干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）によってF-アクチンフィラメントの三次元超解像顕微鏡

この手順の全体的な目標は、iPALMと呼ばれる3次元超解像顕微鏡法を使用して、接着性哺乳類細胞のアクチン細胞骨格を超微細構造レベルで視覚化することです。これにより、蛍光プローブを使用して超微細構造を可視化することができ、高い標識特異性が可能になります。

このビデオで紹介する手順は、超解像顕微鏡に基づく単一分子の局在化により、細胞内の他の超微細構造の特徴を視覚化するために、迅速に適応でき、有益であるはずです。この手順は、6ウェルプレートのカバーガラス上に細胞を調製することから始めます。イメージングサンプルを組み立てるには、細い鉗子を使用して、試料カバーガラスをバッファーウェルから静かに取り外します。

次に、折りたたまれた吸収紙でカバーガラスの端に触れて、余分なバッファーをすばやく優しく軽くたたいます。カバーガラスのセル面を上にして、きれいなレンズペーパーの上に置きます。30〜50マイクロリットルのイメージングバッファーをサンプル上に置いて、サンプルをすすぎます。

折りたたんだ吸収紙で傾けたり、タッピングしたりして、余分なバッファーを取り除きます。すすぎステップを数回繰り返した後、30〜50マイクロリットルのイメージングバッファーをサンプル上に置きます。カバーガラスの端をブロット乾燥させ、乾燥した領域に速硬化エポキシの非常に小さなドットを複数置きます。

事前に洗浄された別の番号1.5のカバーガラスを、22mmのカバーガラスが入ったセルの中央にゆっくりと下ろします。イメージングバッファーを毛細管現象によって両方のカバーガラスを濡らします。速硬化エポキシの小さな点が両方のカバーガラスに付着する必要があります。

折りたたんだ吸収紙を使用して組み立てたサンプルをそっと押して、圧力を均等に広げます。サンプルセルを薄く均一にするために十分な圧力を使用しますが、セルを押しつぶすほどではありません。ニュートンのリングパターンを観察して、適切な厚さを測定します。

気泡を最小限に抑えるために、この手順は必ず穏やかに行ってください。必要に応じて、事前に空のカバーグラスで数回練習してください。次に、溶かしたワセリンラノリンパラフィンでサンプルを密封します。

次に、密封されたサンプルを脱イオン水ですすいでください。サンプルを圧縮空気でブロードライして、顕微鏡に取り付ける準備をします。バネ仕掛けの上部対物レンズを上に動かして、サンプルホルダーを取り外すことができます。

密封された試料をサンプルホルダーに置き、いくつかの小さな希土類磁石で固定します。イメージングサンプルの両面に浸漬油を塗布します。サンプルホルダーを光路に戻し、上部対物レンズをゆっくりと下げます。

励起レーザーをオンにします。また、フレーム転送モードでEMCCDカメラの電源を入れます。次に、適切な発光フィルターで回転させます。

メカニカルシャッターを作動させて、上部ビーム経路をブロックし、下部ビーム経路を開きます。ピエゾアクチュエータを使用して少しずつ平行移動することにより、下部の対物レンズに焦点を合わせます。フィデューシャルにピントが合ったら、下部のビーム経路を遮りながら上部のビーム経路を開き、同様の方法で上部の対物レンズにピントを合わせます。

コンピューターのディスプレイで基準の幅を監視して、最適な焦点を合わせます。適切なセントレーションを行うには、上部と下部の両方のビームパスを開きます。上対物レンズを手動で調整し、下対物レンズを一対のマイクロファイン止めネジを使用して一定に保ち、基準画像ができるだけ近く、理想的には1ピクセル以内に重なるようにします。

その後、フィデューシャルイメージがEMCCDピクセルの10分の1以内に重なるように微調整を行います。制御ソフトウェアを使用して、上部2軸ピエゾマウントミラーを調整し、対物レンズと下部反射ミラーの両方を一定に保ちます。コンピュータディスプレイを介して上部と下部の対物レンズビューの基準の中心を比較し、プロセスをガイドします。

