Name: 調製とインビトロ磁気共鳴イメージングのためのデンドリマーベースの造影剤のキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 学ぶデンドリマー系MRI造影剤の調製と特性評価法。シクレン系マクロサイクリックキレートを用いてガドリニウムイオンを配位し、インビトロで増幅されたMRI信号を検証する手法を解説します。

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マックスプランク協会、トルコ国民教育省(S.G.への博士フェローシップ)、およびドイツ交換学術サービス(DAAD、T.S.への博士フェローシップ)の財政的支援に感謝しています。

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<li>Livramento, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+in+vivo+MRI+assessment+of+a+self-assembled+metallostar+compound+endowed+with+a+remarkable+high+field+relaxivity%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">First in vivo MRI assessment of a self-assembled metallostar compound endowed with a remarkable high field relaxivity.</a> Contrast Media Mol. Imaging. 1 (1), 30-39 (2006).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

デンドリマーのMRI造影剤の調製は、モノマー単位の適切な選択を必要とする（ すなわち、Gdのためのキレート剤（III））。彼らは、この常磁性イオンの毒性を低減し、これまでに、非環式の多種多様な大環状キレート剤は、この目的の1-3を果たします。これらの中で、大環状DOTA型キレート剤は、最も高い熱力学的安定性及び速度論的不活性を有し、従って、不活性なMRI造影剤1,18の製造のための最も好ましい選択です。さらに、それらは依然として安定したGd（III）19複合体を形成しながら（ベクターまたはナノキャリアをターゲティングなど ）様々な機能性分子に結合可能な二官能性キレート剤をもたらす種々の合成変換、やすいです。この目的のために、この手順で説明したDOTA型のモノマー単位がDO3A- tert-ブチルエステルを、一般的で容易に入手可能な前駆体、及び臭化物誘導体から調製しました。4-（4-ニトロフェニル）ブタン酸。この分子は、DOTAから誘導及びGd（III）を調整するために類似の構造を保有します。合成修飾は、様々な機能性分子...

磁気共鳴イメージング（MRI）は、その非侵襲的性質と優れた固有の軟組織のコントラストに広く生物医学研究および臨床診断に使用される強力な非イオン化イメージング技術です。最も一般的に使用されるMRI法は、水信号の密度の差に基づいて組織内の高解像度画像と詳細情報を提供し、水のプロトンから得られる信号を利用します。信号強度およびMRI実験の特異性は、さらに、造影剤（CAを）使用して向上させることができます。これらは、それぞれ、長手方向（T 1）と横方向（T 2）緩和時間に影響を与える常磁性または超常種、1,2です。 ポリアミノポリカルボン酸リガンドとランタニドイオンのガドリニウム錯体は、最も一般的に用いられるT 1のCAです。ガドリニウム（III）は、T 1緩和を短縮します水プロトンの時間、従ってMRI実験3における信号のコントラストを増加させます。しかし、イオンガドリニウムは有毒です。そのサイズは、カルシウム（II）のことを近似し、それが真剣に細胞内のカルシウム補助シグナル伝達に影響を与えます。したがって、非環状および大環状キレートは、この毒性を中和するために使用されます。様々な多座配位子は、高い熱力学的安定性と運動不活性1とガドリニウム（III）錯体が得られ、これまでに開発されてきました。特に12員azamacrocycleシクレン、そのテトラ派生DOTA（1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン1,4,7,10-四酢酸）に基づくものは、ほとんど調査され、このCAクラスの複合体を適用しています。 それにもかかわらず、GdDOTA型CAは、このような低コントラスト効率および高速腎排泄のようなある種の欠点を表示する、低分子量のシステムです。高分子および多価CAは、これらの問題4への良好な溶液であってもよいです。 CA biodistribuので、ションは、主にそのサイズによって決定され、高分子CAは組織内はるかに長い保持時間を表示します。実質的に収集されたMR信号と測定品質を向上させる、モノマーMRプローブ（ 例えば、GdDOTA複合体）の増加した局所濃度におけるこれらの薬剤の結果の多価性、同様に重要。 デンドリマーは、MRI 4,5のための多価CAの製造のための最も好ましい足場中にあります。明確に定義されたサイズを有するこれらの高度に分岐した巨大分子は、その表面上の様々なカップリング反応を受けやすいです。本研究では、第4世代（G4）は、ポリ（アミドアミン）GdDOTAのようなキレート（DCA）に結合された（PAMAM）デンドリマーからなるMRI用デンドリマーCAの準備、精製、および特徴付けを報告します。我々は、反応性DOTA誘導体の合成とPAMAMデンドリマーへの結合について説明します。 Gd（III）、標準的な物理化学的特性評価との複合体形成時に。手順DCAの再実施しました。最後に、MRI実験は、低分子量のCAから得られるものよりも強いコントラストでMR画像を生成するDCAの能力を実証するために行きました。

