Name: 組織学でMRIをマージするために、3D印刷技術を活用：脳セクショニングのためのプロトコルを (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: 学ぶMRIと組織学の正確な位置合わせプロトコル。3Dプリンターで脳ホルダーとスライサーボックスを作成し、マーモセット脳を用いて放射線学的・病理学的相関を正確に評価する方法を解説します。

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NINDSの学内研究プログラムがこの研究を支援しました。NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facilityに感謝します。ジェニファー・ルフェーヴル氏とセシル・チャーン・チー・イェン氏には、死後MRIの撮影にご協力いただき、ありがとうございました。3Dプリンティングの支援について、John Ostuni氏とSection on Instrumentation Core Facilityに感謝します。この作業の図1は、3D-CoFormプロジェクトの支援を受けて開発されたツールであるMeshLabのスナップショットを使用しています。

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここで説明するプロトコルは、MRIおよび組織学のセクション間の正確な比較を可能にします。プロトコルは、例えば、マーモセットやげっ歯類などのヒトまたは小動物の脳に適用することができる統一フォーマットで提示されています。大（ヒト）に特異的な、脳が強調されている（非ヒト霊長類および齧歯類）小、および添付のビデオや数字の違いは、私たちは、マーモセットでアプリケーションを実証します。アプローチは簡単ですが、この方法は多くの工程だけでなく、ソフトウェアのいくつかのタイプを使用する必要があります。また、潜在的にこの方法の精度に影響を与えるいくつかの問題が言及することが重要です。 インビボ MRIの画質が重要な因子です。 MRIおよび組織学的デジタル画像間の画像解像度の不均衡を最小限に抑えるために、可能な限り最小のMRIボクセルサイズは、使用されるべきです。この概念はまた、死後MRIの画質に適用されます。増加したものの死後MRIにおける取得時間がはるかに高い画像解像度を可能にする、製剤は、気泡に関連する焦点信号抜け等の画像アーチファクトを導入することができます。これらのアーチファクトは、組織の領域を不明瞭だけでなく、その輪郭に影響を与えることができます。また、死後のMRI上の組織の寸法は、定着工程及び持続時間によって影響される可能性があります。 ex vivoでのMRI一致密接取得中スライス幾何設定で、解剖学的ランドマークを利用することによって近似することができるにインビボながらは、非線形登録がまだそれら二つのMRI画像を合わせてより高い精度に到達するのに必要であろう。 脳ホルダーとスライサーのデザインも重要なステップです。脳のデジタルモデルを作成する際に、平滑化アルゴリズムは、わずかに固定された脳のモデルを相対的に大きくすることが適用されます。これは、そのホルダーとスライサーに脳の容易な挿入を可能にし、ホルダーにシャープなエッジを低減します＆＃39; sの輪郭。モデルが大きすぎる場合は、（例えば、5％以上）、脳は死後MRIおよび/または切片中に移動することがあります。別の重要な点は、小脳が適切に3D印刷オブジェクトの内部に配置されるように、脳モデルの設計を適応させることです。小脳は、剖検で脳の抽出中に損傷を受けたとき、これは特に困難な場合があります。 脳スライサーとホルダーを印刷する場合は、3Dプリンタの種類も慎重に選択する必要があります。いくつかのマルチインクジェットプリンタは、支持材料を除去するためにオーブンを用いて後処理を必要とします。これらのプリンタは、防水およびデスクトップ熱溶解積層法（FDM）のプリンタよりも比較的耐久性があるオブジェクトを生成することができますが、サポートを除去するための加熱処理は、わずかに脳の輪郭に対して完全に垂直ではないブレードギャップを作成し、ボックスをワープすることができます。 脳切片プロセスは、別の重要なステップです。目を切断する前に電子スラブへの全脳は、脳が脳スライサーの内側にしっかりと座っていることを確認することが重要です：わずかな圧力が脳に適用される動きがあってはなりません。これにより、ブレードが研究者によって設定された正確な位置で脳を切断できるようにするためであろう。切断時に連続し、バランスのとれた圧力は、両方のブレードホルダーに適用する必要があります。刃の切れ味と組織の剛性に応じて、わずかな横方向の切削運動は、平坦な切断面を維持するのに有利である可能性があります。 パラフィン包埋プロセスはまた、MRIおよび組織学との位置ずれの原因となることがあります。組織のスラブは、埋め込みプロセス中にカセットに対して平らに座っていない場合は、ミクロトームの切断面とスラブの表面の場所との間に傾きがあるでしょう。これは、すべての組織が露出した平面を検索するために使用できないセクションを切断する必要があります。傾きを補正するための一つの方法高等方性の解像度の死後MRIで観察面の角度を変化させることです。しかし、これは通常異方性解像度（典型的には厚の冠状切片）で取得されたin vivoでのMRI上で実行することはほぼ不可能です。 最後に、組織は、同様に（しわ、割れ、折りたたみ）スライドの準備中にホルマリン固定期間およびパラフィン包埋（収縮）の間にいくつかの変形を体験することができます。これらの変形のいくつかは、スライド上に転送する前に水浴中で4~5μmの切片を置くことによって補正することができます。他の変形は、部分的に、死後MRI画像に学的デジタル画像の変形可能な画像coregistrationを実行することによって解決することができます。それにもかかわらず、慎重かつ熟練の練習で変形を最小限に抑えることが組織学セクションにMRIボリュームに一致する最も効果的なアプローチです。 結論として、ここで紹介する方法は、INVを可能にします正確にMRI所見の根底にある病理を評価するestigators。より一般的には、同定および/またはそのような炎症または再ミエリン化のような特定の病理学的プロセスを標的とする調査研究のための新規MRIバイオマーカーを検証するための有望なアプローチです。

