組織学でMRIをマージするために、3D印刷技術を活用：脳セクショニングのためのプロトコルを

このプロトコルの全般的な目的は、カスタム設計の3Dプリント製脳ホルダーおよびスライサーボックスを作成することで、磁気共鳴画像（MRI）の画像ボリュームと組織切片を正確に整合させることです。このビデオではマーモセットから抽出した脳組織に焦点を当てていますが、このプロトコルは、齧歯類、非人間霊長類、またはヒトなど、あらゆる脳に適用可能です。プロトコルの記載に従ってワークステーションを準備してください。

チューブの20 milliliterの目盛りまで、Fomblinとガーゼを満たします。途中で気泡を取り除くために、ガーゼを圧縮してください。脳のホルマリンを優しく拭き取ります。

次に、脳の前方をチューブの底側にして挿入します。脳の側面にガーゼを詰め、位置を固定してチューブ内で慎重に固定します。チューブの残りの部分をガーゼとFomblinで満たします。

途中で気泡を慎重に取り除きます。その後、キャップをしっかりと締め、チューブをパラフィンで封印します。キャップと、大脳半球間裂の位置を示す線に印を付けます。

次に、チューブをペーパータオルで包み、マークが上部中央にくるようにコイルに挿入します。コイルをMRIスキャナーに挿入してください。撮像および後処理を行うことで、脳のデジタルモデル作成に使用できるT2強調画像が得られます。

MRIを冠状断方向で開きます。次に、変換ツールを使用して、画像を1 millimeter等方性ボクセルにリサンプリングします。続いて、非線形ノイズ除去フィルターを適用します。

ルックアップテーブルの表示を選択します。次に、デュアルしきい値ボタンをクリックします。グラフ上のスライダーをドラッグして、脳全体をカバーするように調整します。

「閾値（最小値/最大値）」セグメンテーションアルゴリズムを使用して、バイナリ脳マスクを作成します。強度グラフの左下、スケールのすぐ下に表示されている値を「下限（Lower limit）」ボックスに入力します。次に「バイナリ（Binary）」を選択し、「閾値反転（Inverse threshold）」のチェックを外します。

形態学的アルゴリズムの「Fill holes（穴埋め）」を選択します。「Process in 2.5D」にチェックを入れます。後脳と皮質の間の隙間を埋めるには、「line VOI」を選択してください。

脳の両側の最も外側にある点において、後脳と皮質を結ぶ接続線を描画します。そのまま脳全体にわたってVOIの接続線を描画し続けてください。最後に、VOIをバイナリマスクに変換します。

Image calculatorを使用して、OR演算を選択し、VOIと脳のバイナリマスクを結合します。「Promote destination image type」を選択します。次に、形態学的アルゴリズムの「Fill holes」を選択します。

次に、「Process in 2.5D」を確認します。アルゴリズムで「Extract surface」を選択し、「Mask image」を選択して名前を入力し、ファイル形式に「ply」を選択します。スライス断面の位置に対応するカッティングボックスのギャップは、脳の前方、後方、またはここで見られる白質病変などの関心領域からの相対的な位置に配置することができます。

ボックスVOIを使用して、脳の周囲にボックスを描画します。このボックスを、予定しているプレートの隙間の厚さに相当するMRIスライス数分だけコピーして貼り付けます。次に、セクションあたりのMRIスライス数分だけ先に進み、前と同様にボックスを配置して、別のブレードの隙間を作成します。

この工程を脳全体で繰り返します。ボックスVOIをバイナリマスクに反転させます。その後、脳に対して以前に行ったように、「Extract surface」を用いて表面を抽出します。

ブレードギャップのバイナリマスクを選択します。Image mathを使用して、それを10,000倍します。次に、Image calculatorを使用して、乗算したバイナリマスクをリサンプリング済みの等方性MRIに加算します。

次に、三平面ビューを選択すると、脳を切断する位置を示すMRIブレードマップが3つの直交ビューで表示されます。Netfabb Professionalで、「Add part」を選択します。その後、「Blade Gap」モデルと「Brain Model」のプライ（plys）を選択してください。

脳モデルを選択し、リペアモードをクリックします。シェル選択ボタンを使用して脳を選択します。次に、選択を他のシェルに切り替え、それらを削除します。

次に修正を適用し、古い部位を削除します。脳を選択した状態で、「移動」を選択します。「原点へ」をクリックし、X、Y、Zのボックスにパラメータを記録します。

これらはブレード間のギャップ位置を維持するために必要です。翻訳をクリックし、ウィンドウを閉じてください。

Blade Gapモデルを選択し、前のステップで記録したパラメータを使用して変換します。Brainモデルを選択し、リペアモードをクリックします。シェル選択ボタンを使用して、脳を選択してください。

次に、「Smooth triangles」を選択します。「Iterations」の数に「4」を入力し、「Prevent volume shrinking」にチェックを入れます。

Reduce Trianglesを選択し、Target Triangle Countボックスに200000と入力します。次にAutomatic repairを選択し、デフォルトの修復を実行します。修復を適用してください。

その後、平滑化した脳モデルをSTL形式でエクスポートします。平滑化した脳モデルをMeshmixerにインポートしてください。スカルプトツールを使用して、ラインVOIで描画した領域を平滑化します。

また、モデルのその他の軽微な欠陥を修正します。平滑化および編集済みの脳モデルをNetfabb Professionalにインポートします。次に、パーツ「brain slicer parts marmoset」を追加します。

Shellsをパーツに変換します。次に、プロトコルに従って各パーツの名前を変更してください。プロトコルに記載されている選択設定を使用して、パーツをクリップアンドドラッグし、脳をボックスの中央に配置します。

