Name: ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学ぶヒト全血中のNK細胞数と細胞傷害活性をフローサイトメトリーで迅速かつ正確に測定する方法。免疫学研究における再現性のあるデータ取得技術を習得できます。

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このプロジェクトは、USDA国立食糧農業研究所からのAgriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395の支援を受けました。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本研究に記載された方法は、直接的（この特定の場合、長時間の運動で）刺激に応答して個々のNK細胞の特異的活性を測定します。典型的に、NK細胞は、マーカーの組み合わせを使用して選別密度勾配または細胞を使用して1つの血液から単離されます。これらの方法が広く使用されているが、それらは多くの欠点を持っている：彼らは、時間がかかり、複数の操作を伴い、かつ重くユーザー依存しています。その結果、過度の応力を実験する実験から増加変動をもたらすことができる、単離されNK細胞上に配置された、あるいは同一の実験の範囲内です。本稿では、磁気ベースの分離を利用したプロトコルを説明しました。血液またはNK細胞の操作を最小限に抑えながら、これは、個体の全血におけるNK細胞の高い数の迅速な、かつ信頼性の選別を可能にします。 この方法は、サンプルが疎であるヒトの研究に特に適しているが、あまりにも多くのサンプルを一緒に処理する必要がある場合フリップサイドに方法はかなり困難になります。実際に、細胞傷害性アッセイのための買収の窓は、私たちの経験では、最大で一度に5つのサンプルに変換インキュベーションの終了後、通常、30分以...

ナチュラルキラー細胞は、自然免疫系の重要な構成要素です。それらは非常に規制されているが、それらは認識し、細胞間接触を介して前活性化1せずに異常な細胞を除去する能力を有します。そのようなものとして、それらは、感染に対する防御の迅速なラインを形成します。特に激しい運動は、一過性免疫系2、3、4、5を抑制することが示されています。 NK細胞は、効果的に疾患に高感度のウィンドウを作成し、この効果4、 図6、 図7を特に受けやすいです。したがって、前の介入の研究は、NK細胞機能への影響を削減するという目標との間または後の激しい運動は、運動選手のポスト競技の幸福のために特に重要です。 1％、8まばらです。 2）NK細胞はストレスに非常に敏感であり、実験中に生存可能で安定した状態を維持するために生理学的条件に一定の暴露に依存しています。 3）標準的なアッセイは、フィコール勾配9として、NK細胞の細胞毒性を決定し、アッセイ10を解放するために、信頼できないと矛盾しています。ヒト試料の固有の変動は、これらの問題を配合します。介入の間に収集され、新鮮なヒトサンプルは、少なくとも動物サンプルまたは不死化細胞株と比較した場合、入手がかなり規制が困難です。これは、実験を繰り返したり、統計的な有意しきい値に到達するために研究コホートに参加者を追加する機会を減らすことができます。まとめると、これらの問題はfoを可能にする合理化されたプロトコルの必要性をサポートrの両方のハイスループットおよびヒト試料中のNK細胞溶解活性の高い信頼性解析。 無関係な要因への曝露を最小限に抑えながら、我々は、ヒト全血から識別するために必要な時間を短縮し、ワークフロー、隔離し、テストNK細胞を確立しました。減少またはNK細胞の細胞毒性の増加の検出を可能にするE比：方法は2楽器、磁気ベースのセルソーターとイメージングフローサイトメーター、およびアッセイ特異的な、最適化されたTの使用を最適化します。