生体内MRIは、巨視的なレベルでの組織の完全性の非侵襲的で感度の高い測定を提供します。in vivoで見られるMRI信号強度の変化は、多くの進行中の臨床試験の結果指標です。1 MRIで観察される強度の変化は、脳全体の状況で異常領域を特定することができますが、病理学的プロセスを区別するのに十分な特異性がないことがよくあります。これは、複数の病状が関与する動的プロセスに特に当てはまります。例えば、多発性硬化症(MS)またはその動物モデルでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)、炎症、浮腫、ミエリン分解、軸索破壊、神経膠症、神経細胞死が重複しています。 2、3基礎となる病理に関する必要な特異性を得るためには、MRIで同定された異常組織の組織学に関する知識とともに、状況を考慮に入れる必要があります。
しかし、適切に制御された動物実験であっても、組織学とin vivo MRIの照合は様々な理由から基本的に困難です。まず、組織切片とMRIの間の寸法スケールの違いは数桁です。4次に、適切な比較のために、MRIスライス面の向きは、切断時の脳組織の切片面と一致する必要があります。脳の形状により、脳が平らな面に座っているとき、一貫してまっすぐで正確なカットを行うことは非常に困難です。第三に、潜在的に小さな関心領域(病変、腫瘍など)に比べて脳のサイズが大きいため、組織を処理する病理医にとって「干し草の山に針が刺さる」シナリオが生まれます。第四に、標的組織が見つかった場合でも、元のMRIデータとの関連付けを事実上不可能にするような方法で処理されるのが一般的です。最後に、脳組織の従来の病理学的切片化は、しばしば不正確で一貫性がなく、組織切片とMRI画像との比較をさらに複雑にします。
 これらの課題を克服するための以前の試みは、データおよび/または組織内または組織の周囲に基準マーカーを基準として共登録するための変形アルゴリズムの使用に依存していました。5、6、7、8前者のアプローチでは、データのフォーマット、イメージングアーティファクト、および組織処理によって引き起こされる変更による合併症に特に影響を受けやすい複雑な計算モデルが必要です。4 一方、後者のアプローチは、組織自体を汚染または害する可能性をもたらします。9
ここで説明するアプローチは、in vivo MRIと組織学の間のギャップを埋めるために、死後MRIの使用を通じてモダリティ間の移行を改善します。死後MRIは、in vivoで達成できるよりも高い解像度で脳の3次元(3D)画像を提供し、さらに、脳表面の形態学的に正確なモデルを作成するために必要なデータを提供します。このデジタルモデルを使用して、脳用の3Dプリントカスタムホルダーを作成できます。ブレインホルダーは、慎重な位置決めにより、MRI指向の正確な脳切片化を可能にし、複雑な数学的アルゴリズムの必要性を減らし、ターゲットを絞ったサンプリングのために特定の領域に焦点を当てることを可能にします。
私たちの研究室は最近、人間の10とマーモセットの脳のための死後MRIと3Dプリンティング技術を使用して、カスタムの脳ホルダーとスライサーを作成する新しい方法を導入しました。4 この 2 つの方法により、研究環境における MRI と組織学との相関関係がより正確になり、最終的には MRI 異常の根底にある特定の病理をより深く理解できるようになります。脳をin vivoで時間をかけて繰り返しサンプリングする、慎重に設計された実験は、病理の解釈のための文脈を提供することができ、その結果、MRIの解釈に特異性を加えることができます。ここでは、ヒト以外の霊長類、げっ歯類、またはヒトに由来するあらゆる脳組織に適用できる統一されたフレームワークで修正されたプロトコルを紹介します。マーモセットの切片化に関する詳細な手順と、対応するビデオを提供しています。全体的なプロトコルはあらゆるタイプの脳に適用されますが、MRIの取得と組織サイズの違い、および特定の脳タイプに対処する際に遭遇する課題により、処理される脳のタイプによってアプローチにいくつかの違いがあります。このプレゼンテーションでは、「ヒト」のセクションは、ヒトの脳に特有のプロトコルの違いを示します。