<table><tbody><tr><td>Cyclen</td><td>CheMatech</td><td>C002</td><td></td></tr><tr><td>tert-ブチルブロモ酢酸&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14917</td><td></td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド</td><td>フルカ</td><td>40248</td><td></td></tr><tr><td>炭酸カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>209619</td><td></td></tr><tr><td>4-(4-ニトロフェニル)酪酸</td><td>Aldrich</td><td>335339</td><td></td></tr><tr><td>塩化チオニル&nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>382662500</td><td>注:腐食性物質、吸入すると有毒</td></tr><tr><td>臭素</td><td>Acros Organics</td><td>402841000</td><td>注:重度の皮膚火傷を引き起こし、吸入すると致命的となる&nbsp;</td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>任意のソース</td><td></td><td></td></tr>硫酸<tr><td>ナトリウム</td><td>Acros Organics</td><td>196640010</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム&nbsp;</td><td>VWRケミカルズ</td><td>22711.29</td><td></td></tr><tr><td>tert-ブチル2,2,2-トリクロロアセチミデート</td><td>アルドリッチ</td><td>364789</td><td>注:可燃性物質;皮膚や目への刺激性</td></tr><tr><td>三フッ化ホウ素エーテル酸</td><td>アクロスオーガニックス</td><td>174560250</td><td>48% BF3.注:可燃性物質。皮膚の火傷を引き起こし、吸入すると致命的</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Acros Organics</td><td>424270010</td><td></td></tr><tr><td>酢酸エチル</td><td>任意のソース</td><td></td><td>カラムクロマトグラフィー</td></tr><tr><td>の場合n-ヘキサン</td><td>任意のソース</td><td></td><td>カラムクロマトグラフィーの場合</td></tr><tr><td>バルブ・トゥ・バルブ(Kugelrohr)蒸留装置</td><td>B&uuml;</td><td></td> chi <td>モデルタイプ: ガラスオーブン B-585</td></tr><tr><td>Silicagel</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P090.2</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>任意のソース</td><td></td><td>カラムクロマトグラフィー用</td></tr><tr><td>ジクロロメタン&nbsp;</td><td>任意のソース</td><td></td><td>カラムクロマトグラフィーの場合</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR 化学薬品</td><td>20821.296</td><td></td></tr><tr><td>アンモニア</td><td>アクロス 有機物</td><td>428381000</td><td>7 N メタノール中の溶液</td></tr><tr><td>パラジウム</td><td>アルドリッチ</td><td>643181</td><td>15% 湿式</td></tr><tr><td>水素化装置 PARR</td><td>PARR 機器会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celite 503</td><td>Aldrich</td><td>22151</td><td></td></tr><tr><td>焼結ガラス漏斗</td><td>任意のソース</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チオホスゲン</td><td>アルドリッチ</td><td>115150</td><td>注:皮膚への刺激性;吸入すると有毒</td></tr>な<tr><td>トリエチルアミン</td><td>アルファエーザーA12646</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン&nbsp;</td><td>アクロスオーガニックス</td><td>348460010</td><td>エクストラドライ&nbsp;</td></tr><tr><td>マグネチックスターラー</td><td>任意のソース</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAMAM G4 デンドリマー</td><td>アンドリュース ChemService</td><td>AuCS - 297</td><td>10% wt. MeOH</td></tr>溶液 <tr><td>リポフィリックセファデックス LH-20</td><td>シグマ</td><td>LH20100</td><td></td></tr><tr><td>薄層クロマトグラフィープレート</td><td>メルクミリポア</td><td>1.05554.0001</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>VWR ケミカル</td><td>ズ 20318.297</td><td></td></tr><tr><td>ロフィライザー&nbsp;</td><td>任意のソース</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化ガドリニウム(III) 六水和物</td><td>Aldrich</td><td>G7532</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Acros Organics 134070010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>任意のソース</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 二ナトリウム塩二水和物</td><td>Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>質量分析計 (ESI)</td><td>アジレント</td><td></td><td>イオントラップSL 1100&nbsp;</td></tr><tr><td>アセテート緩衝液</td><td>任意のソース</td><td></td><td>pH 5.8</td></tr><tr><td>キシレノールオレンジ</td><td>Aldrich</td><td>52097</td><td>20 &mu;M in acetate buffer</td></tr><tr><td>Hydrophylic Sephadex G-15</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0020-01</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC900324</td><td>Ultracel-3 membrane (MWCO 3000)</td></tr><tr><td>任意のソース</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR分光計を</td>遠心分離&nbsp;<td>Bruker</td><td></td><td>Avance III 300 MHz</td></tr><tr><td>Topspin</td><td>Bruker</td><td></td><td>Version 2.1</td></tr><tr><td>燃焼分析装置</td><td>EuroVector SpA</td><td></td><td>EuroEA 3000 Elemental Analyser&nbsp;</td></tr><tr><td>MALDI-ToF MS 装置</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>Voyager-STR</td></tr><tr><td>重水素酸化</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6672.3</td><td></td></tr><tr><td>tert-Butyl alcohol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AE16.1</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>任意のソース</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Norell NMR チューブ</td><td>Deutero GmbH</td><td>507-HP-7</td><td></td></tr><tr><td>NMR 同軸チューブ</td><td>Deutero GmbH</td><td>coaxialb-5-7</td><td></td></tr><tr><td>DLS機器</td><td>Malvern</td><td></td><td>Zetasizer Nano ZS</td></tr><tr><td>0.20 &mu;m PTFEフィルター&nbsp;</td><td>カールロスGmbH</td><td>KC94.1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>フィッシャーBioReagents</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックチューブバイアル任意の</td><td>ソース</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dotarem</td><td>Guerbet</td><td></td><td>NDC 67684-2000-1</td></tr><tr><td>MRIスキャナー</td>ブル<td>カーBioSpec</td><td></td><td>70/30 USRマグネット(7 T)。注:高磁場に関連する潜在的な危険性</td></tr><tr><td>RFコイル</td><td>Bruker</td><td></td><td>Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)</td></tr><tr><td>Paravision (software)</td><td>Bruker</td><td></td><td>Version 5.1</td></tr></tbody></table>

