレシジョン・インスツルメン</td>ツ <td>15917</td><td></td></tr><tr><td>アイリスはさみ</td><td>ワールド精密機器</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>心電図12mm針(29ゲージ)電極(モノポーラ)&nbsp;</td><td>ADインスツルMLA1203</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インラインルアーインジェクションポート</td><td>Ibidi</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Ultima-L CMOSカメラ&nbsp;</td><td>サイメディア</td><td>MiCAM-05&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ハロゲンランプ</td><td>Moritex USA Inc</td><td>MHAB-150W</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (2H2O)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S217-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (6H2O)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 (H2O)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td> フィ<td>ッシャー・サイエンティフィック</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>ブレビスタチン・</td><td>トクリス・バイオサイエンス</td><td>1760</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S1109</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス洞房結節の高分解能光学マッピング

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) の機能不全とそれに伴う合併症は、心疾患の患者の罹患率の重要な原因となっています。これらの患者を治療するための新しい薬理学的治療法の開発は、SANの正常な生理学と病態生理学の両方を完全に理解することに依存しています。心臓のペースメイキングの研究の中で、マウスSANは、SANイオンチャネルまたはカルシウム処理タンパク質をコードするさまざまな遺伝子の発現の修飾が実現可能であるため、広く使用されています。電気生理学的および組織学的研究からの新たな証拠は、マウスSANの構造と機能が大型哺乳類に対して代表性と類似性も証明しています。これには、SANから心房への特殊な伝導経路の存在や、SAN内の複雑なペースメーカーの階層が含まれます。近年、光学マッピングの技術により、マウスSAN内およびマウスSANからの興奮および伝導の起源の探索と調査が大幅に容易になり、その結果、SANの理解が広がり、SAN機能障害関連疾患の臨床治療に役立っています。この原稿では、無傷のランゲンドルフ灌流された心臓と単離された心房調製物からマウスSANの光学マッピングを実行する方法を詳細に説明しました。このプロトコルは、マウスSANの生理学および病態生理学の理解を深めるための有用なツールです。

ランゲンドルフ灌流心臓から無傷SANの光学マッピング 自発的な洞調律のために再構成されたRA活性化等高線の典型的な例は、ランゲンドルフ灌流マウス心臓については、 図3に示されています。早期活性化点がSANを解剖学的に定義されているSVC周辺intercaval領域内に位置している。1.0および0.5ミリ秒のサンプリングレートで取得3,16つRA活性輪郭マップは図3Bに示されています。 SANの機能を評価するために、我々は、10~12 Hzで少なくとも1分間RAAペーシング後SAN回復時間（SANRT）。9の測定、電気刺激を停止し、SANRTは、最後に撮影APとの間の時間間隔として計算しました。最初の自発的AP（ 図3C）。 SANRTは、心拍数（ すな...

