マウス洞房結節の高分解能光学マッピング

本実験プロトコルの目的は、無処置のLangendorff灌流心臓または単離心房標本を用いて、マウス洞房結節の光学マッピングを行うことです。この手法は、ペースメーカー機能の異常、洞不全症候群、および様々な疾患に関連する心房不整脈のメカニズムに関する、洞房結節の電気生理学および病態生理学分野における重要な疑問の解明に寄与します。本技術の主な利点は、極めて高い空間および時間分解能で、無処置の組織における複数のパラメータを調査できることです。

足指へのピンチ刺激により適切な麻酔レベルを確認した後、5.5インチの曲型メイヨー剪刀と5.5インチのケリー止血鉗子を用いて、胸部の前面に1 cmの切開を加えます。4インチの曲型アイリスピンセットを用いて肺組織を素早く把持し、4/3インチのアイリス剪刀で肺、胸腺、心臓を心膜とともに一括して切り出します。これらの組織を、酸素供給した37 °Cの修飾タイロッド液で洗浄します。

次に、曲がりのある3インチのVannas Tubingen鋏と4/3インチの5番ピンセットを用いて、心臓から肺、胸腺、および脂肪組織を除去します。続いて、特製の21ゲージカニューレと2本の曲がりのある4.3インチの5番Bピンセットを使用して大動脈にカニューレを挿入し、同時に37 °CのTyrode溶液で心臓を灌流および外液灌流します。その際、冠循環の閉塞を防ぐため、灌流前にインラインの11 µmナイロンフィルターに溶液を通します。その後、灌流ラインのルアーロックに三方活栓を介して圧力トランスデューサを接続して大動脈圧をモニタリングし、必要に応じて灌流速度を調整し、大動脈圧を60〜80 mmHgに維持します。

Langendorff灌流心臓を用いて洞房結節の光学マッピングを行うには、臓器をガラス製組織器官バスチャンバー内に、背面を上にした水平方向で配置します。実験中の流れによる動きを防ぐため、直径0.1 millimeterのピンを使用して心室尖端をチャンバーのシリコンコーティングされた底面に固定します。肺静脈、左心房、僧帽弁を経由して左心室に小さなシリコンチューブを挿入し、40絹縫合糸を用いてチューブを周囲の結合組織に固定します。次に、別の40絹縫合糸を用いて上大静脈と下大静脈を縛り、右心耳の端をチャンバーの底面にピンで固定します。

縫合糸のもう一方の端をチャンバーの底に伸ばして固定し、右心耳の縁にカスタムメイドのペーシング電極を配置します。次に、右心室と左心室の基部付近に12 mmの心電図単極針電極を2本配置し、心室尖付近に心電図接地電極を配置します。組織を染色するには、希釈した染料を冠動脈灌流ラインのインライン灌流ポートに注入し、5〜7分かけて投与します。

20分間の安定化後、37 °Cに加温したblebbistatinを0.5 mL灌流液に添加し、続いてblebbistatinを1 mLの37 °C Tyrode溶液で希釈したものを0.1 mL、インラインLuerロック注入ポートを用いて冠動脈灌流ラインにさらに5〜7分かけて注入します。Blebbistatinの使用には注意してください。阻害剤の沈殿を防ぐため、まず37 °Cに加温して透明になった培地にblebbistatinを溶解し、混合液を激しく攪拌してください。

サンプルの光学マッピングを行うために、まず、振動する溶液によるモーションアーティファクトを低減させるため、組織上の溶液表面に小さなカバーガラスを固定します。次に、定電流・低ノイズのハロゲンランプから励起光を供給するフレキシブルな分岐型ライトガイドを用い、フィルターを通した光ビームを組織に照射し、得られた蛍光信号を画像化します。先ほど実演したように心臓にカニューレを挿入した後、前側から心室を切り離し、三尖弁上大静脈軸に沿って三尖弁から右心房を開き、続いてcrista terminalisの内側肢を切開します。

心房前壁を開くには、内側肢切開の正中線から右心耳の右下端にかけて切開を行い、平坦化した心房壁をシリコンコーティングされたチャンバーの底にピンで固定します。左心耳を開くには、左心耳の僧帽弁上角に沿って僧帽弁を切断します。その後、右心房と同様に、開いた左心房をピンで固定します。

次に、心室組織を部分的に除去します。心房への損傷を防ぐために、標本を固定するための心室組織の縁を一部残し、Sylgardコーティングされたチャンバーの底に組織をピンで固定します。その後、心外膜側と心内膜側の両面から灌流できるように、最終的な標本をシリコンコーティングされたチャンバーの底から約0.5ミリメートル持ち上げ、37度CelsiusのTyrode溶液でサンプルを灌流します。

次に、特製の塩化銀ペーシング電極を、切開した右心耳の端に配置します。右心耳と左心耳のそれぞれの近くに12 mmの心電図単極電極を1本ずつ配置し、心房心室接合部の近くに心電図接地電極を配置します。心臓組織を染色するために、1 mmピペットを用いて、37 °Cのタイロド液で希釈した電位感受性色素を組織に直接ゆっくりと滴下します。

次に、希釈したblebbistatinを組織に直接塗布してサンプルを固定し、続いて灌流液を介してさらに0.5 millilitersのblebbistatinを投与し、先ほど実演した通りにサンプルの光学マッピングを行います。組織染色とblebbistatinによる抑制のステップは極めて重要であり、心拍数、リードペースメーカーの配置、心房伝導を含む心房の生理学的パラメータに影響を与えないよう、正確な実施と精密な染色手順が求められます。ここでは、Langendorff灌流したマウス心臓の自発的な洞調律で再構成された典型的な右心房活動等電位線マップと、それぞれ1および0.5 millisecondのサンプリングレートで取得された対応する2つの右心房等電位線マップを示します。

初期興奮点は、洞房結節が解剖学的に定義される上大静脈付近の静脈間領域に位置しています。本実験では、右心耳を10〜12 Hertzで少なくとも1分間ペーシングした後、電気刺激を停止し、最後の捕捉活動電位から最初の自発的活動電位までの時間間隔を洞房結節回復時間として算出しました。自発的な洞調律中の単離心房標本の興奮を確認することで、主ペーシング部位の正確な領域を特定することが可能となります。

手術および色素負荷の手順が適切に行われれば、心房の生理学的特性に有意な変化は見られないはずです。動脈染色にはより多量の色素が必要となる場合がありますが、冠動脈染色による負荷法では洞房結節領域組織における蛍光信号がより安定しているようであり、信号強度の減衰時間は表面染色後と比較してほぼ2倍長くあります。この技術を習得し、適切に実施すれば、30～40分で完了させることができます。

この手順を行う際は、心房組織や洞結節を損傷させないよう、切開前に心房の解剖学的構造を十分に確認してください。本手順の後、膜電位の可換特性に関するさらなる疑問を解消するために、従来のガラス電極を用いた僧帽弁記録などの他の手法を実施することが可能です。本手法の開発により、心電生理学分野の研究者が、心臓における洞房結節機能不全を含む心房不整脈を探索する道が開かれました。

このビデオを視聴することで、マウス洞結節標本の高解像度光マッピングの実施方法について十分に理解することができます。