<table><tbody><tr><td>7T/30cm USR AVIII Bruker MRI</td><td>Bruker Biospin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>38 mm Bruker Biospin ボリュームコイル</td><td>Bruker Biospin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fomblin</td><td>Solvay Solexis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon Centrifuge Tubes, ポリプロピレン, 滅菌</td><td>済み Corning</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand ガーゼスポンジ</td><td>Fisher Scientrific</td><td>13-761-52</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルムM 万能実験用フィルム</td><td>ビーミス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカ RM2235 ロータリーミクロトーム&nbsp;</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカ ディスポーザブル ブレード、ロー プロファイル (819)</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クレシル バイオレット アセテート、0.1% 水性</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>26089-01</td><td></td></tr><tr><td>ルクソール ファスト ブルー、0.1% 95% アルコール</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>26056-15</td><td></td></tr><tr><td>ETOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker 2 拡張&nbsp;</td><td>Ultimaker.75</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>kg Ultimaker公式ブランド PLA&nbsp;フィラメント、2.85 mm、シルバーメタリック</td><td>Ultimaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen 2 (Blue Edition)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Netfabb Professional 5.0.1</td><td>Netfabb</td><td>http://www.netfabb.com/professional.php</td><td></td></tr><tr><td>Meshmixer 10.9.332</td><td>Autodesk</td><td>http://www.meshmixer.com/download.html</td><td></td></tr><tr><td>Mipav 7.2</td><td>NIH CIT</td><td>http://mipav.cit.nih.edu</td><td></td></tr><tr><td>Cura</td><td>Ultimaker</td><td>https://ultimaker.com/en/products/cura-software</td><td></td></tr></tbody></table>

組織学でmriをマージするために、3d印刷技術を活用：脳セクショニングのためのプロトコルを

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

磁気共鳴画像法(MRI)は、巨視的なスケールで正常組織と異常組織を区別することを可能にし、組織全体の体積を3次元的にサンプリングします。MRIは組織の異常を検出するための非常に感度の高いツールですが、信号の変化と根本的な病理学的プロセスとの関連は通常簡単ではありません。例えば、中枢神経系では、炎症、脱髄、軸索損傷、神経膠症、神経細胞死など、すべてMRIで同様の所見が引き起こされる可能性があります。そのため、MRIスキャンの解釈は状況に依存し、したがって放射線組織病理学的相関関係が最も重要です。残念ながら、脳組織の従来の病理学的切片化は不正確で一貫性がないことが多く、組織学切片とMRIとの比較を複雑にしています。この記事では、霊長類の脳組織を正確に切片化し、組織学とMRIの正確なマッチングを可能にするための新しい方法論を紹介します。この記事で説明する詳細なプロトコルは、3Dプリントされた脳スライサーの作成に依存するこの方法を適用する際に研究者を支援します。わずかに変更され、人間を含む他の種の脳に簡単に実装できます。