ここでは、高い空間分解能と時間分解能で、マウス右心房、特に洞房結節から電気活動の光学マッピングするためのプロトコルを提示します。

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

本実験プロトコルの目的は、無処置のLangendorff灌流心臓または単離心房標本を用いて、マウス洞房結節の光学マッピングを行うことです。この手法は、ペースメーカー機能の異常、洞不全症候群、および様々な疾患に関連する心房不整脈のメカニズムに関する、洞房結節の電気生理学および病態生理学分野における重要な疑問の解明に寄与します。本技術の主な利点は、極めて高い空間および時間分解能で、無処置の組織における複数のパラメータを調査できることです。足指へのピンチ刺激により適切な麻酔レベルを確認した後、5.5インチの曲型メイヨー剪刀と5.5インチのケリー止血鉗子を用いて、胸部の前面に1 cmの切開を加えます。4インチの曲型アイリスピンセットを用いて肺組織を素早く把持し、4/3インチのアイリス剪刀で肺、胸腺、心臓を心膜とともに一括して切り出します。これらの組織を、酸素供給した37 °Cの修飾タイロッド液で洗浄します。次に、曲がりのある3インチのVannas Tubingen鋏と4/3インチの5番ピンセットを用いて、心臓から肺、胸腺、および脂肪組織を除去します。続いて、特製の21ゲージカニューレと2本の曲がりのある4.3インチの5番Bピンセットを使用して大動脈にカニューレを挿入し、同時に37 °CのTyrode溶液で心臓を灌流および外液灌流します。その際、冠循環の閉塞を防ぐため、灌流前にインラインの11 µmナイロンフィルターに溶液を通します。その後、灌流ラインのルアーロックに三方活栓を介して圧力トランスデューサを接続して大動脈圧をモニタリングし、必要に応じて灌流速度を調整し、大動脈圧を60〜80 mmHgに維持します。Langendorff灌流心臓を用いて洞房結節の光学マッピングを行うには、臓器をガラス製組織器官バスチャンバー内に、背面を上にした水平方向で配置します。実験中の流れによる動きを防ぐため、直径0.1 millimeterのピンを使用して心室尖端をチャンバーのシリコンコーティングされた底面に固定します。肺静脈、左心房、僧帽弁を経由して左心室に小さなシリコンチューブを挿入し、40絹縫合糸を用いてチューブを周囲の結合組織に固定します。次に、別の40絹縫合糸を用いて上大静脈と下大静脈を縛り、右心耳の端をチャンバーの底面にピンで固定します。縫合糸のもう一方の端をチャンバーの底に伸ばして固定し、右心耳の縁にカスタムメイドのペーシング電極を配置します。次に、右心室と左心室の基部付近に12 mmの心電図単極針電極を2本配置し、心室尖付近に心電図接地電極を配置します。組織を染色するには、希釈した染料を冠動脈灌流ラインのインライン灌流ポートに注入し、5〜7分かけて投与します。20分間の安定化後、37 °Cに加温したblebbistatinを0.5 mL灌流液に添加し、続いてblebbistatinを1 mLの37 °C Tyrode溶液で希釈したものを0.1 mL、インラインLuerロック注入ポートを用いて冠動脈灌流ラインにさらに5〜7分かけて注入します。Blebbistatinの使用には注意してください。阻害剤の沈殿を防ぐため、まず37 °Cに加温して透明になった培地にblebbistatinを溶解し、混合液を激しく攪拌してください。サンプルの光学マッピングを行うために、まず、振動する溶液によるモーションアーティファクトを低減させるため、組織上の溶液表面に小さなカバーガラスを固定します。次に、定電流・低ノイズのハロゲンランプから励起光を供給するフレキシブルな分岐型ライトガイドを用い、フィルターを通した光ビームを組織に照射し、得られた蛍光信号を画像化します。先ほど実演したように心臓にカニューレを挿入した後、前側から心室を切り離し、三尖弁上大静脈軸に沿って三尖弁から右心房を開き、続いてcrista terminalisの内側肢を切開します。心房前壁を開くには、内側肢切開の正中線から右心耳の右下端にかけて切開を行い、平坦化した心房壁をシリコンコーティングされたチャンバーの底にピンで固定します。左心耳を開くには、左心耳の僧帽弁上角に沿って僧帽弁を切断します。その後、右心房と同様に、開いた左心房をピンで固定します。次に、心室組織を部分的に除去します。心房への損傷を防ぐために、標本を固定するための心室組織の縁を一部残し、Sylgardコーティングされたチャンバーの底に組織をピンで固定します。その後、心外膜側と心内膜側の両面から灌流できるように、最終的な標本をシリコンコーティングされたチャンバーの底から約0.5ミリメートル持ち上げ、37度CelsiusのTyrode溶液でサンプルを灌流します。次に、特製の塩化銀ペーシング電極を、切開した右心耳の端に配置します。右心耳と左心耳のそれぞれの近くに12 mmの心電図単極電極を1本ずつ配置し、心房心室接合部の近くに心電図接地電極を配置します。心臓組織を染色するために、1 mmピペットを用いて、37 °Cのタイロド液で希釈した電位感受性色素を組織に直接ゆっくりと滴下します。次に、希釈したblebbistatinを組織に直接塗布してサンプルを固定し、続いて灌流液を介してさらに0.5 millilitersのblebbistatinを投与し、先ほど実演した通りにサンプルの光学マッピングを行います。組織染色とblebbistatinによる抑制のステップは極めて重要であり、心拍数、リードペースメーカーの配置、心房伝導を含む心房の生理学的パラメータに影響を与えないよう、正確な実施と精密な染色手順が求められます。ここでは、Langendorff灌流したマウス心臓の自発的な洞調律で再構成された典型的な右心房活動等電位線マップと、それぞれ1および0.5 millisecondのサンプリングレートで取得された対応する2つの右心房等電位線マップを示します。初期興奮点は、洞房結節が解剖学的に定義される上大静脈付近の静脈間領域に位置しています。本実験では、右心耳を10〜12 Hertzで少なくとも1分間ペーシングした後、電気刺激を停止し、最後の捕捉活動電位から最初の自発的活動電位までの時間間隔を洞房結節回復時間として算出しました。自発的な洞調律中の単離心房標本の興奮を確認することで、主ペーシング部位の正確な領域を特定することが可能となります。手術および色素負荷の手順が適切に行われれば、心房の生理学的特性に有意な変化は見られないはずです。動脈染色にはより多量の色素が必要となる場合がありますが、冠動脈染色による負荷法では洞房結節領域組織における蛍光信号がより安定しているようであり、信号強度の減衰時間は表面染色後と比較してほぼ2倍長くあります。この技術を習得し、適切に実施すれば、30～40分で完了させることができます。この手順を行う際は、心房組織や洞結節を損傷させないよう、切開前に心房の解剖学的構造を十分に確認してください。本手順の後、膜電位の可換特性に関するさらなる疑問を解消するために、従来のガラス電極を用いた僧帽弁記録などの他の手法を実施することが可能です。本手法の開発により、心電生理学分野の研究者が、心臓における洞房結節機能不全を含む心房不整脈を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、マウス洞結節標本の高解像度光マッピングの実施方法について十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