<table><tbody><tr><td>K-562 リンパ芽球</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>イスコーブの改変ダルベッコ培地</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>高グルコース、L-グルタミン、HEPES付き、滅菌ろ過</td></tr><tr><td>アルファ最小必須培地</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td>リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドなし、ただし 2 mM L-グルタミンと 1.5 g/L 重炭酸ナトリウム</td></tr> トリ<tr><td>パンブルー溶液 0.4%</td><td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td>組織培養グレード</td></tr><tr><td>ヨウ化プロプリジウム染色液</td><td>BD Pharmingen</td><td>51-66211E</td><td></td></tr><tr><td>Vybranto DiO 細胞標識液</td><td>Vybranto</td><td>V-22886</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Pro セパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS ランニングバッファー</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS 洗浄バッファー</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-987</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS カラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>全血 CD56 MicroBeads, ヒト</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-875</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream X Mark II イメージング フロー サイトメーター</td><td>EMD ミリポア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スピードビーズ</td><td>Amnis Corporation</td><td>400030</td><td></td></tr><tr><td>0.4-0.7% 次亜塩素酸塩 (滅菌器)</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td></td></tr><tr><td>コールター クレンツ</td><td>ベックマン コールター</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>70% イソプロパノール (デバブラー)</td><td>EMD ミリポア</td><td>1.3704</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (シース液)</td><td>EMD ミリポア</td><td>BSS-1006-B (1X)</td><td>カルシウムまたはマグネシウムなし</td></tr><tr><td>INSPIRE ソフトウェア</td><td>EMD ミリポア</td><td></td><td>バージョン Mark II、2013 年 9 月</td></tr><tr><td>アイデアアプリケーションソフトウェア</td><td>EMDミリポア</td><td></td><td>バージョン6.1、2014年7月</td></tr></tbody></table>

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK細胞の細胞傷害性は、NK細胞機能の外部の介入の効果を決定するために広く使用される尺度です。しかし、このアッセイの精度および再現性があるため、ユーザのエラーのため、または実験的操作にNK細胞の感受性のいずれか、不安定と考えることができます。これらの問題を解消するために、最小限にそれらを減少させるワークフローを確立し、ここで提示されています。例示するために、我々は、運動の激しい試合に提出されたランナー（N = 4）から、様々な時点で、血液サンプルを得ました。まず、NK細胞は、同時にCD56のタグ付けと磁気ベースの選別を経て、直接全血からと1ミリリットル限り少ないから同定および分離されています。ソートされたNK細胞は、任意の試薬またはキャッピング抗体から除去されます。これらは、血液1ミリリットル当たりの正確なNK細胞数を確立するために計数することができます。第二に、ソートされたNK細胞（エフェクター細胞またはE）は、3,3&#39;- Diotadeと混合することができます5 T：cyloxacarbocyanine過塩素酸（DIO）をアッセイ最適1でK562細胞（標的細胞またはT）をタグ付けされたE比、および各イベントの可視化および任意の偽陽性の排除を可能にするイメージングフローサイトメーターを用いて分析しましたまたは（例えばダブレットまたはエフェクター細胞など）偽陰性。このワークフローは、約4時間で完了し、さらにはヒト試料での作業は非常に安定した結果を可能にすることができます。ご利用の際は、研究チームは、ヒト対象にいくつかの実験介入をテストし、データの整合性を損なうことなく、いくつかの時点全体の測定値を比較することができます。

NK細胞数の決意 全血におけるNK細胞数の激しい走行の効果は、図2に記載の運動プロトコルを用いて、測定されました。血液サンプルは直ちに運動、運動後1.5時間、および初期採血後、最終的に24および48時間後に、運動前に描かれました。全血1ミリリットル当たりNK細胞の濃度は、各ランナー（ 図3A）および各時点の平均（ 図3B）で測定しました。 我々の結果（ 図3A）、1 2ランナーショー、そして4本の直前にゆっくりと24および48時間後に正常に戻って、急激な減少が続い運動後のNK細胞数のわずかな増加と同様のパターン。この傾向は、ランナーのグループに対するNK細胞の平均値をプロットすることにより、特に見られなかったが、有意差はから運動前のレベルが検出されました。ランナー3は、最初は非常に高い数を提示し、それが急激にゆ...

この研究は、ヒトの血液サンプル中のNK(Natural Killer)細胞数とNK細胞の細胞毒性を正確かつ迅速に決定するための高度なワークフローを説明しています。