この方法のワークフローは、脳がスライスされると、スラブの表面の表面のMR画像と画像の間の視覚的な比較は、複数のスラブを横切る良好な配向が一致する（図2）を示し、図1に要約されています。スラブをパラフィンに包埋した後、それらは、ミクロトームで切片と染色します。高解像度の死後MRIと染色組織学セクション間のより完全な比較は、マーモセットの脳（図3）の全ての構造を横切って、正確で一貫性の一致を示しています。 MSのこの動物モデルにおいて、動物は、大脳白質全体に広がる白質病変を開発します。これらの病変はMRIを行うことにより、非侵襲的に検出することができます。図4は、MRI所見の病理学的な基板を解明するこの技術の能力を示します。 in vivoでの MRIで検出された小さな病変缶死後MRIおよび組織学の両方で追跡します。挿入図に示すように、病変内の脱髄は、（周囲の組織と比較しhyperintensity）MR信号の変化を駆動する主な要素の一つです。組織学および死後MRIはまた、in vivoでの MRI（図4）に逃した病変を表示することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig1.jpg" /> マーモセットの脳スライサーボックスを作成する1.ワークフロー図 。脳をホルマリン（A1）で固定されており、T2強調MRIは、エッジあたり150マイクロメートル（A2）の等方性ボクセルで取得されています。画像を処理し、バイナリマスク（A3）を作成するために閾値処理されています。表面は、その後、3Dモデリングソフトウェア（A4）でレンダリングされます。スライサーテンプレートと脳モデルとのブーリアン減算は脳スライサー（B1）のデジタルモデルを作成します。脳スライサーボックスは、3Dプリンタ（B2）に印刷されています。脳は、その後、スライサーボックスの中にしっかりと配置されています切断（B3）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig2.jpg" /> 左から右へ図2： 生体内 MRI、死後MRI、および組織スラブ写真で 。スライス平面は、対応するin vivoでの MRIのスライス（A）に比べて視覚的に死後MRI（B）に基づいて設立されました。脳は、その後切断し、そして得られたスラブは、一貫した（C）であることが見出されました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig3.jpg" /> 図3.高解像度の死後MRIおよび組織学セクションマッチング。スラブは、4μmの切片にミクロトームで切断し、パラフィンに包埋し、ファストブルーおよびクレシルバイオレット（B）で染色しました。次いで、切片を視覚的に脳構造（A）に基づいて、100ミクロンのT2 * - 重み付けMRIと一致しました。この画像を取得するための詳細は、プロトコルと表1の脳構造の補足セクションにあります：（1）赤い矢印=内部カプセル、青色の矢印=前交連。 （2）赤い矢印=被殻、青色の矢印=視索。 （3）赤色の矢印=尾状核、青色の矢印=海馬; （4）赤い矢印=脳梁、青色の矢印=中脳水道; （5）赤い矢印=下丘、青い矢印=錐体路。 B1の破線のボックスは、どちらかの脳の切断またはパラフィン包埋中に、エラーが左側の前交連の不一致につながる、Y軸周りのわずかな回転を引き起こしたスライスを示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig3large.jpg" target="_blank">ご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>この図の拡大版。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig4.jpg" /> 図4.組織学セクションにin vivoでの MRIの病変を追跡。 in vivoでの MRIは視神経管（A1）のいずれかに病変を示唆する異常hyperintensity信号のない説得力のある証拠を示しませんでした。しかし、高解像度の死後MRIは、両方の視神経管（A2）の明確なハイパー強烈な行を示しています。 4μmの組織学セクションのファーストブルー/クレシルバイオレット染色は、ex vivo MRIで見られる高強度領域は（A3）の脱髄していることを示しています。大脳白質では、in vivoでの MRIは微妙な左右対称hyperintensity（B1、インセットの拡大）を示しています。高信号領域は、高解像度の死後MRI（B2）の詳細は明らかです。 4μmの組織学セクションのLFB染色は、これらの領域は、（B3）の脱髄していることを示しています。ベースラインIと比較した後、nは生体内MRIとヘマトキシリン・アンド・エオシン染色は、右サイドは、解剖学的異常はなく、脱髄病変であると決定しました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="補足コードファイル" src="/files/ftp_upload/54780/54780supplementalfiles.jpg" /> 補足コードファイル。 Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl： <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> Brain_Slicer_Parts_Human.stl： <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Brain_Slicer_Parts_Human.stl" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> Cap_Insert.stl： <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Cap_Insert.stl" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

