Name: 干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）によってF-アクチンフィラメントの三次元超解像顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 学ぼう、iPALMを用いて接着性哺乳類細胞のF-アクチン細胞骨格を三次元超解像で可視化する方法。ナノメートル級の空間分解能で細胞超微細構造を詳細に観察し、細胞生物学研究に応用する技術です。

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YWとPKは感謝PK（NRF-NRFF-2011-04とNRF2012NRF-CRP001-084）に授与シンガポール国立研究財団から資金援助を認めます。また、インフラストラクチャのサポートのためのMBIオープンラボと顕微鏡の中核施設に感謝します。

<ol><li>Kanchanawong, P., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization-based+super-resolution+imaging+of+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization-based super-resolution imaging of cellular structures.</a> Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).</li>
<li>Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+by+super+resolution+fluorescence+microscopy+and+its+emerging+applications+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research.</a> Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).</li>
<li>Kanchanawong, P., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+light-based+imaging+of+three-dimensional+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure.</a> Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).</li>
<li>Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wide-field+subdiffraction+imaging+by+accumulated+binding+of+diffusing+probes%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes.</a> P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).</li>
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<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super+resolution+imaging+of+chemical+synapses+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Super resolution imaging of chemical synapses in the brain.</a> Neuron. 68, 843-856 (2010).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Talin+determines+the+nanoscale+architecture+of+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions.</a> P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).</li>
<li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nature. 468, 580-584 (2010).</li>
<li>Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-delimited+adhesion-independent+clustering+of+e-cadherin+forms+the+nanoscale+building+blocks+of+adherens+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions.</a> Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).</li>
<li>Szymborska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Pore+Scaffold+Structure+Analyzed+by+Super-Resolution+Microscopy+and+Particle+Averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging.</a> Science. 341, 655-658 (2013).</li>
<li>Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+imaging+of+centrosomes+reveals+higher-order+organizational+features+of+pericentriolar+material%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material.</a> Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).</li>
<li>Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amorphous+no+more%3A+subdiffraction+view+of+the+pericentriolar+material+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture.</a> Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).</li>
<li>Mennella, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+microscopy+reveals+a+domain+of+the+centrosome+critical+for+pericentriolar+material+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization.</a> Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).</li>
<li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-492 (2010).</li>
<li>Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cortex+mechanics+and+cellular+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis.</a> Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+ultrastructure+by+PALM%2C+iPALM%2C+and+correlative+iPALM-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM.</a> Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).</li>
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<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).</li>
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<li>Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnanometre+single-molecule+localization%2C+registration+and+distance+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements.</a> Nature. 466, 647-651 (2010).</li>
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<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346, (2014).</li>
<li>Brown, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super+resolution+fluorescence+imaging+of+mitochondrial+nucleoids+reveals+their+spatial+range%2C+limits%2C+and+membrane+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction.</a> Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).</li>
<li>Huang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-rate+nanoscopy+using+sCMOS+camera-specific+single-molecule+localization+algorithms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms.</a> Nat Methods. 10, 653-658 (2013).</li>
<li>Daostorm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAOSTORM%3A+an+algorithm+for+high-density+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy.</a> Nat methods. 8, 279(2011).</li>
<li>Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+STORM+using+compressed+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Faster STORM using compressed sensing.</a> Nat Methods. 9, 721-723 (2012).</li>
<li>Van Engelenburg, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+ESCRT+machinery+at+HIV+assembly+sites+reveals+virus+scaffolding+of+ESCRT+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits.</a> Science. 343, 653-656 (2014).</li>
<li>Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabright+photoactivatable+fluorophores+created+by+reductive+caging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging.</a> Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

図1（a）に示すようiPALMの光学系は、4-πデュアル対向対物レンズの設計に基づいています。 表 1に先に23を説明し、記載されている設定は、カスタム機械加工や商業の両方の光学機械部品を用いて構成されています。私たちのセットアップに加えて、ハワード・ヒューズ医学研究所（HHMI）がJaneliaリサーチキャンパスでの高度なイメージングセンターでの科学界にアクセス可能なシステムをホストします。完全な機械図面、制御回路図、およびソフトウェアについては、読者は詳細についてHHMIでハラルドヘスにお問い合わせすることをお勧めします。 F-アクチンを可視化するためiPALMだけでなく、他の単一分子の局在顕微鏡法を使用する主な利点は、EM一般過酷なサンプル処理を必要とする技術は、面倒な準備、および高度に熟練した開業医3,23に比べて試料調製が比較的容易です。 Additionallyは、蛍光はEMのための困難なままでマルチチャンネルイメージング、に自然に適しています。さらに以下に記載されるように、それ...