調製と<em&gt;インビトロ</em&gt;磁気共鳴イメージングのためのデンドリマーベースの造影剤のキャラクタリゼーション

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

非環状または大環状キレートとガドリニウム（III）の常磁性錯体は、磁気共鳴画像（MRI）のために最も一般的に使用される造影剤（CAS）です。その目的は、このようにMR画像のコントラストとMRI測定の特異性を増加させる、組織中の水プロトンの緩和速度を高めることです。現在臨床的に承認された造影剤は、急速に身体から除去される低分子量分子です。常磁性キレートのキャリアとしてのデンドリマーの使用は、より効率的なMRI造影剤の将来の発展に重要な役割を果たすことができます。具体的には、より高い信号は対照的に、常磁性種の結果の局所濃度の増加。さらに、このCAは、その高い分子量およびサイズによる長い組織滞留時間を提供します。ここでは、ポリ（アミドアミン）に基づく高分子MRI造影剤（PAMAM）monomacro有するデンドリマーの調製のための便利な手順を示します巡回DOTA型キレート剤（DOTA - 1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン1,4,7,10-四酢酸）。キレート化ユニットは、チオ尿素架橋を形成するために、PAMAMデンドリマーのアミン表面基に対してイソチオシアネート（NCS）基の反応性を利用することによって付加しました。デンドリマー生成物を精製し、核磁気共鳴分光法、質量分析、および元素分析によって分析しました。最後に、高解像度のMR画像を記録し、準備デンドリマー及び市販のモノマー剤から得られる信号のコントラストを比較しました。

DCAの調製は、2つのステージから構成：1）モノマーDOTA型キレート剤の合成（ 図1）及びG4のPAMAMデンドリマーと複合体デンドリマーのGd（III）の後続の製造とキレート剤の2）カップリング（ 図2） 。第一段階では、4つのカルボン酸を含有するシクレン系DOTA型キレート剤およびさらなる合成修飾に適した直交群を作製しました。 tert-ブチル2-ブロモ-4-（4-ニトロフェニル）ブタノエート8でアルキル化した1（DO3A- tert-ブチルエステル）7から開始し調製は、2 DOTA誘導体を提供します。パラジウム触媒水素化は、アニリン3を得2芳香族ニトロ基を減少させました。チオホスゲンと3の変換はwhic、イソチオシア...