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

この実験の全体的な目標は、ヒト全血サンプル中のNK細胞数と細胞毒性活性化レベルを、迅速、確実、かつ安定した方法で決定することです。この方法は、NK細胞の生理活性に対する外部介入の影響は何か、次のような免疫学分野の質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、高速で正確でありながら、実験全体で再現性のある結果が得られることです。ヒト全血からNK細胞を単離するには、まず、Whole blood sample、Negative Fraction、およびPositive Fractionとラベル付けされた15ミリリットルのチューブをセルセパレーターチューブラックの適切な位置に配置します。すべてのチューブがロードされたら、セパレーターラックをミニサンプラーに挿入して自動ラベリングし、メニューの[試薬]を選択して、バイアルがラックに配置される位置を強調表示します。[Read Reagent]を選択して2次元コードリーダーをアクティブにし、適切な試薬バイアルを2次元コードリーダーのカバーから0.5〜2.5センチメートルの角度で2次元コードリーダーの前に持ちます。読み取りバイアルを適切なセパレーターラックの位置に置きます。次に、[分離]タブで、目的の位置を強調表示します。次に、[ラベリング]サブメニューを開き、自動ラベリングプログラムを選択します。細胞分離試薬マイクロビーズをラック位置1、2、3、4に割り当てます。そして、Posselwb separatonプログラムを選択します。リンスウォッシュプログラムを選択します。「Volume」サブメニューの「Sample Volume」に1500マイクロリットルを入力し、Enterキーを押します。次に、[実行] をクリックしてセルの分割を開始します。[OK] をクリックして、すべてのサンプルを処理するのに十分なバッファーが使用可能であることを確認します。細胞毒性アッセイサンプルを調製するには、まず、必要に応じて各サンプルおよび/または参加者に1.5ミリリットルのチューブを標識し、NK細胞とDIO標識K562細胞の所望の比率を各チューブにパイプで送ります。遠心分離により細胞を採取し、細胞ペレットを乱さずに上清を慎重に除去します。次に、細胞混合物を500マイクロリットルの不完全なNK細胞培地に再懸濁し、各チューブ内の細胞を5マイクロリットルのヨウ化プロピジウムで標識します。別の遠心分離で細胞を採取し、カリング培養物を摂氏37度で2時間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、同じ遠心分離機条件下で細胞を遠心分離し、ペレットを25マイクロリットルの新鮮な不完全なNK細胞培養培地に再懸濁します。フローサイトメトリーで細胞を解析するには、まず、イメージングフローサイトメーターソフトウェアのスタートアップボタンをクリックして、システムをフラッシュします。次に、散布図ボタンをクリックして4つの散布図を作成し、ダブルポジティブコントロールチューブをロードします。ダブルポジティブコントロールサンプルを使用して、検出器が過負荷にならないように405ミリワットレーザーの所望の強度を決定し、適切な数の細胞数を取得するようにイメージャーを設定します。DIOとPIの両方の検出に適した強度で405ミリワットのレーザーを設定するには、両方の色素とフローサイトメーターの検出範囲に関する経験が必要です。ダブルポジティブコントロールサンプルの取得が終了したら、DIOのみのコントロールサンプルをロードし、40X対物レンズを選択し、642ミリワットレーザーと明視野チャンネルをオフにします。適切な数の細胞を育種し、ヨウ化プロピジウムのみのサンプルについて取得を繰り返します。すべての制御サンプルを実行したら、405 ミリワットのレーザーと明視野チャンネルを再びオンにし、[強度を設定]をクリックします。次に、[ファイル取得]タブでカスタムファイル名を入力し、データファイルを保存するフォルダを選択します。次に、取得するセルの数を入力します。最初の実験用サンプルチューブをロードし、Acquireボタンをクリックします。すべてのサンプルを実行したら、イメージングフローサイトメーター解析ソフトウェアアプリケーションを開き、1つの実験RIFファイルを開きます。[報酬] タブで、[新しいマトリックスの作成] を選択します。ソフトウェアは、単一カラーファイルの選択を求め、それらをマージして、チャネル補正を適用するために選択するマトリックスファイルを作成します。ビルディングブロック関数を使用して、適切なドットプロットを設定します。次に、統計機能をクリックして、各ゲートのセル番号にアクセスします。この代表的な実験では、示された通りに血液サンプルを採取し、全血1ミリリットルあたりのNK細胞の濃度をランナーごとに測定し、各時点の平均値を測定しました。ランナーの4人中3人は、運動後にNK細胞数が同様にわずかに増加したことを示しました。その後すぐに急激に減少し、イベント終了後24時間から48時間後にゆっくりと正常に戻りました。平均して、NK細胞数は運動の1.5時間後に減少しましたが、24時間後にはほぼ正常レベルに戻りました。細胞数を計算した後、NK細胞の細胞傷害性活性は、示されたとおりに直ちに分析され、NK細胞の細胞毒性は平均してすぐに減少し、運動イベントの終了後1.5時間後には、運動後24時間で有意に増加しました。NKの細胞毒性は、有意ではないものの、運動前のレベルと比較して高いままでした。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約4時間で完了できます。このビデオを見れば、ヒトの血液サンプルからNK細胞数と細胞傷害活性を再現可能な水腫性で取得し、特性評価する方法を十分に理解できるはずです。