複雑な細胞構造の可視化は、長い生物学的洞察と発見に不可欠となっています。蛍光顕微鏡は、高分子特異性を有する画像セルは、その分解能は〜像面（X、Y、または横寸法）で200 nmの光軸（Z、または軸方向の寸法）に沿って、&gt; 500nmの回折によって制限されることができるが1,2。したがって、超微細な特徴の観察は、歴史的に、電子顕微鏡（EM）に限られていました。 100 nmの範囲1-6 -幸いなことに、超解像顕微鏡の最近の開発は、10の空間分解能を可能にする、この制限を回避しています。具体的には、超解像は、このようなPALM（光活性化ローカライゼーション顕微鏡）4、FPALM（蛍光光活性化ローカライゼーション顕微鏡）5（d）にSTORM（直接確率的光学再構築顕微鏡）などの頭字語によって知られている単一分子の局在化に基づくアプローチ6,7、PAINT（ポー川int型イメージングナノスケールの地形のための蓄積）8、GSDIM（基底状態枯渇顕微鏡は、個々の分子のリターンが続く）9、またはSMACM（単一分子アクティブ制御顕微鏡）10、ならびに、それらの3次元（3D）の実装、干渉PALM（iPALM）11または3D-STORM 12、神経細胞の軸索とシナプス13を含む多数の生物学的構造のナノスケールの組織に新たな洞察を明らかに貴重なされている、接着斑14,15、細胞間結合16、核膜孔17 、および中心体18-20は 、いくつかの名前を付けます。 超解像顕微鏡は、潜在的に有用であるために、細胞内の別の超微細構造の特徴は、アクチン細胞骨格です。細胞表層における糸状（F）アクチンの複雑な網目構造は、細胞の形状及び機械的特性21の制御において重要な役割を果たしています。組織OF F-アクチンは、積極的かつ動的に強く重合、架橋、売上高、安定性、およびネットワークトポロジー22に影響を与える多数の調節タンパク質も規制されています。 F-アクチン網目構造のキャラクタリゼーションは、細胞プロセスの多様な範囲に機械的な洞察のために重要であるものの、F-アクチンフィラメントの小さいサイズ（〜8 nm）は、従来の回折限界光学顕微鏡によって自分の観察を妨げます。従って、アクチン微細構造の可視化は、これまでもっぱらEMによって実行されています。ここでは、3D 11,23における非常に高精度の能力を活用するiPALM超分解能顕微鏡技術を用いて、接着性哺乳動物細胞におけるF-アクチン細胞骨格を可視化するためのプロトコルを説明します。 iPALM機器は専門性の高いですがiPALM顕微鏡へのアクセスはホーによってホストされている一方で、このような機器の設定に関する指示は、23最近記載されています病棟・ヒューズ医学研究所はまた、最小限のコストとの研究コミュニティに利用可能とされています。さらに、本明細書に記載の試料調製方法は、より広範に利用可能であるような点広がり関数（PSF）の非点収差のデフォーカスに基づくものなどの代替的な3D超解像手法、12又はバイプレーン検出24、に直接適用可能です。 私たちは、一般的には単一分子の局在化ベースの超解像顕微鏡のために必要な成分が満たされなければ、単一分子の局在化ベースの超解像顕微鏡のための3つの重要な要件を可能にするphotoswitchableフォア25、であることに注意した：i）高単一分子背景信号の明るさとコントラストの相対。 ⅱ）所与の画像フレーム内の単一分子のまばらな分布。また、ナイキスト・沙として知られている根本的な構造（のプロファイルをキャプチャするのに十分な標識及びiii）高い空間密度nnonサンプリング基準）26。このように、満足のいく結果を得るために、重点はフルオロフォアphotoswitchingを最適化するために、基礎となる超微細構造を維持するための試験片の適切な準備の両方で、同様の実験の計測および買収側面に均等に配置する必要があります。

