ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析
2017年3月17日
この研究は、ヒトの血液サンプル中のNK(Natural Killer)細胞数とNK細胞の細胞毒性を正確かつ迅速に決定するための高度なワークフローを説明しています。
この実験の全体的な目標は、ヒト全血サンプル中のNK細胞数と細胞毒性活性化レベルを、迅速、確実、かつ安定した方法で決定することです。この方法は、NK細胞の生理活性に対する外部介入の影響は何か、次のような免疫学分野の質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、高速で正確でありながら、実験全体で再現性のある結果が得られることです。
ヒト全血からNK細胞を単離するには、まず、Whole blood sample、Negative Fraction、およびPositive Fractionとラベル付けされた15ミリリットルのチューブをセルセパレーターチューブラックの適切な位置に配置します。すべてのチューブがロードされたら、セパレーターラックをミニサンプラーに挿入して自動ラベリングし、メニューの[試薬]を選択して、バイアルがラックに配置される位置を強調表示します。[Read Reagent]を選択して2次元コードリーダーをアクティブにし、適切な試薬バイアルを2次元コードリーダーのカバーから0.5〜2.5センチメートルの角度で2次元コードリーダーの前に持ちます。
読み取りバイアルを適切なセパレーターラックの位置に置きます。次に、[分離]タブで、目的の位置を強調表示します。次に、[ラベリング]サブメニューを開き、自動ラベリングプログラムを選択します。
細胞分離試薬マイクロビーズをラック位置1、2、3、4に割り当てます。そして、Posselwb separatonプログラムを選択します。リンスウォッシュプログラムを選択します。
「Volume」サブメニューの「Sample Volume」に1500マイクロリットルを入力し、Enterキーを押します。次に、[実行] をクリックしてセルの分割を開始します。[OK] をクリックして、すべてのサンプルを処理するのに十分なバッファーが使用可能であることを確認します。
細胞毒性アッセイサンプルを調製するには、まず、必要に応じて各サンプルおよび/または参加者に1.5ミリリットルのチューブを標識し、NK細胞とDIO標識K562細胞の所望の比率を各チューブにパイプで送ります。遠心分離により細胞を採取し、細胞ペレットを乱さずに上清を慎重に除去します。次に、細胞混合物を500マイクロリットルの不完全なNK細胞培地に再懸濁し、各チューブ内の細胞を5マイクロリットルのヨウ化プロピジウムで標識します。
別の遠心分離で細胞を採取し、カリング培養物を摂氏37度で2時間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、同じ遠心分離機条件下で細胞を遠心分離し、ペレットを25マイクロリットルの新鮮な不完全なNK細胞培養培地に再懸濁します。フローサイトメトリーで細胞を解析するには、まず、イメージングフローサイトメーターソフトウェアのスタートアップボタンをクリックして、システムをフラッシュします。
次に、散布図ボタンをクリックして4つの散布図を作成し、ダブルポジティブコントロールチューブをロードします。ダブルポジティブコントロールサンプルを使用して、検出器が過負荷にならないように405ミリワットレーザーの所望の強度を決定し、適切な数の細胞数を取得するようにイメージャーを設定します。DIOとPIの両方の検出に適した強度で405ミリワットのレーザーを設定するには、両方の色素とフローサイトメーターの検出範囲に関する経験が必要です。
ダブルポジティブコントロールサンプルの取得が終了したら、DIOのみのコントロールサンプルをロードし、40X対物レンズを選択し、642ミリワットレーザーと明視野チャンネルをオフにします。適切な数の細胞を育種し、ヨウ化プロピジウムのみのサンプルについて取得を繰り返します。すべての制御サンプルを実行したら、405 ミリワットのレーザーと明視野チャンネルを再びオンにし、[強度を設定]をクリックします。
次に、[ファイル取得]タブでカスタムファイル名を入力し、データファイルを保存するフォルダを選択します。次に、取得するセルの数を入力します。最初の実験用サンプルチューブをロードし、Acquireボタンをクリックします。
すべてのサンプルを実行したら、イメージングフローサイトメーター解析ソフトウェアアプリケーションを開き、1つの実験RIFファイルを開きます。[報酬] タブで、[新しいマトリックスの作成] を選択します。ソフトウェアは、単一カラーファイルの選択を求め、それらをマージして、チャネル補正を適用するために選択するマトリックスファイルを作成します。
ビルディングブロック関数を使用して、適切なドットプロットを設定します。次に、統計機能をクリックして、各ゲートのセル番号にアクセスします。この代表的な実験では、示された通りに血液サンプルを採取し、全血1ミリリットルあたりのNK細胞の濃度をランナーごとに測定し、各時点の平均値を測定しました。
ランナーの4人中3人は、運動後にNK細胞数が同様にわずかに増加したことを示しました。その後すぐに急激に減少し、イベント終了後24時間から48時間後にゆっくりと正常に戻りました。平均して、NK細胞数は運動の1.5時間後に減少しましたが、24時間後にはほぼ正常レベルに戻りました。
細胞数を計算した後、NK細胞の細胞傷害性活性は、示されたとおりに直ちに分析され、NK細胞の細胞毒性は平均してすぐに減少し、運動イベントの終了後1.5時間後には、運動後24時間で有意に増加しました。NKの細胞毒性は、有意ではないものの、運動前のレベルと比較して高いままでした。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約4時間で完了できます。
このビデオを見れば、ヒトの血液サンプルからNK細胞数と細胞傷害活性を再現可能な水腫性で取得し、特性評価する方法を十分に理解できるはずです。
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概要
本研究では、ヒト血液検体におけるNK（ナチュラルキラー）細胞数およびNK細胞細胞毒性を、正確かつ迅速に測定するための高度なワークフローについて解説します。本手法は、免疫学研究における理解を深めることができる信頼性の高い結果を提供することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 免疫学