このプロトコルの全体的な目標は、正確にカスタマイズされた3Dプリント脳ホルダーとスライサーボックスの作成によって組織学切片で磁気共鳴画像（MRI）画像ボリュームを揃えることです。

組織学でMRIをマージするために、3D印刷技術を活用：脳セクショニングのためのプロトコルを

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

このプロトコルの全般的な目的は、カスタム設計の3Dプリント製脳ホルダーおよびスライサーボックスを作成することで、磁気共鳴画像（MRI）の画像ボリュームと組織切片を正確に整合させることです。このビデオではマーモセットから抽出した脳組織に焦点を当てていますが、このプロトコルは、齧歯類、非人間霊長類、またはヒトなど、あらゆる脳に適用可能です。プロトコルの記載に従ってワークステーションを準備してください。チューブの20 milliliterの目盛りまで、Fomblinとガーゼを満たします。途中で気泡を取り除くために、ガーゼを圧縮してください。脳のホルマリンを優しく拭き取ります。次に、脳の前方をチューブの底側にして挿入します。脳の側面にガーゼを詰め、位置を固定してチューブ内で慎重に固定します。チューブの残りの部分をガーゼとFomblinで満たします。途中で気泡を慎重に取り除きます。その後、キャップをしっかりと締め、チューブをパラフィンで封印します。キャップと、大脳半球間裂の位置を示す線に印を付けます。次に、チューブをペーパータオルで包み、マークが上部中央にくるようにコイルに挿入します。コイルをMRIスキャナーに挿入してください。撮像および後処理を行うことで、脳のデジタルモデル作成に使用できるT2強調画像が得られます。MRIを冠状断方向で開きます。次に、変換ツールを使用して、画像を1 millimeter等方性ボクセルにリサンプリングします。続いて、非線形ノイズ除去フィルターを適用します。ルックアップテーブルの表示を選択します。次に、デュアルしきい値ボタンをクリックします。グラフ上のスライダーをドラッグして、脳全体をカバーするように調整します。「閾値（最小値/最大値）」セグメンテーションアルゴリズムを使用して、バイナリ脳マスクを作成します。強度グラフの左下、スケールのすぐ下に表示されている値を「下限（Lower limit）」ボックスに入力します。次に「バイナリ（Binary）」を選択し、「閾値反転（Inverse threshold）」のチェックを外します。形態学的アルゴリズムの「Fill holes（穴埋め）」を選択します。「Process in 2.5D」にチェックを入れます。後脳と皮質の間の隙間を埋めるには、「line VOI」を選択してください。脳の両側の最も外側にある点において、後脳と皮質を結ぶ接続線を描画します。そのまま脳全体にわたってVOIの接続線を描画し続けてください。最後に、VOIをバイナリマスクに変換します。Image calculatorを使用して、OR演算を選択し、VOIと脳のバイナリマスクを結合します。「Promote destination image type」を選択します。次に、形態学的アルゴリズムの「Fill holes」を選択します。次に、「Process in 2.5D」を確認します。アルゴリズムで「Extract surface」を選択し、「Mask image」を選択して名前を入力し、ファイル形式に「ply」を選択します。スライス断面の位置に対応するカッティングボックスのギャップは、脳の前方、後方、またはここで見られる白質病変などの関心領域からの相対的な位置に配置することができます。ボックスVOIを使用して、脳の周囲にボックスを描画します。このボックスを、予定しているプレートの隙間の厚さに相当するMRIスライス数分だけコピーして貼り付けます。次に、セクションあたりのMRIスライス数分だけ先に進み、前と同様にボックスを配置して、別のブレードの隙間を作成します。この工程を脳全体で繰り返します。ボックスVOIをバイナリマスクに反転させます。その後、脳に対して以前に行ったように、「Extract surface」を用いて表面を抽出します。ブレードギャップのバイナリマスクを選択します。Image mathを使用して、それを10,000倍します。