<table><tbody><tr><td>光学テーブル</td><td>ニューポート、CA</td><td>RS4000</td><td>iPALM、4 ニューポートに設置 スタビライザー振動アイソレーター</td></tr><tr><td>光学テーブル</td><td>ニューポート、CA</td><td>S-2000</td><td></td></tr><tr><td>レーザー-642</td><td>ニューポート、CA</td><td>1185055</td><td>出力電力=100 mw</td></tr><tr><td>レーザー-561</td><td>ニューポート、CA</td><td>1168931</td><td>出力電力=200 mw</td></tr><tr><td>レーザー-488</td><td>ニューポート、CA</td><td>1137970</td><td>出力電力=200 mw</td></tr><tr><td>レーザー-405</td><td>カリフォルニア州ニューポート</td><td>1142279</td><td>出力電力=100 mw</td></tr><tr><td>広帯域誘電体ミラー</td><td>ニュージャージー州 Thorlabs, ニュージャージー</td>州 <td>BB1-E02</td><td>レーザーコンバイナー</td></tr><tr><td>ダイクロイック ビームスプリッター</td><td>Semrock, NY</td><td>LM01-427-25</td><td></td></tr><tr><td>音響光学チューナブルフィルター</td><td>AA Opto-Electronic, フランス</td><td>AOTFnC-VIS-TN</td><td></td></tr><tr><td>リニア偏光子</td><td>ニューポート、CA</td><td>05LP-VIS-B</td><td></td></tr><tr><td>ベースプレート</td><td>ローカルワークショップ</td><td>カスタマイズ</td><td></td></tr><tr><td>ターニングミラー(22.5°C)</td><td>レイナードコーポレーション、カリフォルニア州</td><td>は</td><td>22.5&degをカスタマイズし、ミラー</td></tr><tr><td>電動光学マウントニュー</td><td>フォーカス、CA</td><td>8816</td><td></td></tr><tr><td>電動XYZ翻訳ステージ</td><td>Thorlabs、ニュージャージー</td><td>州MT3 / M-Z6</td><td>サンプル</td></tr><tr><td>ホルダーT-Cube DCサーボモーター</td><td>コントローラーThorlabs、ニュージャージー</td><td>州TDC001</td><td></td></tr><tr><td>ピエゾフェーズシフ</td><td>ターPhysik Instrumente、ドイツ</td><td>S-303.CD</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>ニコン、日本</td><td>MRD01691</td><td>対物レンズ。Apo TIRF 60X / 1.49オイル</td></tr><tr><td>翻訳ステージ</td><td>ニューフォーカス、CA</td><td>9062-COM-M</td><td></td></tr><tr><td>ピコモーターアクチュエータ</td><td>ーニューフォーカス、CA</td><td>8301</td><td></td></tr><tr><td>ロータリーソレノイド/</td><td>シャッターDACO機器、CT</td><td>5423-458</td><td></td></tr><tr><td>3ウェイビームスプリッター</td><td>ロッキーマウンテンインスツルメンツ、CO</td><td>カスタマイズ</td><td>ビームスプリッター</td></tr><tr><td>ピエゾZ /チップ/チルト</td><td>スキャナーPhysik Instrumente、ドイツ</td><td>S-316.10</td><td></td></tr><tr><td>電動5軸チルトアライナー</td><td>ニューフォーカス、CA</td><td>8081</td><td></td></tr><tr><td>Picmotorイーサネットコントローラー</td><td>ニューフォーカス、CA</td><td>8752</td><td></td></tr><tr><td>ピエゾコントローラー/アンプ/デジタル操作モジュール</td><td>Physik Instrumente、ドイツ</td><td>E-509 / E-503 / E-517</td><td></td></tr><tr><td>バンドパス</td><td>フィルターSemrock、NY</td><td>FF01-523 / 20</td><td>フィルター</td></tr><tr><td>バンドパスフィルター</td><td>Semrock, NY</td><td>FF01-588/21</td><td></td></tr><tr><td>バンドパスフィルター</td><td>Semrock, NY</td><td>FF01-607/30</td><td></td></tr><tr><td>バンドパスフィルター</td><td>Semrock, NY</td><td>FF01-676/37</td><td></td></tr><tr><td>ノッチフィルター</td><td>Semrock, NY</td><td>NF01-405/488/561/635</td><td></td></tr><tr><td>電動フィルターホイール コントローラー付き</td><td>Thorlabs,</td><td>NJ FW103H</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Andor, UK</td><td>DU-897U-CSO-#BV</td><td>カメラ</td></tr><tr><td>を制御し、同期するためのデスクトップコンピュータ</td><td>3 セット Dell</td><td>Precision T3500</td><td>PC、</td></tr><tr>フィデューシャル <td>ヘッツィヒ</td><td>付きカバースリップ</td> 4 セット、VA <td>600-100AuF</td><td>サンプル調製。 さまざまな密度とスペクトルのフィデューシャルマークが利用可能</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>ミリポア、MT</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>エレクトロン16</td><td></td><td>%</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>電子顕微鏡科学、PA</td><td>16220</td><td>25%</td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ アルドリッチ、MO</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC cells</td><td>Life Technologies, CA</td><td>C-015-10C</td><td></td></tr><tr><td>Medium 200</td><td>Life Technologies, CA</td><td>M-200-500</td><td></td></tr><tr><td>Large Vessel Endothelial Factors.</td><td>Life Technologies, CA</td><td>A14608-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td></td><td>14190367</td><td></td></tr><tr><td>Pennicillin/Streptomycin</td><td></td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Life Technologies, CA</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>P1851</td><td>PHEM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>1st base, Malaysia</td><td>BIO-1825</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>E3889</td> MgCl<<td></td></tr><tr><td>sub>2</td><td>Millipore, MT</td><td>5985</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Invitrogen, CA</td><td>A22287</td><td>水素</td></tr><tr><td>化ホウ素ナトリウム (NaBH4)</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>480886</td><td>quenching</td></tr><tr><td>glucose</td><td>1st base, Malaysia</td><td>BIO-1101</td><td>イメージングバッファー</td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ</td><td>Sigma aldrich、MO</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>Sigma aldrich、MO</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>システアミン</td><td>Σaldrich、MO</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>エポキシ</td><td>Thorlabs、ニュージャージー</td><td>州G14250</td><td></td></tr><tr><td>ワセリン</td><td>Sigma aldrich、MO</td><td>16415</td><td>サンプルシーリング</td></tr><tr><td>ラノリン</td><td>Sigma aldrich、MO</td><td>L7387</td><td></td></tr><tr><td>パラフィンワックス</td><td>シグマaldrich、ミズーリ</td><td>州327204</td><td></td></tr><tr><td>液浸油</td><td>電子顕微鏡科学、PA</td><td>16915-04</td><td>イメージング。カーギル タイプHF</td></tr></tbody></table>

