Name: ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学ぼう、ナノスケールPCRを用いた犬と馬の呼吸器病原体のハイスループット検出法。リアルタイムPCRでDNA・RNA病原体を同時検出し、OneHealth監視を支援する効率的な診断技術です。

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ここで説明する呼吸器病原体アッセイの作業はコーネルアニマルヘルス診断センター内部開発資金によってサポートされていました。ナノスケールのPCRワークフローと関連する品質保証システムの開発は、部分的に（FOA PA-13から244）資金を提供し、助成金番号1U18FD005144-下に食品医薬品局（FDA）の獣医研究所調査・対応ネットワーク（FDA獣医-LIRN）と共同で実施しました01。出版料はVWRとクアンタBiosciences社が主催しました。私たちは、書き込みやプロトコルの見直しとその支援のためにガブリエル・ニッカーソン、Roopa Venugopalan、Veldinaカモ、XiuLin張、Jinzhiゆう、Weihua王、およびカトリーナウォーカーに感謝します。私たちは、作者のインタビューを撮影するためのマイク・キャロルに感謝します。我々は最終的に彼らの役に立つコメントのためのエディタと3匿名の査読をお願いいたします。

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</ol>

マーシャ・スレーターとエレンオルテンベルクは、この記事で使用する試薬および器具を生産サーモフィッシャーサイエンティフィック社の従業員です。

この手順は、6ヶ月（週2~3回）にわたって我々の研究室での呼吸器病原体のルーチン試験に使用されてきました。また、個別にカスタマイズされたプレート上の糞便サンプルおよび細菌分離株における腸管病原体プロファイリングのために同じ手順を使用して成功を収めています。プレートが生産されると、経験豊富なスタッフが一つの標準勤務時間内の2-7のステップを完了することができます。最も重要なステップは、プリアンププレート、（蒸発を防ぐために迅速に行わなければなりません）プレート間の前置サンプルの転送、および増幅プレートの最終的なカバーの適切なシールです。それが大幅にこのプロセスに必要な時間や事務処理の量を減少させたとして結果の分析（サンプルおよびコントロールの曲線をチェックする）ためのガイドとして、マクロのスプレッドシートを使用することも重要でした。提供マクロスプレッドシートは一例です。それは、異なる構成を有する板のために修正または再作成する必要があります。これは簡単にPEすることができます基本的なスプレッドシートの知識を持つ誰かによってrformed。 増幅板（33 NL）上にロードしたサンプルの非常に少量に、前増幅が必要とされます。このプロトコル（図示せず）の最適化では、増幅前にマスターミックス、ランダムプライマーの添加、サイクル数、アニール時間、および希釈を含む前置増幅パラメータの数を比較しました。各ターゲットは独自の最適な条件を持っていて、ここに記載されているものは、私たちのパネルの全体的な検出の最高の限界をもたらしたものを表します。このパネルには、ルーチン獣医の診断テストで検出された病原性ターゲットとサンプルタイプの広い範囲をカバーしていますが、プリアンプ手順への変更は、異なるパネルのために必要になることがあります。製造者に最適化された増幅条件は、95℃、アンでの変性、続いて95℃の酵素活性化で10分間で標準プローブベースのリアルタイムPCRプロトコルに基づいています60℃でのイーリング/エクステンション。プライマーおよびプローブはまた、メーカーに最適化された条件、したがって、滴定を必要としないを使用して、プレート上に予め印刷されています。 （関係なく、ターゲットのタイプの）全ての試料について、逆転写および予備増幅工程を組み合わせることで、ワークフローの効率を維持するために必要でした。全てのサンプルが逆転写し持つことも、感度を最大化するために有益です。さらに、阻害剤を最小限に抑えるために最適化されたプリアンプ用マスターミックスの使用は、同じプレート上の異なるサンプルタイプを組み合わせることで汎用性を可能にします。 シュウらによって記載された疾病管理センター（CDC）インフルエンザマトリックスアッセイ。7およびナノリットルスケールの反応のためにここに適合した人間とコンパニオンアニマルからサンプルをテストするのに適しているアッセイ普遍的なインフルエンザです。これは、マイクロリットルスケールのレアを使用して、すべてのA型インフルエンザウイルスのマトリックス遺伝子の普遍的検出のために設計されましたctions。これは、CDCヒトインフルエンザウイルスパネルとCDC豚インフルエンザパネルの一部として世界中で使用されています。ここで適応EHV-1アッセイ8は、流産や神経疾患（Pusterlaとハッセー10によってレビュー）を引き起こす可能性があります馬の重要な呼吸器病原体を検出します。種に依存しない内部対照とのハイスループットプラットフォームにこれらのテストを適応の重要性は、それらがOneHealth監視手法に組み込むことができることです。高スループットのテストプラットフォーム上でこれらのアッセイの両方を持つことは、臨床施設、避難所、およびパフォーマンスイベントのための緊急事態への準備を容易にするであろう。 上記の結果は、分析的な性能にかなり多くの変動を示したマイコプラズマカニクイザルを除いて、プレート上のすべてのターゲットの代表でした。これは、理想的には58〜60となるべきであるプライマーの次善の融解温度（T m）に思われました＃176; C（理想的なプローブのTmは、68から70℃です）。このプラットフォームの制限は、それが迅速に配列を変更する能力を制限する個々のプローブを、注文の場合よりもプレートの設計、製造に時間がかかることです。一般に、リアルタイムPCRの他の制限は、新規または予期しない病原体を検出することができないことです。これは、複数の種における配列に一致するアッセイを設計することによってある程度克服することができますが、公平な全ゲノムシーケンシングベースの方法論は、新規薬剤の発見のために、より適しています。11,12 ナノスケールのリアルタイムPCRは、シンドロームベースではなく、高スループット分子診断における試薬や人件費を低減するために有用である種ベースのテストのための新しいパラダイムを可能にします。このアプローチによる大規模なパネルテストは、ダンとGurfield 13とMoutailler ら 14に記載されているようなOneHealthサーベイランスを容易にすることができます。初期のスワブサンプルの収集、一般的に臨床的発症の3日以内に、呼吸器病原体の存在を同定するための最良の機会を提供します。感染症の出現は、多くの場合、予測不可能であり、および試薬の変更を必要とすることなく、異なる種に対して実行できるテストは準備のために理想的です。この技術の将来のアプリケーションはpathotyping、抗菌薬耐性プロファイリング、さらにシンドロームベースの臨床診断のパネルにある可能性が高いです。ナノスケールリアルタイムPCRは、複数のサンプルの病原体タイプの迅速、ハイスループットスクリーニングのために最も有用であり、新しく出現する病原体を同定するための公平なまたは部分的にバイアスされたシークエンシングに基づくアプローチによって補完されます。