- 細胞生物学
- 臨床研究
背景
- NK細胞は免疫応答において重要な役割を果たします。
- NK細胞の活性を理解することで、治療介入への活用が可能になります。
- 従来の手法では、速度と精度が不十分な場合があります。
- 本研究では、これらの限界を解消するための新しいアプローチを導入します。
研究目的
- ヒト血液サンプル中のNK細胞数を決定すること。
- NK細胞の細胞毒性活性化レベルを評価すること。
- 免疫学的研究のための迅速かつ信頼性の高い手法を開発すること。
使用した手法
- 全血サンプルからのNK細胞の分離。
- サンプル処理への細胞分離機の使用。
- 正確性を期すためのサンプルの自動ラベル付け。
- 試薬識別のための2次元コードリーダーの起動。
主な結果
- 本手法により、実験間での再現性の高い結果が得られます。
- NK細胞数および細胞毒性を迅速に決定できます。
- さらなる免疫学的研究を裏付ける信頼性の高いデータが得られます。
- NK細胞の生物活性に関する疑問を解決できる可能性があります。
結論
- このワークフローは、ヒト試料におけるNK細胞の研究を向上させます。
- 速度、精度、再現性のバランスを実現しています。
- 本手法は、NK細胞を用いた介入研究を促進することが可能です。
よくある質問
産業上の重要性
ナチュラルキラー（NK）細胞の細胞毒性を正確かつ再現性高く測定することは、前臨床および臨床開発における免疫調節介入の評価において極めて重要です。このワークフローにより、ごく少量のヒト全血からNK細胞数と溶菌活性を迅速かつ安定して定量することが可能となり、免疫療法のパイプラインにおけるターゲット検証やメカニズムのデリスキングをサポートします。アッセイのばらつきやユーザーに依存するエラーを低減することで、本手法は初期探索およびトランスレーショナルリサーチにおける予測の信頼性を向上させます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 薬理学的または生物学的介入後のNK細胞の生物活性に関する治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： わずか1 mLの人全血から再現性のあるNK細胞の定量および細胞毒性リードアウトを提供し、サンプル必要量を削減する。
- 予測的価値： 疾患に関連するシステムにおいて、エフェクター細胞の活性を測定可能な細胞毒性結果に結びつけることで、機能的なターゲットバリデーションをサポートする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： イメージングフローサイトメトリーに基づく定量的なリードアウトを生成し、ダブレットやデブリなどの偽陽性と真の細胞毒性イベントを区別します。
- 運用的価値： DiO標識K562標的細胞を用いてエフェクター対標的（E:T）比を1:5に標準化し、時間経過や実験条件下でのアッセイの再現性を可能にします。
- プラットフォーム価値： イメージングフローサイトメトリープラットフォームと互換性があり、各イベントの可視化と偽陰性の排除が可能で、スケーラブルなスクリーニングワークフローをサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：ヒト被験者におけるNK細胞活性の縦断的モニタリングを容易にし、細胞毒性の変化を薬力学的または臨床的なエンドポイントと相関させることが可能になります。
- 運用の価値：データの完全性を損なうことなく、複数の実験的介入を複数の時点にわたってテストでき、適応的試験デザインをサポートします。
- トランスレーショナルな連続性：ヒトに関連したNK細胞機能データを提供することで、探索相でのメカニズムに関する知見と前臨床検証を橋渡しします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットバリデーションからリード化合物の同定、そして前臨床評価に至る創薬の連続的なプロセスに適合しており、特にNK細胞の関与が作用機序となる免疫調節剤において有用です。
- 探索生物学：免疫変調の機能的リードアウトとしてNK細胞の細胞毒性活性化を測定することにより、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：標準化されたラベル化および補正コントロールを備えた、アッセイ準備完了済みの精製NK細胞を提供し、化合物または生物学的製剤のスクリーニングにおける再現性を確保します。
- 分析：統計解析や条件比較に役立つ定量的な従属変数の測定（mLあたりのNK細胞数、%細胞毒性活性化）を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitro細胞毒性アッセイをex vivoのヒト血液反応に結びつけ、臨床応用に向けた予測価値を高めます。
- エンタープライズ再利用：プロジェクト全体でNK細胞の機能評価のための再利用可能な標準ワークフローを確立し、手法の再開発を削減します。
運用的および企業への影響
- 科学的価値： NK細胞介在性メカニズムにおける予測の信頼性を高め、免疫療法開発における誤ったリードを減少させる。
- 運用的価値： 実作業時間を最小限に抑えつつ、迅速かつ安定した結果（約4時間）を提供し、ラボのスループットを向上させる。
- 戦略的価値： パイプラインの早期段階で信頼性の高い免疫力学データを提供することで、より適切なgo/no-go判断を可能にする。
- ポートフォリオへの影響： 再現性のあるNK細胞活性調節に基づいた、リスク調整済みの候補物質の優先順位付けを支援する。
実施上の検討事項
- 細胞分離、フローサイトメトリーのコンペンセーション、およびイメージングベースの解析に関する専門知識が必要です。
- 自動ラベル機能付きの細胞分離装置、およびレーザーと蛍光検出機能を備えたイメージングフローサイトメーターへのアクセスが必須となります。
- ユーザー間および施設間において、試薬量、インキュベーション時間、およびゲーティング戦略の標準化が必要です。
- 代替モデルシステムに適応させる場合は、NK細胞マーカーの検証および標的細胞との適合性の確認が必要になる場合があります。
- 実用上の制限として、NK細胞は操作の遅延に敏感であること、および生存率と機能を維持するために新鮮な血液サンプルが必要であることが挙げられます。