干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（ipalm）によってf-アクチンフィラメントの三次元超解像顕微鏡

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

蛍光顕微鏡は、細胞内の特定の生体分子の直接可視化を可能にします。しかし、従来の蛍光顕微鏡法のために、空間分解能は、光軸に沿って像面、&gt; 500nmの範囲内〜200nmの回折により制限されています。結果として、蛍光顕微鏡法は、長い細胞内の超微細構造の特徴の観察に厳しく制限されています。超解像顕微鏡法の最近の開発は、この制限を克服しました。特に、photoswitchable蛍光体の出現は、分子長さスケールに近づいて解像力を提供ローカリゼーションベースの超解像顕微鏡を、可能にします。ここでは、干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）と呼ばれる単一分子の局在顕微鏡法および多相干渉に基づいて3次元超解像顕微鏡法の適用を説明します。この方法は、上のほぼ等方性の解像度を提供しますすべての3つの次元で20nmのオーダー。 iPALM機器の試料調製及び動作を含む、繊維状アクチン細胞骨格を可視化するためのプロトコルは、ここに記載されています。これらのプロトコルはまた、細胞内の他の超微細構造の特徴の研究に容易に適合し、有益です。

iPALMのための重要な要件は、光学系のアライメント、登録、およびキャリブレーションされています。これらは、z座標の抽出に3ウェイビームスプリッタ必要内の適切な干渉を確実にするために必要です。継続的な監視を有効にするには、蛍光の一定の点光源が必要です。これは、蛍光のAu又はそのフォトルミネッセンス局在表面プラズモン共鳴（LSPR）から生じる二金属ナノ粒子23を用いて達成することができます。彼らは、照明の際に安定した単一双極子として作用し、一般的に5でローカライズすることができます - 10 nmの精度。これらの市販のナノ粒子は、フルオロフォアと基準点の両方が飽和状態（ 図1B）ことなく、EMCCDカメラに類似の励起強度とゲイン設定で撮像することができるように、大部分の単一分子の蛍光体の範囲内で明るさのレベルを放射します。さらに、これらの基準点も大幅FAC基準点の見かけの幅は、フォーカス調整中にモニターすることができる、集束ilitate。前述のように汚れた又は不十分な洗浄カバーガラスの偽バックグラウンド蛍光が容易...