単一疾患のためにテストされている多数のサンプルに使用しない限り、ヒトおよび動物のための臨床診断における複数のエージェントの迅速かつ包括的に検出するための需要が、病原体検出のための単一の生物の分子診断方法は厄介です。獣医学的文脈では、ハイスループット診断方法が原因種の多種多様な病原体をカバーするための追加の必要性に特に重要です。食品媒介性疾患の管理や新興病原体サーベイランスのために近づくOneHealth細菌、ウイルス（DNAまたはRNAベース）、寄生虫、および真菌の数を含むテストのニーズの一例です。テスト効率を向上させるために一緒に複数の検体（多重化）のためのテストを組み合わせることへの挑戦は、感度の損失の可能性と最適化およびアッセイの検証のための大きな負担となっています。 ナノリットルスケールリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を変更であります多くの別々の反応は、同じ試料1上で同時に実行することを可能にする多重化の実施にネイティブ。 OpenArrayプラットフォームは、この原則2のアプリケーションです。それは、リアルタイムPCRとマイクロアレイ技術を兼ね備えています。空間多重化の概念に基づいて、すべてのサンプルは、貫通孔別個で多数のターゲットのために試験されます。このプラットフォームは、最初はシアニン系の二本鎖DNA結合化学2を使用し、暗い消光プローブ3を用いて、プローブベースの化学的性質のために利用できるようになりましたました。このプラットフォームは、主に人間4及び動物5に遺伝的プロファイリングに使用されています。最近、Grigorenko らによって血液由来DNA及びRNAの病原体を検出するように適合された。6二段階の逆転写/プレ増幅（プリアンプ）の手順を使用して。 ここでは、呼吸秒で病原体の両方のタイプを検出するためのワンステッププリアンプベースの手順を説明しますretionsと標準勤務時間内で完全に行うことができ、他の様々なサンプルタイプ。ワンステップのプリアンプが完了すると、サンプルは、このナノスケールPCRプラットフォームに付属の自動液体ハンドリングシステムによって受け入れられるフォーマットで384ウェルプレートに移します。システムは、一度に最大4枚のプレート（192検体およびコントロール）の表面を横切ってマスターミックスとサンプルを描画します。このロード処理の後、我々はサンプルが増幅され、1枚のプリントページに収まるの表に、各サンプル/ターゲットの組み合わせの3技術的反復の平均をまとめたマクロスプレッドシートを用いて分析する方法について説明します。 このプラットフォームを使用したサンプルから抽出したDNAおよび/またはRNAを分析するための統一された方法を確立しました。サンプルの多種多様なエラーの可能性を最小限に抑え、逆転写され、抽出された96ウェルフォーマットで事前に増幅しました。テストした呼吸サンプルは鼻腔スワブ、深い咽頭スワブを含め、トランス気管洗浄液、気管支肺胞洗浄液、および肺組織。試験された薬剤のいくつかはまた、末梢血または糞便中に存在することができるので、我々は、プロシージャに、サンプルのこれらのタイプを組み込みました。この合理化されたワークフローは、個々のテストの代わりにパネルベースの病原体や毒素遺伝子の検出によって、効率的なテストを可能にすることによって、複数のプレートで実験を実行するに比べて時間とリソースを節約するのに役立ちます。ここで実証した呼吸器パネルは18アッセイは、各プレートあたり48サンプルまで収容、スルーホール三重に印刷されていました。検出されたウマの病原体は、ウマアデノウイルス1及び2、ウマ動脈炎ウイルス、ウマ鼻炎ウイルスA及びB、ウマヘルペスウイルス（EHV）タイプ1及び4、及びストレプトコッカス・エクイを含んでいました 。イヌの病原体は、イヌ呼吸器コロナウイルス（betacoronavirus）、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌニューモ、 気管支敗血症菌、およびマイコプラズマカニクイザルが含まれていました 。 Aユニバーサルインフルエンザアッセイおよび内部統制（MS2 RNAファージ）も含まれていました。