このプロトコルは、常磁性のガドリニウムイオンを配位シクレンベースの大環状キレートを担持デンドリマー磁気共鳴イメージング（MRI）造影剤の調製および特徴付けを記載します。市販の単量体のアナログと比較した場合、in vitroでのMRI一連の実験では、このエージェントは、増幅されたMRI信号を生成しました。

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance ...

本手順の全体的な目的は、磁気共鳴画像法（MRI）の造影剤として利用可能なデンドリマー型常磁性キレート剤の調製および特性評価を示し、画像診断実験におけるその性能を実証することです。本手法は、デンドリマー型造影剤の特性や有効性など、MRI造影剤の分野における重要な疑問の解決に寄与します。この技術の主な利点は、高タンパクで効率的なMRI造影剤を簡便に調製でき、それによって容易な特性評価が可能になることです。この手法は、潜在的なin vivoへの応用に非常に重要な、デンドリマー型MRI造影剤のさらなる構造修飾や機能最適化へと拡張することが可能です。デンドリマー型造影剤の高い分子量は、組織保持時間の延長をもたらし、MRI信号を大幅に向上させるため、その影響は生物医学研究や診断イメージングにまで及びます。まず、1 gのマクロサイクル前駆体であるDO3A tributyl esterを5 mLのDMFに溶解させます。炭酸カリウム0.67gを加え、室温で45分間撹拌する。tert-ブチル-2-ブロモ-4-ニトロフェニルブタノエート0.87gを1時間かけて少量ずつ加え、反応混合物をさらに18時間撹拌し続ける。その後、40～60℃でバルブ・トゥ・バルブ真空蒸留を行い、DMFを除去する。シリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、円形の固体を得る。この固体1 gを、エタノール10 mLとメタノール中7 Nアンモニア溶液150 µLの混合液に溶解させる。活性炭担持パラジウム150 mgを加え、ボトルリアクターを水素化装置に設置する。混合物を2.5 barの水素雰囲気下で16時間振とうします。珪藻土のエタノール懸濁液をガラスフィルターに注ぎます。反応混合物を珪藻土でろ過し、パラジウム炭素触媒を除去します。ろ液からロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去します。得られた固体を15 millilitersのジクロロメタンと4当量のトリエチルアミンに溶解させる。これに1.3当量のチオホスゲンを加え、室温で16時間攪拌する。エバポレーターを用いて反応混合物から溶媒を除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、DOTA型モノマーを淡褐色の固体として得る。40 °Cのロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させ、10%メタノール溶液から66.7 mgのG4 PAMAMデンドリマーを調製します。このデンドリマーを4 mLのDMFに溶解させます。デンドリマー溶液に0.105 mLのトリエチルアミンを加え、60 °Cで45分間撹拌します。次に、モノマー354 mgを1時間かけて分割して添加します。45 °Cで48時間攪拌を続けます。バルブ・トゥ・バルブ真空蒸留により溶媒を除去します。親油性ゲルろ過担体をメタノール中で室温で3時間撹拌し、サイズ排除クロマトグラフィーカラムを充填します。メタノールを溶離液として用いて、1 mLずつ分画して回収します。回収した分画をTLCで分析します。保護されたデンドリマー状キレート剤を含む分画から、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去する。化合物のプロトンNMRスペクトルを測定し、芳香族領域と脂肪族領域を積分する。これらの値を用いて、G4 PAMAMデンドリマーに結合した保護DOTA型マクロサイクル数を決定する。生成物を脱保護するために、固体を5 mLのギ酸に溶解し、混合物を60 °Cで36時間攪拌します。エバポレーターを用いてギ酸を除去します。エバポレーターから回収した残渣を凍結乾燥させ、デンドリマーキレート剤を得ます。プロトンNMRを用いて、デンドリマーに結合したマクロサイクルユニットの数を決定します。凍結乾燥させたキレート剤を水に溶解させます。0.1 M 水酸化ナトリウムを用いて、溶液のpHを7.0に調整します。1 mLの水に113 mgの塩化ガドリニウム(III)を溶解させた溶液を、キレート剤溶液に4時間かけて滴下します。0.05 Mの水酸化ナトリウムを用いて、定期的にpHを7.0に調整してください。