私たちは、接着性、哺乳動物細胞におけるアクチン細胞骨格のイメージングに、干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）、3次元の単一分子の局在超解像顕微鏡法の適用のためのプロトコルを提示します。このアプローチは、そうでなければ、従来の回折限界光学顕微鏡で未解決のままであるナノスケールの構造的特徴の光ベースの可視化を可能にします。

干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）によってF-アクチンフィラメントの三次元超解像顕微鏡

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

この手順の全体的な目的は、iPALMと呼ばれる3次元超解像顕微鏡法を用いて、接着性哺乳類細胞におけるアクチン細胞骨格を超微細構造レベルで可視化することです。iPALMイメージングは、3次元すべてにおいて数ナノメートル以下の空間分解能を提供します。これにより、蛍光プローブを用いて超微細構造を可視化することが可能となり、高い標識特異性を実現できます。このビデオで紹介する手順は、超解像顕微鏡に基づいた単一分子局在化法を用いて、細胞内の他の超微細構造を可視化する場合にも迅速に適応でき、有益な指針となるはずです。まず、6ウェルプレート内のカバーガラス上で細胞を調製することから開始します。イメージングサンプルを組み立てる際は、精密ピンセットを使用して、バッファーウェルから標本カバーガラスを慎重に取り出してください。次に、折りたたんだ吸収性の高い紙をカバーガラスの端に触れさせ、余分なバッファーを素早く、かつ優しく吸い取ります。カバーガラスのセル側を上にして、清潔なレンズペーパーの上に置きます。30〜50マイクロリットルのイメージングバッファーをサンプルに滴下し、サンプルを洗浄します。折った吸収紙で傾けながら叩き、余分なバッファーを除去します。洗浄工程を数回繰り返した後、イメージングバッファーを30～50 µL、サンプルに滴下します。カバーガラスの端を吸い取って乾燥させ、乾燥した領域に速硬化エポキシをごく少量ずつ数箇所に点状に塗布します。あらかじめ洗浄した別のNo.1.5カバーガラスを、22 mmカバーガラスが入ったセルの中心にゆっくりと下ろします。毛細管現象によってイメージングバッファーが両方のカバーガラスを濡らすようにしてください。速乾性エポキシの小さな点が両方のカバーガラスに接着します。折りたたんだ吸水紙を用いて、組み立てたサンプルを優しく押し、圧力を均等に分散させます。サンプルセルが薄く均一になるまで十分な圧力をかけますが、細胞を潰さないように注意してください。ニュートンリングのパターンを観察して、適切な厚さを判断します。気泡を最小限に抑えるため、この操作は慎重に行ってください。必要に応じて、事前にカバーガラスのみを用いて数回練習してください。次に、溶かしたワセリン・ラノリン・パラフィンでサンプルを密封します。次に、密封したサンプルを脱イオン水で洗浄します。圧縮空気でサンプルをエアドライし、顕微鏡への搭載準備を整えます。サンプルホルダーを取り外せるように、バネ式の対物レンズ上部を上方に移動させます。封印した標本をサンプルホルダーに配置し、数個の小型ネオジム磁石で固定します。イメージングサンプルの両側に浸漬油を塗布します。サンプルホルダーを光路に戻し、上部の対物レンズをゆっくりと下げます。励起レーザーをオンにします。また、EMCCDカメラをフレーム転送モードでオンにします。次に、適切なエミッションフィルターを回転させて挿入します。メカニカルシャッターを作動させて上部のビームパスを遮断し、下部のビームパスを開きます。ピエゾアクチュエータを用いて、下部の対物レンズを少量ずつ移動させ、焦点を合わせます。フィデューシャルに焦点が合ったら、下部のビームパスを遮断して上部のビームパスを開き、同様の手順で上部の対物レンズの焦点を合わせます。最適なフォーカスを得るために、コンピュータ画面上でフィデューシャルの幅をモニターします。適切に中心合わせを行うには、上部と下部の両方のビームパスを開きます。下部対物レンズを一対の微細調整ネジで固定したまま、上部対物レンズを手動で調整し、フィデューシャルの像が可能な限り密接に、理想的には1ピクセル以内に重なるようにします。続いて、基準点画像がEMCCDピクセルの10分の1以内に重なるように微調整を行います。両方の対物レンズと下部の反射ミラーを固定したまま、制御ソフトウェアを用いて上部の2軸ピエゾ搭載ミラーを調整してください。コンピュータ画面で上部および下部の対物レンズ視点における基準点の中央位置を比較し、調整の指標としてください。レーザーをオンにし、カメラによるストリーミングを継続させ、上下両方のビームパスを開いた状態で、制御ソフトウェアによって生成された正弦波電圧波形を用いてサンプルホルダーのZピエゾを振動させ、Z軸方向に400 nanometersの振幅で連続的に振動させます。