この記事では、電位差色素（ジ- 8 -...

ランゲンドルフ灌流ラット心臓の光学的マッピング

このレポートは、ストレッチ誘発性心房細動時のランゲンドルフ灌流羊の心臓の無傷の左心房の電気的興奮を同時に心内膜と心外膜の光学的マッピングの方法論と結果の詳細な説明を提供します。...

ストレッチ誘発性心房細動の羊のモデルで高解像度の心内膜と心外膜光学マッピング

この記事では、パノラマのイメージングシステムを用いてランゲンドルフ灌流ウサギの心臓、およびデュアル（電圧とカルシウム）画像診断法で光学マッピング実験を実施するための基本的な手順について説明します。...

ランゲンドルフ灌流ウサギの心臓のMultiparametric光学マッピング

そのまま孤立ランゲンドルフ灌流マウス心臓における本論文では詳細解剖の手順を、楽器のセットアップ、および実験条件膜電位の光学マッピング（VM）の間と細胞内カルシウムトランジェント（CAT）。...

マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング

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マウスモデルからの洞房結節分離:マウス心臓からSA結節を採取する手順

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高解像度光学マッピングとマウスの心房の電気生理学的評価

マウス心臓の洞房結節(SAN)と房室結節(AVN)のホールマウント免疫蛍光染色のための段階的なプロトコルを提供します。...

マウスの洞房結節と房室結節のホールマウント免疫蛍光染色、共焦点イメージング、3D再構成

このプロトコルは、マウスのペースメイキング欠陥を同定するために、サイノアノード組織全体のマイクロ電極アレイ記録を用いて、固有の心焼成率を測定する新しい方法論を記述することを目的とする。薬理学的薬剤は、本質的なペースメイキングに及ぼす影響を研究するために、この方法で導入することもできる。...

マウスにおける心内ペース作りの欠損を同定するための、中房ノードの発火率のマイクロ電極アレイ記録

我々は、組織形質転換と染色の新たな進歩と軸走査型ライトシート顕微鏡の開発を組み合わせることにより、マウス心臓全体のメゾスコピック再構成法を報告する。...

マウス心臓全体のメゾスコピック光学イメージング

このプロトコルは、高度なライトシート顕微鏡法と適応した組織透明化法を利用して、げっ歯類の心臓の複雑な心臓構造を調査し、心臓の形態形成とリモデリングの理解に大きな可能性を秘めています。...

げっ歯類の心臓の構造を明らかにするためのライトシートイメージング

学ぶマウス洞房結節の高分解能光学マッピング手法。Langendorff灌流心臓または分離心房標本を用いて、ペースメーカー異常や不整脈の機序を解明する電気生理学的手法です。

マウス洞房結節の高分解能光学マッピング

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