レーザーがオンになると、カメラが連続的にストリーミングされ、上部と下部の両方のビームパスが開くと、制御ソフトウェアによって生成された正弦波電圧波形を使用してサンプルホルダーZピエゾが発振され、400ナノメートルの範囲で連続的なZ軸振動が行われます。電動ビームスプリッターアセンブリを、基準の強度が振動するまで手動で上下に並進します。望ましい単一光子干渉効果により、これは光路長が密接に一致することを意味します。

最適なケースでは、ピークとバレーの比率を 10 以上にすることができます。各表面の振幅と位相の両方がフィールド全体で可能な限り均一になるようにするには、ビームスプリッターアセンブリの下部ミラーを小さなステップで調整して、ギャップと傾斜角を微調整します。サンプルを800ナノメートル以上8ナノメートルのZステップで並進することにより、ビームスプリッターのファインアライメントを実行します。

カメラ 1 から 3 までの基準強度を監視します。ビーム スプリッター アセンブリ内のボトム ミラーの高さ、位置、および傾きを小さなステップで調整し、カメラ 1 のカメラ 2 に対する振動位相が最大化 (理想的には 120 度) になるようにします。初期アライメントが完了したら、サンプルを平行移動して、画像化する細胞と近くの複数の指標の両方を含む適切な視野をスキャンします。

システムの周囲にエンクロージャを配置して、迷光や周囲の摂動を遮断します。イメージング領域が見つかったら、サンプルを再度平行移動し、その後のZ座標抽出で使用するために検量線を記録します。コマンドを使用して、メインインターフェースでキャリブレーションスキャンとサンプルピエゾ位置を取得します。

目的の領域が見つかり、検量線が得られたら、ソフトウェアに適切なファイル名を入力します。上部と下部の両方のビームパスを開き、642ナノメートルレーザーの励起出力を最大まで増やします。Alexa Fluor 647の場合、Fluor-4のスイッチオフの初期期間が必要になる場合があります。

642ナノメートルの一定の励起で5分間、または必要に応じてそれ以上、1分子の点滅が観察されるまで露光します。このソフトウェアでは、取得の過程で405ナノメートルの光活性化を自動的に増加させることができます。通常、糸状の特徴をはっきりと見えるようにするには、多数の取得フレームが必要です。

準備ができたら、メインインターフェイスのstart iPALM acquisitionコマンドを使用して、RAW画像セットの取得を開始します。取得中は、必要に応じて適切な点滅密度を維持するために、405ナノメートルレーザーの強度を調整して光の活性化レベルを調整します。サンプルカバースリップが適切に組み立てられると、ニュートンのリングは、周囲光または標準的な蛍光灯の下で肉眼で観察できます。

蛍光エミッターの軸方向位置の抽出には、iPALMイメージングにおける同時多相干渉が必要であり、これは3つのEMCCDの特定の基準の強度変化によって較正されます。次に、強度を正規化して適合させ、位相差を決定します。これは、各ローカリゼーション座標が 2D ガウスによってレンダリングされた再構成 iPALM イメージで、ローカリゼーションの不確かさに対応する幅で

Z 座標は、カラー バーに従って色付けされます。密集した糸状の特徴とまばらな糸状の特徴の領域が見られます。ここに示されているのは、Alexa Fluor 647ファロイジンで標識されたHUVEC細胞のアクチン細胞骨格の再構築iPALM画像です。

画像の色は、カラーバーに従ってZ座標を示しています。横断断面ヒストグラムは、ボックス化された領域の長軸に沿ったXYローカリゼーション座標から生成されます。ガウス近似は、横断面積に関連付けられた半値43.88ナノメートルの全幅を示します。

このヒストグラムは、ボックス領域内のローカリゼーション座標の Z 位置を示しています。ガウス近似は、半値17.50ナノメートルの全幅を示します。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば90分で完了します。

このビデオを見た後、簡単な準備とマウント、光学アライメント、生データの取得、および超解像画像の再構築のためのその後の解析を通じて、iPALMを使用して超微細構造のアクチン細胞骨格を視覚化する方法を理解できるはずです。その開発後、この技術は、アクチン細胞骨格のナノスケール構造や、焦点接着などの細胞接着構造を探求するための細胞生物学分野の研究への道を開きました。