組織学でMRIをマージするために、3D印刷技術を活用：脳セクショニングのためのプロトコルを

このプロトコルの全体的な目標は、カスタマイズされた3Dプリントされたブレインホルダーとスライサーボックスを作成することにより、磁気共鳴画像画像ボリュームを組織学セクションと正確に位置合わせすることです。このビデオはマーモセットから抽出された脳組織に焦点を当てていますが、このプロトコルは、げっ歯類、非ヒト霊長類、またはヒトのいずれに由来する脳にも適用できます。プロトコルの説明に従ってワークステーションを準備します。

チューブにフォンブリンとガーゼを20ミリリットルのマークまで満たします。ガーゼを圧縮して、途中で気泡を取り除きます。ホルマリンの脳をやさしく乾かします。

次に、前面がチューブの底に向かって脳を挿入します。脳の側面にガーゼを使用して脳をチューブ内に慎重に固定し、その位置を固定します。チューブの残りの部分をガーゼとフォンブリンで満たします。

途中で気泡を慎重に取り除きます。次に、キャップを固定し、チューブをパラフィンで密封します。キャップと線を半球間の亀裂でマークします。

次に、チューブをペーパータオルで包み、マークを上部中央の位置にしてコイルに挿入します。コイルをMRIスキャナーに挿入します。取得と後処理の後、脳のデジタルモデルを作成するために使用できるT2重み付け画像が得られます。

MRIを冠状にして開きます。次に、変換ツールを使用して、画像を 1 ミリメートルの等方性ボクセルにリサンプリングします。次に、非線形ノイズリダクションフィルタを適用します。

select ディスプレイはテーブルを検索します。次に、デュアルしきい値ボタンをクリックします。グラフ上のスライダーをドラッグして、脳全体を覆います。

セグメンテーションアルゴリズムの「Threshold using min/max」を使用してバイナリブレインマスクを作成します。強度グラフの左下隅、スケールのすぐ下にある値を「Lower limit」ボックスに入力します。次に、[バイナリ] を選択し、[逆しきい値] のチェックを外します。

モルフォロジーアルゴリズムの穴を埋めるを選択します。2.5Dでプロセスを確認します。後脳と皮質の間のギャップを埋めるには、ラインVOIを選択します。

後脳と脳の両側の皮質との間の最も外側の点で接続を引き込みます。脳を通じてVOI接続を描き続けます。VOI をバイナリ マスクに変換します。

Image calculator を使用して、OR 演算を選択することで VOI マスクと brain Binary マスクを組み合わせます。「宛先のイメージ・タイプを昇格」を選択します。次に、形態素アルゴリズムの穴を埋め

そして、2.5Dのプロセスを確認します。アルゴリズム Extract surface Select Mask image を選択し、名前を入力してから、ファイルタイプ ply を選択します。スライス平面の位置に対応する切断ボックス内の隙間は、脳の前部、脳の背面から、またはここで見られる白質の病変などの関心領域に対して配置できます。

ボックスVOIを使用して、脳の周りにボックスを描きます。ボックスをコピーして、目的のプレートギャップの厚さに対応するMRIスライスの数に貼り付けます。次に、セクションごとのMRIスライスの数だけスキップし、前に行ったようにボックスをピースして、別のブレードギャップを作成します。

このプロセスを脳で繰り返します。ボックスの VOI をバイナリ マスクに反転します。次に、前に脳に対して行ったように [サーフェスの抽出] を使用してサーフェスを抽出します。

ブレードギャップのバイナリマスクを選択します。画像演算を使用して、10, 000を掛けます。次に、Image calculator を使用して、乗算された Binary マスクをリサンプリングされた等方性 MRI に追加します。

これで、トライプラナービューを選択すると、脳がスライスされる位置を示すMRIブレードマップを3つの直交ビューで見ることができます。Netfabb Professional で、[パーツの追加] を選択します。次に、Blade GapモデルとBrain Model plysを選択します。

ブレインモデルを選択し、修復モードをクリックします。シェル選択ボタンを使用して、頭脳を選択します。次に、選択を他のシェルに切り替えて削除します。

次に、修理を適用し、古い部品を取り外します。頭脳を選択した状態で、移動 を選択します。をクリックして原点に移動し、X、Y、Zボックスにパラメータを記録します。

これらは、ブレードギャップの位置決めを維持するために必要です。translateをクリックします。そして、ウィンドウを閉じます。

ブレードギャップモデルを選択し、前の手順で記録したパラメータを使用して変換します。Brainモデルを選択し、修復モードをクリックします。シェル選択ボタンを使用して、頭脳を選択します。

次に、[三角形のスムージング] を選択します。イテレーションの数に 4 を入力します。そして、ボリュームの縮小を防ぐにチェックを入れます。

「トライアングルの削減」を選択し、「ターゲット・トライアングル数」ボックスに 200000 と入力します。次に、[自動修復] を選択し、既定の修復を実行します。修理を適用します。

次に、平滑化された脳モデルを STL としてエクスポートします。スムージングされた脳モデルをMeshmixerにインポートします。スカルプトツールを使用して、ラインVOIで描画する領域を滑らかにします。

また、モデルのその他の小さな欠陥を修正します。スムージングおよび編集された脳モデルをNetfabb Professionalにインポートします。次にパーツを追加し、ブレインスライサーパーツはマーモセットです。