flow-cytometric-analysis-natural-killer-cell-lytic-activity-human

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JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、蛍光染色された標的細胞に対するナチュラルキラー細胞の溶解活性を示しています。この手法では、死細胞を染色し、フローサイトメーターを使用して生細胞と死細胞の標的細胞を定量することにより、NK細胞による細胞毒性の測定が可能になります。...

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Flow Cytometric Analysis 用サンプル調製

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がん細胞に対するナチュラルキラー細胞の細胞毒性を評価するためのin vitroアッセイ

このプロトコルは、高感度の細胞ベースの細胞毒性アッセイについて説明しています。このアッセイは、エフェクターCD8+ T細胞の数が増加している場合の生標的CD4+ T細胞の頻度の減少を列挙することにより、抗原特異的CD8+...

細胞毒性活性を測定するための細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ

簡単かつ信頼性のある方法は、異なるNK細胞サブセット内の脱顆粒、サイトカインおよびケモカインの産生などNK細胞機能のセットを分析するために、ここで説明されています。...

NK細胞の機能を監視するためのサイトメトリーに基づくアッセイを流します

流れ cytometry ベースの人間のナチュラル...

ヒト NK 細胞活性の評価の流れのフローサイトメトリーを用いた細胞毒性の試金

がん細胞によるナチュラルキラー(NK)細胞介在の根絶の回避は、がんの開始と進行に重要です。ここでは、肝腫瘍細胞に対するNK細胞媒介性細胞毒性を評価するための非放射活性ベースの2つのプロトコルを紹介する。さらに、NK細胞の移動を分析するための第3のプロトコルが提示されます。...

肝腫瘍細胞の文脈における自然キラー細胞媒介性細胞毒性と遊性の測定

ヒトナチュラルキラー細胞における治療抗体によるFcγRIIIA駆動事象を研究するためのプロトコルをここに説明する。この人工刺激プラットフォームは、脱顆粒、ケモカイン/サイトカイン産生、および結合に関与する抗体のFcγRIIIaおよびFc部分によって媒介されるシグナル伝達経路などの下流エフェクター機能の尋問を可能にする。...

治療抗体の存在下におけるFcγRIIIa関与によるヒトナチュラルキラー細胞事象の評価

本論文では、末梢血から分離されたヒトナチュラルキラー(NK)細胞の解糖とミトコンドリア呼吸を、静止状態またはIL15誘発活性化後に測定する方法について述べた。記載されたプロトコルは、他のサイトカインまたは可溶性刺激によって活性化された初代ヒトNK細胞に容易に拡張することができる。...

ヒトナチュラルキラー細胞代謝の解析

このプロトコルは、レンズフリーシャドウイメージング技術を使用して、ナチュラルキラー(NK)細胞数および活性の迅速な単一細胞分析のためのラベルフリー法を記述しています。この方法は、回折パターンをコンピュータで分析することにより、個々のNK細胞の形態学的変化を定量化します。...

ナチュラルキラー細胞活性化の迅速なラベルフリー分析のためのフィールド展開可能なレンズフリーイメージングプラットフォーム

このプロトコルは、生細胞イメージングとフローサイトメトリーを用いて、ヒトの自然なキメラ抗原受容体介在および抗体依存性細胞毒性を一貫して測定するための標準化された in vitro.

キメラ抗原受容体および治療用抗体によって増強されるNK細胞毒性の定量化:生細胞イメージングおよびフローサイトメトリー

学ぶヒト全血中のNK細胞数と細胞傷害活性をフローサイトメトリーで迅速かつ正確に測定する方法。免疫学研究における再現性のあるデータ取得技術を習得できます。

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

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