次に、Image calculatorを使用して、乗算したバイナリマスクをリサンプリング済みの等方性MRIに加算します。次に、三平面ビューを選択すると、脳を切断する位置を示すMRIブレードマップが3つの直交ビューで表示されます。Netfabb Professionalで、「Add part」を選択します。その後、「Blade Gap」モデルと「Brain Model」のプライ（plys）を選択してください。脳モデルを選択し、リペアモードをクリックします。シェル選択ボタンを使用して脳を選択します。次に、選択を他のシェルに切り替え、それらを削除します。次に修正を適用し、古い部位を削除します。脳を選択した状態で、「移動」を選択します。「原点へ」をクリックし、X、Y、Zのボックスにパラメータを記録します。これらはブレード間のギャップ位置を維持するために必要です。翻訳をクリックし、ウィンドウを閉じてください。Blade Gapモデルを選択し、前のステップで記録したパラメータを使用して変換します。Brainモデルを選択し、リペアモードをクリックします。シェル選択ボタンを使用して、脳を選択してください。次に、「Smooth triangles」を選択します。「Iterations」の数に「4」を入力し、「Prevent volume shrinking」にチェックを入れます。Reduce Trianglesを選択し、Target Triangle Countボックスに200000と入力します。次にAutomatic repairを選択し、デフォルトの修復を実行します。修復を適用してください。その後、平滑化した脳モデルをSTL形式でエクスポートします。平滑化した脳モデルをMeshmixerにインポートしてください。スカルプトツールを使用して、ラインVOIで描画した領域を平滑化します。また、モデルのその他の軽微な欠陥を修正します。平滑化および編集済みの脳モデルをNetfabb Professionalにインポートします。次に、パーツ「brain slicer parts marmoset」を追加します。Shellsをパーツに変換します。次に、プロトコルに従って各パーツの名前を変更してください。プロトコルに記載されている選択設定を使用して、パーツをクリップアンドドラッグし、脳をボックスの中央に配置します。パーツをクリックしてドラッグし、ボックス内にある脳の深さを調整します。平滑化・編集済みの脳モデルを選択し、ボックスの切り抜きモデルを選択して、ブーリアン演算を選択してください。脳モデルをクリックして赤色に変えます。そして、ブーリアン減算を選択します。計算を適用してください。脳が適切に配置されるのを妨げるオーバーハング（はみ出し部分）がないか確認し、チェックボックスにチェックを入れます。それらを除去する方法については、プロトコルの補足セクションを参照してください。ブレードギャップモデルを選択し、「move」をクリックします。Z位置で記録してください。ここが最も後方のブレード隙間の位置になります。次にウィンドウを閉じます。ブレインスライサーのパーツからブレード部分を選択し、[移動]をクリックします。前のステップで得られたZ値を入力します。次に、現在の位置のX値とY値を入力してください。「絶対移動（Absolute Translation）」を選択し、移動を実行します。「Duplicate」をクリックします。ここで示されているように、切片の厚さが一定である場合は、ブレードの総数、総カウント、およびZカウントを入力し、Z gapボックスに切片の厚さを入力します。その後、「duplicate」を選択します。ブレインスライサーのパーツからマイクロトームブレードの部品を選択します。ブレード部品で行った操作と同様に、移動と複製を繰り返します。すべてのマイクロトームブレードとメインのブレードホルダーを選択し、「ブーリアン演算」をクリックします。すべてのMicrotome Bladesを選択して赤色に変え、ブーリアン減算をクリックします。その後、計算を適用します。リペアモードに入り、自動リペアを選択してください。拡張修復（Extended Repair）を実行し、修復を適用します。ブレードホルダーをSTLとしてエクスポートします。