パーツをクリックしてドラッグし、ボックス内にある脳の深さを調整します。平滑化・編集済みの脳モデルを選択し、ボックスの切り抜きモデルを選択して、ブーリアン演算を選択してください。脳モデルをクリックして赤色に変えます。

そして、ブーリアン減算を選択します。計算を適用してください。脳が適切に配置されるのを妨げるオーバーハング（はみ出し部分）がないか確認し、チェックボックスにチェックを入れます。

それらを除去する方法については、プロトコルの補足セクションを参照してください。ブレードギャップモデルを選択し、「move」をクリックします。Z位置で記録してください。

ここが最も後方のブレード隙間の位置になります。次にウィンドウを閉じます。ブレインスライサーのパーツからブレード部分を選択し、[移動]をクリックします。

前のステップで得られたZ値を入力します。次に、現在の位置のX値とY値を入力してください。「絶対移動（Absolute Translation）」を選択し、移動を実行します。

「Duplicate」をクリックします。ここで示されているように、切片の厚さが一定である場合は、ブレードの総数、総カウント、およびZカウントを入力し、Z gapボックスに切片の厚さを入力します。その後、「duplicate」を選択します。

ブレインスライサーのパーツからマイクロトームブレードの部品を選択します。ブレード部品で行った操作と同様に、移動と複製を繰り返します。すべてのマイクロトームブレードとメインのブレードホルダーを選択し、「ブーリアン演算」をクリックします。

すべてのMicrotome Bladesを選択して赤色に変え、ブーリアン減算をクリックします。その後、計算を適用します。リペアモードに入り、自動リペアを選択してください。

拡張修復（Extended Repair）を実行し、修復を適用します。ブレードホルダーをSTLとしてエクスポートします。すべてのブレード、メインボックスおよびサブボックス、そして平滑化・編集済みの脳モデルを選択し、ブーリアン演算（boolean operation）をクリックします。

パーツ選択ウィンドウを使用して、メインボックス以外のすべてのパーツを赤色に変更します。次に、ブーリアン減算を選択します。計算を適用してください。

リペアモードに入り、脳を傷つける可能性のある鋭利なエッジのチェックボックスを選択します。これらはNetfabbのリペアモード、またはMeshmixerのスカルプティングツールを使用して修正できます。

次に、「自動修復」を選択します。「拡張修復」を実行し、その後、修復を適用してください。

ブレインボックスをSTL形式で書き出します。Curaで「Load」を選択し、ブレインボックスをインポートします。「Rotate」ボタンをクリックしてください。

次に、クリックしてドラッグし、ボックスを平らに配置します。プロトコルに示されている通りにプリント設定を編集します。その後、ツールパスを保存します。

ブレードホルダーについても同様の手順を行い、オブジェクトを複製します。その後、ツールパスを保存します。プリントベッドに接着剤を薄く塗布した後、プロトコルに記載された設定を用いて、3Dプリンターでブレインボックスとブレードホルダーをプリントします。

プリントが完了した後、脳を切断するための準備を行います。プロトコルに従ってワークステーションを設置してください。脳をボックスの中に慎重に配置し、しっかりと固定されていることを確認します。

マイクロトーム刃を、ブレードホルダーからボックス内の対応する隙間に配置します。保護手袋を着用し、ブレードホルダーをしっかりと押し下げます。ゆっくりと均等に圧力を加え、脳を切断します。

脳の前方から順に、スラブを1枚ずつ取り出します。このアプローチは単純ですが、手法には多くのステップが含まれており、また数種類のソフトウェアを使用するため、研究者は手順を開始する前にユーザーインターフェースに習熟しておく必要があります。このワークフローは、マーモセット脳スライサーボックスを作製するためのプロトコルをまとめたものです。

脳をホルマリンで固定し、150 µmの解像度でT2強調MRIを撮影します。画像処理および閾値設定を行い、バイナリマスクを作成します。その後、3Dモデリングソフトウェアを用いてサーフェスをレンダリングします。

スライサーテンプレートと脳モデルのブーリアン減算により、脳スライサーのデジタルモデルを作成します。次に、脳スライサーボックスを3Dプリンターで出力します。その後、切断のために脳をスライサーボックス内にしっかりと固定します。

脳をスライスした後、生体（In Vivo）および死後MRI画像とスラブの表面写真との視覚的な比較により、複数のスラブにわたって良好な方向の一致が認められます。高解像度の死後MRIと複数の脳スラブから得られたLFB CV染色組織切片とのより詳細な比較により、マーモセット脳のすべての構造において正確かつ一貫した一致が示されました。この多発性硬化症の動物モデルにおいて、動物は脳全体に広がる白質病変を発現します。

この手法を用いることで、生体（In Vivo）MRIで検出された小さな病変を、死後MRIおよび組織切片の両方で追跡することが可能です。また、組織学的解析および死後MRIにより、生体MRIでは見落とされていた病変が明らかになる場合もあります。本例では、生体MRIにおいて、どちらの視索にも病変を示唆する正常な高信号の確実な根拠は認められませんでした。

それにもかかわらず、死後MRIでは視索に信号高強度領域が観察されました。そして、これらの領域はLFB CV組織切片で見られた脱髄病変と直接的に一致していました。したがって結論として、本研究で導入した手法を用いることで、研究者はMRI所見の根底にある病理を正確に評価することが可能となります。

これは、脳に関わる疾患や、炎症および再髄鞘化などの特定の病理学的プロセスのための新規バイオマーカーを同定するための有望なアプローチであると考えられます。