調製とインビトロ磁気共鳴イメージングのためのデンドリマーベースの造影剤のキャラクタリゼーション

この手順の全体的な目標は、磁気共鳴イメージングの造影剤として使用できる樹状突起常磁性キレートの調製と特性評価を示し、イメージング実験でその性能を実証することです。この方法は、デンドリマー造影剤の特性や有効性など、MRI造影剤の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、高タンパク質を含む効率的なMRI造影剤の調製が容易であり、したがって、その容易な特性評価が保証されます。

この方法は、樹状突起性MRI造影剤のさらなる構造変更と機能最適化に向けて拡張することができ、これは潜在的なin vivoアプリケーションにとって非常に関連性があります。その影響は生物医学研究や画像診断にまで及び、樹状体造影剤の高分子率により組織保持時間が長くなり、MRI信号が大幅に増強されます。まず、大環状前駆体DO3Aトリブチルエステル1グラムをDMFの5ミリリットルに溶解します。

0.67グラムの炭酸カリウムを加え、室温で45分間攪拌します。0.87グラムのtert-ブチル-2-ブロモ-4 4-ニトロフェニルブタトノエートを1時間以上少しずつ加え、反応混合物を18時間攪拌し続けます。次に、摂氏40〜60度の球根間真空蒸留でDMFを取り出します。

残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、丸い固体を得ます。10ミリリットルのエタノールと150マイクロリットルの7つの正常アンモニア溶液の混合物に固体1グラムを溶解します。活性炭に150ミリグラムのパラジウムを加え、水素化装置にボトルリアクターを設置します。

混合物を2.5バールの水素雰囲気下で16時間振とうします。エタノール中の珪藻土の懸濁液を焼結ガラス漏斗に注ぎ、珪藻土を通して反応混合物をろ過し、パラジウム炭素触媒を除去します。ロータリーエバポレーターで濾液から溶媒を取り除きます。

得られた固体を15ミリリットルのジクロロメタンと4等量のトリエチルアミンに溶解します。これに、1.3当量のチオホスゲンを加え、混合物を室温で16時間攪拌します。ロータリーエバポレーターで反応混合物から溶媒を除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで残留物を精製して、淡褐色の固体であるDOTA型モノマーを得ます。

メタノール中の10%溶液から66.7ミリグラムのG4 PAMAMデンドリマーを調製し、40°Cのロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させます。デンドリマーを4ミリリットルのDMFに溶解します。デンドリマー溶液に0.105ミリリットルのトリエチルアミンを加え、摂氏60度で45分間撹拌します。

次に、354ミリグラムのモノマーを1時間かけて少しずつ加えます。摂氏45度で48時間攪拌を続けます。球根間真空蒸留で溶媒を除去します。

サイズ排除クロマトグラフィーカラムを、親油性ゲルろ過媒体をメタノール中で室温で3時間渦巻いて充填します。メタノールを溶離液として使用して、1ミリリットルの画分を収集します。TLCでフラクションを分析します。

ロータリーエバポレーター上の保護された樹状結晶キレート剤を含む画分から溶媒を取り除きます。化合物のプロトンNMRスペクトルを取得し、芳香族領域と脂肪族領域を統合します。これらの値を使用して、G4 PAMAMデンドリマーに結合した保護されたDOTA型マクロサイクルの数を決定します。

製品の保護を解除するには、固体を5ミリリットルのギ酸に溶解し、混合物を摂氏60度で36時間攪拌します。ロータリーエバポレーターでギ酸を取り除きます。ロータリーエバポレーターから除去した残留物を凍結乾燥して、樹状水分キレート剤を得ます。

プロトンNMRを用いて、デンドリマーに結合した大環状単位の数を決定します。凍結乾燥キレート剤を水に溶かします。0.1モルの水酸化ナトリウムを使用して、溶液のpHを7.0に調整します。

1ミリリットルの水に113ミリグラムの塩化ガドリニウムIIIの溶液を4時間かけてキレート剤溶液に滴下します。.0.05モルの水酸化ナトリウムでpHを7.0に定期的に調整します。混合物を室温で24時間攪拌します。

次に、158ミリグラムのEDTAを4時間かけて少しずつ加え、必要に応じてpHを7.0に戻します。室温でさらに24時間撹拌します。サイズ排除クロマトグラフィーカラムに、水で膨潤させた親水性ゲルろ過媒体を充填します。