「シェルから部品へ」を選択します。次に、プロトコルで説明されているように各パーツの名前を変更します。プロトコルに記載されている選択設定を使用して、パーツをクリックしてドラッグし、脳をボックスの中央に配置します。

パーツをクリックしてドラッグし、ボックス内の脳の深さを調整します。平滑化され、編集された脳モデルを選択し、ボックスカットアウトモデルでブール演算を選択します。脳モデルをクリックすると、赤に変わります。

そして、ブール減算を選択します。計算を適用します。脳が適切に配置されるのを妨げるオーバーハングのチェックボックスをオンにします。

それらを削除する方法については、プロトコルの補足セクションを参照してください。ブレードギャップモデルを選択し、移動をクリックします。Z 位置で記録します。

これが最も後方のブレードギャップの位置になります。次に、ウィンドウを閉じます。ブレインスライサーパーツからブレードパーツを選択し、「移動」をクリックします。

前の手順の Z 値を入力します。そして、現在の位置のXとYの値を入力します。「絶対翻訳」を選択し、翻訳します。

「複製」をクリックします。断面の厚みが一貫している場合は、ここに示すように、合計ブレード番号と合計カウントとZカウントを入力し、Zギャップボックスに断面の厚みを入力します。次に、[複製] を選択します。

ブレインスライサーパーツからマイクロトーンブレードパーツを選択します。ブレード部分で行ったのと同じ移動手順と複製手順を繰り返します。すべてのミクロトームブレードとメインブレードホルダーを選択し、ブール演算をクリックします。

すべてのミクロトームブレードを選択して赤に変え、ブール減算をクリックします。次に、計算を適用します。修復モードに入り、[自動修復]を選択します。

拡張修復を実行し、修復を適用します。ブレードホルダーをSTLとしてエクスポートします。すべてのブレード、メインボックスとサブボックス、およびスムージングおよび編集されたBrainモデルを選択し、ブール演算をクリックします。

[パーツ] 選択ウィンドウを使用して、メイン ボックスを除くすべてのパーツを赤にします。次に、ブール減算を選択します。計算を適用します。

修復モードに入り、脳を傷つける可能性のある鋭いエッジのチェックボックスをオンにします。これらはNetfabb修復モードで修復できます。または、Meshmixerのスカルプトツールを使用します。

次に、[自動修復] を選択します。拡張修復を実行します。その後、修理を適用します。

ブレインボックスをSTLとしてエクスポートします。Curaで、[Brain Boxをロードしてインポート]を選択します。[回転]ボタンをクリックします。

次に、クリックしてドラッグし、ボックスを平らに置きます。プロトコルに示されているように印刷設定を編集します。次に、ツールパスを保存します。

ブレードホルダーについても同じプロセスに従い、オブジェクトも複製します。次に、ツールパスを保存します。プリントベッドに接着剤の薄い層を塗布した後、プロトコルに記載されている設定を使用して、3Dプリンターでブレインボックスとブレードホルダーを印刷します。

プリントが完了したら、脳を切断する準備をすることができます。プロトコルの説明に従ってワークステーションをセットアップします。脳を箱に慎重に配置し、しっかりと固定されていることを確認します。

ブレードホルダーのミクロトームブレードをボックスの対応する隙間に合わせます。保護手袋を着用し、ブレードホルダーをしっかりと押し下げます。ゆっくりとバランスの取れた圧力を加えて脳を切断します。

スラブを脳の正面から一度に1つずつ取り外します。このアプローチは単純明快ですが、この方法には多くのステップが必要であり、いくつかの種類のソフトウェアを使用するため、研究者は手順を開始する前にユーザーインターフェースに精通する必要があります。このワークフローは、マーモセットの脳のスライサーボックスを作成するためのプロトコルをまとめたものです。

脳はホルマリンで固定され、T2強調MRIは150ミクロンで取得されます。画像は処理され、しきい値が設定されたため、バイナリ マスクが作成されます。その後、サーフェスは3Dモデリングソフトウェアでレンダリングされます。

スライサー テンプレートとブレイン モデルの間のブール減算により、ブレイン スライサーのデジタル モデルが作成されます。その後、ブレインスライサーボックスを3Dプリンターでプリントします。その後、脳をスライサーボックスにしっかりと入れて切断します。

脳をスライスすると、In Vivo と死後の MRI 画像とスラブの表面表面の画像を視覚的に比較すると、複数のスラブ間で向きが良好に一致していることが明らかになります。高解像度の死後MRIと複数の脳スラブのLFB CV染色組織学切片とをより徹底的に比較すると、マーモセット脳のすべての構造で正確で一貫した一致が示されています。この多発性硬化症の動物モデルでは、動物は脳全体に広がる白質病変を発症します。

この技術を使用すると、In Vivo MRIで検出された小さな病変を、死後MRIと組織学セクションの両方で追跡できます。組織学と死後MRIは、In Vivo MRIでは見逃されていた病変を明らかにすることもできます。ここでは、In Vivo MRIは、どちらの視路にも病変があることを示唆する正常な高信号に関する説得力のある証拠を示しませんでした。

それにもかかわらず、死後MRIでは、視路の信号高信号が観察されました。そして、これらの領域は、LFB CV組織学セクションで見られる有髄性病変と直接対応していました。したがって、結論として、ここで紹介した方法論により、研究者はMRI所見の根底にある病理を正確に評価できます。

これは、脳が関与する疾患や、炎症や再髄鞘形成などの特定の病理学的プロセスに対する新しいバイオマーカーを特定するための有望なアプローチであると考えています。