フィデューシャルの強度が振動するまで、電動ビームスプリッターアセンブリを手動で上下に移動させます。目的とする単一光子干渉効果により、これは光路長が密接に一致したことを意味します。最適条件下では、10を超えるピーク対バレー比を達成することが可能です。各表面における振幅と位相が視野全体で可能な限り均一になるように、ビームスプリッターアセンブリの下部ミラーを少量ずつ調整し、ギャップと傾斜角を微調整します。サンプルを8 nmのZステップで800 nmにわたって移動させ、ビームスプリッターの精密アライメントを行います。カメラ1から3におけるフィデューシャルの強度をモニターします。ビームスプリッターアセンブリ内のボトムミラーの高さ、位置、および傾きを微調整し、カメラ2に対するカメラ1の振動位相が最大（理想的には120度）になるようにします。初期アライメントが完了したら、サンプルを移動させて、イメージング対象の細胞2つと、その付近に複数のフィデューシャルが含まれる適切な視野をスキャンして探します。迷光や周囲の乱れを遮断するため、システムの周囲にエンクロージャーを設置します。撮像領域が特定されたら、サンプルを再度移動させ、その後のZ座標抽出に使用するための校正曲線を記録します。メインインターフェースの「acquire calibration scans versus sample piezo position」コマンドを使用してください。目的の領域が見つかり、検量線が得られたら、適切なファイル名をソフトウェアに入力します。トップビームパスとボトムビームパスの両方を開き、642 nanometerレーザーの励起強度を最大まで上げます。Alexa Fluor 647の場合、初期段階でFluor-4のスイッチオフが必要になることがあります。単一分子のブリンキング（明滅）が観察されるまで、642 nmの一定の励起光を5分間、または必要に応じてさらに長く照射します。ソフトウェアにより、データ取得中に405 nmの光活性化を自動的に増加させることが可能です。繊維状の構造を明確に可視化するには、通常、大量の取得フレーム数が必要となります。準備が整ったら、メインインターフェースの start iPALM acquisition コマンドを使用して、RAW画像セットの取得を開始します。取得中は、必要に応じて 405 nanometer レーザーの強度を調整し、適切なブリンキング密度を維持するように光活性化レベルを調整してください。サンプルカバーガラスが適切に組み立てられていれば、環境光または標準的な蛍光灯の下で、ニュートンリングを目視で確認することができます。iPALMイメージングにおいて蛍光放出体の軸方向位置を抽出するには、同時多位相干渉が必要です。これは、3台のEMCCDにおける特定のフィデューシャルの強度変化によって校正されます。その後、強度が正規化され、フィッティングを行うことで位相差が決定されます。以下は、再構成されたiPALM画像であり、各局在化座標は局在化不確かさに対応する幅を持つ2Dガウス関数で描画されています。Z座標はカラーバーに従って色分けされています。フィラメント状構造の密な領域と疎な領域が確認できます。ここでは、Alexa Fluor 647 phalloidinでラベル付けしたHUVEC細胞のアクチン細胞骨格の再構成iPALM画像を示しています。画像の色は、カラーバーに従ってZ座標を示しています。横断方向の断面ヒストグラムは、枠で囲まれた領域の長軸に沿ったXY局在化座標から作成されています。ガウスフィッティングにより、横断方向の断面に関連する半値全幅が43.88 nanometersであることが示されています。このヒストグラムは、枠で囲まれた領域における局在化座標のZ位置を示しています。ガウスフィッティングの結果、半値全幅は17.50 nanometersであることがわかります。この手法に習熟し、適切に実施すれば、90分で完了させることができます。このビデオを視聴することで、シンプルな試料調製とマウント、光学的アライメント、生データの取得、そして超解像画像を再構成するための後続解析を経て、iPALMを用いてアクチン細胞骨格を超微細構造レベルで可視化する方法について理解できるはずです。この技術の開発により、細胞生物学分野の研究において、アクチン細胞骨格のナノスケール構造や、焦点接着などの細胞接着構造を探索する道が開かれました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、細菌のFtsZ-リングの構造、組織、細胞分裂に不可欠な装置を検査する、超解像イメージング法を説明します。この方法は、光活​​性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）画像の定量分析に基づいており、他の細菌の細胞骨格タンパク質に適用することができます。...