反応混合物を濃縮し、混合物をカラムにロードし、脱イオン水で溶出します。精製したサンプルを3キロダルトンの遠心分離機フィルターユニットで1, 800回gで30分間遠心分離します。ろ過を約5回繰り返して、余分なガドリニウムとEDTAを除去します。

濾液中に遊離ガドリニウムイオンが存在しないことをキシレノールオレンジ試験で確認します。ろ過したサンプルから揮発性物質を取り除き、残留物を凍結乾燥させてデンドリマー造影剤を得ます。5〜10ミリモルの濃度の水にDCAの原液を調製します。

正確なDCA濃度を決定するには、まず360マイクロリットルのストック溶液と60マイクロリットルのD2Oおよびtert-ブタノール標準物質を組み合わせます。400マイクロリットルのサンプルを外側のNMRチューブに入れます。tert-ブタノールと水参照溶液が入った同軸NMRインサートチューブをサンプルチューブに入れます。

プロトンNMRスペクトルを取得し、参照溶液とサンプル溶液のtert-ブタノール信号間の周波数シフトを測定します。示された式を使用してDCA濃度を計算し、サンプルに添加されたtert-ブタノールを補正します。同様に、市販のGdDOTA溶液の濃度を決定します。

DCAおよびGdDOTA溶液をHEPESバッファーに入れ、2セットのプラスチックバイアルに水制御器を入れます。バイアルをキャップで閉じて、気泡が存在しないことを確認します。60ミリリットルのシリンジに、0.01ミリモルと0.02ミリモルのDCAサンプル、0.5ミリモルと1.0ミリモルのGdDOTAサンプルの1つ、およびウォーターコントロールの2つを水平にロードします。

この手順を繰り返して、2番目のサンプルセットを2番目の60ミリリットルシリンジにロードします。各シリンジに1ミリモルのGdDOTA溶液を充填し、シリンジの先端にキャップをします。シリンジの1つをMRIスキャナーに水平に置き、サンプルがスキャナーに対して垂直になるようにします。

シリンジをスキャナーの中央にスライドさせます。解剖学的スキャンを選択して、シリンジを磁石のアイソセンタに配置します。次に、信号機ボタンを押して初期スキャンパラメータの調整を実行し、スキャンを開始します。

T1ウェイトイメージングを行うにはファスト/スローアングルショット法を、T2ウェイトイメージングを行うにはリラクゼーションエンハンスメント法によるラピッドアクイジション法を選択します。ローカライザースキャンを使用して、垂直に整列したサンプルの冠状スライスを選択します。ノイズ取得パラメータに対するコントラストを最適化し、画像を取得します。

循環 ROI を使用して、バックグラウンドと各サンプルの平均信号振幅と標準偏差を決定します。信号対雑音比を計算します。NMR、MALDI-TOF MS、および元素分析により、平均49の大環状単位がG4 PAMAMデンドリマーに結合していることが示されました。

DCA溶液の濃度と縦方向および横方向の緩和時間もNMRで決定しました。得られた弛緩性の値を、市販され、臨床的に使用されているGdDOTAモノマーと比較した。DCAの性能もGdDOTAモノマーと比較されました。

2セットの溶液は、共役大環状単位の数によって決定されるガドリニウム濃度が類似しており、他の2セットは分子濃度が類似していました。同様のガドリニウム濃度のT1強調イメージング実験では、S/N比はDCAの方がGdDOTAよりもわずかに高かった。溶液の分子別濃度が同程度の場合、DCAのS/N比はGdDOTAの約3倍でした。

T2 加重イメージング実験では、DCA の S/N 比は、特に DCA 濃度が高い場合、両方の濃度ペアで GdDOTA の S/N 比よりも有意に低かった。このビデオを見れば、精製され特性評価されたデンドリマーベースのMRI造影剤の調製方法について十分に理解できるはずです。この手順に続いて、分子の単位を変更することにより、さまざまなタイプの樹状物形成剤およびナノサイズのMRI造影剤を調製し、簡便に分析することができます。

この技術を習得すると、MRI造影剤開発の分野の研究者は、現代の分子イメージングにとって非常に重要なさまざまな機能研究を実行するためのさまざまな特定のプローブを準備できるようになるはずです。