混合物を室温で24時間撹拌します。次に、4時間かけて158 mgのEDTAを分割して加え、必要に応じてpHを7.0に再調整します。室温でさらに24時間撹拌します。水で膨潤させた親水性ゲルろ過担体を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーカラムを充填します。反応混合物を濃縮し、カラムにロードして、脱イオン水で溶出させます。精製したサンプルを3 kDaの遠心フィルターユニットに入れ、1,800 ×gで30分間遠心分離します。過剰なガドリニウムおよびEDTAを除去するため、このろ過操作を約5回繰り返します。キシレノールオレンジ試験を用いて、ろ液中に遊離ガドリニウムイオンが存在しないことを確認します。ろ過したサンプルから揮発分を除去し、残渣を凍結乾燥させてデンドリマー造影剤を得ます。5から10 millimolarの濃度のDCA水ストック溶液を調製します。正確なDCA濃度を決定するために、まずストック溶液360 µLとD2Oおよびtert-ブタノール標準液60 µLを混合します。サンプルの400 µLを外側のNMRチューブに入れます。tert-ブタノールと水の参照溶液を含む同軸NMRインサートチューブを、サンプルチューブの中に挿入します。プロトンNMRスペクトルを取得し、参照溶液と試料溶液のtert-butanolシグナルの周波数シフトを測定します。試料に添加したtert-butanol分を補正し、提示された式を用いてDCA濃度を算出します。市販のGdDOTA溶液の濃度についても、同様の方法で決定します。HEPES緩衝液中のDCAおよびGdDOTA溶液と、対照としての水を2セットのプラスチックバイアルに入れます。気泡が入らないように注意して、キャップでバイアルを閉じます。60 mLシリンジに、0.01および0.02 mMのDCAサンプル、0.5および1.0 mMのGdDOTAサンプルをそれぞれ1つずつ、および水対照を2つ、水平にロードします。2番目のサンプルセットを2本目の60 milliliterシリンジにロードし、この手順を繰り返します。各シリンジに1 millimolar GdDOTA溶液を満たし、シリンジの先端をキャップで閉じます。MRIスキャナーにシリンジの1本を水平に配置し、サンプルがスキャナーに対して垂直になるようにします。シリンジをスキャナーの中央にスライドさせます。解剖学的スキャンを選択し、シリンジを磁石のアイソセンターに配置します。その後、信号機ボタンを押し、初期スキャンパラメータの調整を行い、スキャンを開始します。T1強調画像を得るには高速/低速角度ショット法を、T2強調画像を得るには緩和増強による高速撮像法を選択してください。垂直に配置したサンプルについては、ロカライザー走査を用いて冠状断スライスを選択します。コントラスト対雑音比の撮像パラメータを最適化し、画像を撮像してください。円形のROIを用いて、背景および各サンプルの平均信号振幅と標準偏差を決定します。次に、信号対雑音比（S/N比）を算出します。NMR、MALDI-TOF MS、および元素分析により、平均49個のマクロサイクルユニットがG4 PAMAMデンドリマーに結合していることが示されました。DCA溶液の濃度ならびに縦方向および横方向の緩和時間は、NMRを用いて測定した。得られた緩和能の値は、市販されており臨床で使用されているGdDOTAモノマーと比較した。また、DCAの性能についてもGdDOTAモノマーと比較した。2組の溶液は、結合したマクロサイクルユニット数に基づき、同様のガドリニウム濃度となるように調製し、残りの2組は同様の分子濃度となるように調製した。同様のガドリニウム濃度でのT1強調画像実験において、信号対雑音比はGdDOTAよりもDCAの方がわずかに高かった。溶液を同様の分子濃度とした場合、DCAの信号対雑音比はGdDOTAの約3倍であった。T2強調画像実験において、DCAの信号対雑音比は、いずれの濃度ペアにおいてもGdDOTAより有意に低く、特にDCAの濃度が高い場合に顕著でした。このビデオを視聴することで、精製および特性評価が行われたデンドリマーベースのMRI造影剤の調製方法について十分に理解できるはずです。本手順に従い、分子ユニットを変更することで、さまざまな種類の中分子デンドリマー型およびナノサイズのMRI造影剤を調製し、簡便に分析することが可能です。この手法を習得することで、MRI造影剤開発分野の研究者は、現代の分子イメージングにおいて極めて重要なさまざまな機能研究を実施するための、一連の特異的プローブを調製できるようになるはずです。

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