すべてのブレード、メインボックスおよびサブボックス、そして平滑化・編集済みの脳モデルを選択し、ブーリアン演算（boolean operation）をクリックします。パーツ選択ウィンドウを使用して、メインボックス以外のすべてのパーツを赤色に変更します。次に、ブーリアン減算を選択します。計算を適用してください。リペアモードに入り、脳を傷つける可能性のある鋭利なエッジのチェックボックスを選択します。これらはNetfabbのリペアモード、またはMeshmixerのスカルプティングツールを使用して修正できます。次に、「自動修復」を選択します。「拡張修復」を実行し、その後、修復を適用してください。ブレインボックスをSTL形式で書き出します。Curaで「Load」を選択し、ブレインボックスをインポートします。「Rotate」ボタンをクリックしてください。次に、クリックしてドラッグし、ボックスを平らに配置します。プロトコルに示されている通りにプリント設定を編集します。その後、ツールパスを保存します。ブレードホルダーについても同様の手順を行い、オブジェクトを複製します。その後、ツールパスを保存します。プリントベッドに接着剤を薄く塗布した後、プロトコルに記載された設定を用いて、3Dプリンターでブレインボックスとブレードホルダーをプリントします。プリントが完了した後、脳を切断するための準備を行います。プロトコルに従ってワークステーションを設置してください。脳をボックスの中に慎重に配置し、しっかりと固定されていることを確認します。マイクロトーム刃を、ブレードホルダーからボックス内の対応する隙間に配置します。保護手袋を着用し、ブレードホルダーをしっかりと押し下げます。ゆっくりと均等に圧力を加え、脳を切断します。脳の前方から順に、スラブを1枚ずつ取り出します。このアプローチは単純ですが、手法には多くのステップが含まれており、また数種類のソフトウェアを使用するため、研究者は手順を開始する前にユーザーインターフェースに習熟しておく必要があります。このワークフローは、マーモセット脳スライサーボックスを作製するためのプロトコルをまとめたものです。脳をホルマリンで固定し、150 µmの解像度でT2強調MRIを撮影します。画像処理および閾値設定を行い、バイナリマスクを作成します。その後、3Dモデリングソフトウェアを用いてサーフェスをレンダリングします。スライサーテンプレートと脳モデルのブーリアン減算により、脳スライサーのデジタルモデルを作成します。次に、脳スライサーボックスを3Dプリンターで出力します。その後、切断のために脳をスライサーボックス内にしっかりと固定します。脳をスライスした後、生体（In Vivo）および死後MRI画像とスラブの表面写真との視覚的な比較により、複数のスラブにわたって良好な方向の一致が認められます。高解像度の死後MRIと複数の脳スラブから得られたLFB CV染色組織切片とのより詳細な比較により、マーモセット脳のすべての構造において正確かつ一貫した一致が示されました。この多発性硬化症の動物モデルにおいて、動物は脳全体に広がる白質病変を発現します。この手法を用いることで、生体（In Vivo）MRIで検出された小さな病変を、死後MRIおよび組織切片の両方で追跡することが可能です。また、組織学的解析および死後MRIにより、生体MRIでは見落とされていた病変が明らかになる場合もあります。本例では、生体MRIにおいて、どちらの視索にも病変を示唆する正常な高信号の確実な根拠は認められませんでした。それにもかかわらず、死後MRIでは視索に信号高強度領域が観察されました。そして、これらの領域はLFB CV組織切片で見られた脱髄病変と直接的に一致していました。したがって結論として、本研究で導入した手法を用いることで、研究者はMRI所見の根底にある病理を正確に評価することが可能となります。これは、脳に関わる疾患や、炎症および再髄鞘化などの特定の病理学的プロセスのための新規バイオマーカーを同定するための有望なアプローチであると考えられます。

utilizing-3d-printing-technology-to-merge-mri-with-histology-protocol

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