細菌分裂機械の超解像イメージング

私たちは、細胞内の複数の種類の蛍光標識分子を同時にイメージングするための蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM)の使用を実証します。記載されている技術は、単一細胞内で数十ナノメートルの精度で、数千から数十万の個々の蛍光標識タンパク質の局在をもたらします。...

蛍光光活性化局在顕微鏡による生体構造の同時マルチカラーイメージング

生細胞内の動的タンパク質に関する時空間的な情報は、生物学を理解するために非常に重要です。高速3D構造化照明顕微鏡(f3D-SIM)と呼ばれる超解像顕微鏡の一種は、細菌の細胞動態Zリングに関するユニークな情報、つまりそのビーズ状の外観とリング内のFtsZの急速なダイナミクスの両方を明らかにします。...

高速3D-構造化照明顕微鏡（F3D-SIM）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のZリングの超解像イメージング

タンパク質間相互作用は、二分子蛍光相補(BiFC)と光活性化局在顕微鏡(PALM)を組み合わせることにより、ナノメートルの空間分解能で細胞内で可視化されます。ここでは、個々のRas-Raf複合体のナノスケールクラスタリングと拡散を視覚化するためのU2OS細胞内のRas-Raf相互作用をイメージングするためのBiFC-PALMの使用について説明します。...

二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM）

PI（4,5）P 2は、様々な細胞機能を調節するが、細胞の原形質膜でのナノスケール組織はあまり理解されています。標識PI（4,5）プレクストリン相同ドメインに融合された二重色蛍光プローブとP 2によって、我々はナノメートルスケールでの原形質膜中のP 2空間分布（4,5）PIを研究するための新規な方法を記載します。...

新規蛍光プローブと形質膜におけるホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸の単分子超解像イメージング

この方法論の全体的な目標は、固定細胞における微小管、中間径フィラメントの 2D デュアル カラー dSTORM...

中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

適切なサルコメアネットワークの形成は、iPSC由来心筋細胞の成熟にとって重要である。我々は、心臓の発達を促進する培養条件を改善するために、幹細胞由来心筋細胞の構造成熟の定量的評価を可能にする超解像ベースのアプローチを提示する。...

一分子局在顕微鏡を用いたヒトiPSC由来心筋細胞におけるαアクチニンネットワークの解析

本プロトコールは、培養ラット海馬ニューロンおよび3D構造化照明顕微鏡(3D−SIM)を用いて軸索初期セグメントの膜周期骨格のアクチン環および他の成分を視覚化および測定する方法を記載する。...

3D構造化照明顕微鏡(3D-SIM)を用いた軸索初期セグメントの膜周期骨格の特性の測定

我々は、動的微小管および蛍光標識微小管関連タンパク質の同時イメージングのための干渉反射顕微鏡および全内部反射蛍光顕微鏡を実施するためのプロトコルを提示する。...

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

このプロトコルは、光学光子再割り当てを備えた回転円盤共焦点顕微鏡を用いて深部全細胞単分子局在顕微鏡(SMLM)を行う手順を示しており、カスタム光学や複雑な照明を必要とせずにDNA-PAINTイメージングを可能にします。...

光学光子再割り当て を用いた回転円 板共焦点によるDNA-PAINTによる全セル超分解能イメージング

学ぼう、iPALMを用いて接着性哺乳類細胞のF-アクチン細胞骨格を三次元超解像で可視化する方法。ナノメートル級の空間分解能で細胞超微細構造を詳細に観察し、細胞生物学研究に応用する技術です。

干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）によってF-アクチンフィラメントの三次元超解像顕微鏡

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