<table><tbody><tr><td>Zap-OGlobin II 溶解試薬</td><td>ベックマン・コールター</td><td>7546138</td><td>血液サンプルを調製するためのオプションの試薬です。</td></tr><tr><td>抽出キット (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>AM1840</td><td>その他、目的のサンプルタイプに適した抽出キットを代用することができます。このキットには、PBS、溶解バッファー、および洗浄バッファーが付属しています。</td></tr><tr><td>2x ワンステップ RT-qPCR ミックス (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix)</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95134-500</td><td></td></tr><tr><td>遺伝子特異的プライマープール</td><td>IDT</td><td>カスタムオーダー</td><td>ユーザーが作成することも、増幅プレートと一緒に購入することもできます。</td></tr><tr><td>ランダムプライマーミックス</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>スタンダード96ウェルプレート</td><td>サーモフィッシャー/アプライドバイオシステム</td><td>N8010560</td><td>これは、使用される従来のPCR装置に収まる任意のプレートにすることができます。</td></tr><tr><td>増幅マスターミックス(OpenArray master mix)</td><td>サーモフィッシャー/Applied Biosystems</td><td>4462164</td><td></td></tr><tr><td>透明粘着シール</td><td>サーモフィッシャー</td><td>430611</td><td></td></tr><tr><td>ホイルシール</td><td>エクセルサイエンティフィック</td><td>AF-100</td><td></td></tr><tr><td>384ウェルプレート</td><td>サーモフィッシャー/アプライドバイオシステムズ</td><td>4482221</td><td></td></tr><tr><td>増幅プレート(QuantStudio 12K Flex OpenArrayプレート)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4470813</td><td>標準的なTaqMan条件に適合する任意のアッセイでカスタマイズできます。&nbsp;</td></tr><tr><td>アクセサリーキット</td><td>サーモフィッシャー/アプライドバイオシステム</td><td>ズ 4469576</td><td>ケースの蓋、プラグ、液浸液が含まれています。</td></tr><tr><td>AccuFill tips</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457246</td><td></td></tr><tr><td>増幅装置 (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4471090</td><td></td></tr><tr><td>リキッドハンドラー (OpenArray AccuFill System)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457243</td><td>増幅装置と一緒に購入します。</td></tr><tr><td>プライマー設計ソフトウェア(Primer Express)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4363991</td><td>プライマーとプローブの詳細な仕様については、製造元の指示書を参照してください。</td></tr><tr><td>画像解析プログラム (ImageJ)</td><td>NIH</td><td></td><td>Available at http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Spreadsheet program (Excel)</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Available at https://products.office.com/en-us/excel</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo-Fisher/Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Tissue disruptor (TissueLyser II)</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Conventional thermal cycler (Veriti)</td><td>サーモフィッシャー/アプライドバイオシステム</td>ズ <td>4375786</td><td>加熱された蓋を備えた従来のサーマルサイクラーであれば、どれでも使用できます。</td></tr><tr><td>PCRプレートスピナー</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>この装置は、1つの速度(2,500 rpm)のみを持ち、蓋を閉じるとローターが始動し、ボタンを押すと停止します。</td></tr><tr><td>TE バッファー</td><td>ミリポア</td><td>8890-100ML</td><td>10 mM トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン塩酸塩、1 mM エチレンジアミン四酢酸、pH 8.0</td></tr></tbody></table>

ナノスケールpcrによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

ナノリットルスケールリアルタイムPCRは、複数のアッセイが一緒に反応を組み合わせた一般的な欠点がない単一のプレート上で並行して実行できるように空間多重化を使用します。私たちは、急速に急性呼吸器疾患でイヌやウマの一般的な疾患の薬剤の存在を同定するために、この原理に基づいてパネルを設計し、評価しました。この原稿は、マイクロリットルスケールの反応とは異なる手順に焦点を当て、サンプル調製、増幅、および標的病原体配列の分析のためのナノスケール診断PCRワークフローを記載しています。提示呼吸パネルでは、18アッセイは、各プレートあたり48サンプルまで収容、三重に設定しました。ユニバーサル抽出および増幅前のワークフローは、複数の行列及びDNAとRNAベースの病原体を収容するためにハイスループット試料調製のために最適化しました。代表的なデータを1つのRNAターゲット（インフルエンザマトリックス）と1つのDNA標的（ウマヘルペスウイルスのために提示されています1）。迅速かつ正確に病原体の包括的、シンドロームベースのグループをテストする能力は、診断テストの効率性と人間工学を改善するため、および急性呼吸器疾患の診断と管理のための貴重なツールです。

結果は、ポジティブコントロールルーチン診断試験のために提出臨床サンプルの組み合わせによる代表的なRNAアッセイ（インフルエンザマトリックス）とDNAアッセイ（EHV-1）のために、図1および図 2に示されています。この典型的な反応を通じて放出された蛍光シグナルは、1サイクル当たりの生の蛍光値をプロットし、図1に示されています。すべての相対サイクル閾値（Ct）値は、自動的に増幅マシンソフトウェアによって生成されました。バックグラウンド蛍光は、Ct値を計算する前に蛍光読み取りに組み込むのではなく、負荷品質の評価のための別個の測定基準として使用しました。 各ターゲットの検出（LOD）の分析限界は95％の検出レベルでのCt値の全体平均値プラスのコントロールのプールで2標準偏差に基づいて算出しました。すべてのターゲット。複製の少なくとも95％が代表的なアッセイのために陽性であった最高希釈は50コピーでした。 5コピーの検出は、複製の50％に成功しました。どちらのアッセイは、以下の1コピーで検出されました。 RNAおよびDNA分析のためのLODは、21.92と20.05のCt値で計算しました。これらの値は、疑わしい対として正の（潜在的にではない反復）の報告値のカットオフであると考えられました。 ターゲットの分析的性能の他の側面は、3つの異なる日（ 図2）で実行プール陽性対照の連続希釈を用いて評価しました。代表的なRNAとDNAのアッセイの平均効率は101.1パーセントと106.6パーセントでした。すべてのターゲットの全体の平均効率は101.3パーセントでした。アッセイはまた、良好な直線性（R 2&gt; 0.98）を有していました。複製中の変動はスルーホール一般的に、臨床サンプルについての0.2の標準偏差内でしたDコントロール。標的のいずれかとの間の交差反応性は観察されませんでした。 補足ファイル内の最終結果のワークシートは、10臨床診断サンプルおよび4を制御するための代表的な定量的な結果を示しています。臨床サンプルは日常鼻/口咽頭スワブ、肺組織、および糞便サンプルを含む試験した試料の種類のサブセットです。このセット内の1つ（馬）糞便サンプルは、サンプル中の阻害剤の存在を示して失敗したMS2内部統制を、示しています。これは、典型的に溶出された試料および/または再抽出の希釈によって管理されています。ここでそうであるように、負の増幅制御は、すべてのターゲットに対して否定的であるべきであり、負の抽出制御は、内部コントロールが含まれている必要があります。臨床セットでは、サンプルがbetacoronavirus、 気管支敗血症菌 、イヌジステンパーウイルスA、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌニューモ、およびインフルエンザのためのCt値を生成しA. <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54781/54781fig1.jpg" /> 図1増幅プロット。蛍光読み取りはRNAアッセイ（A）およびDNAアッセイ（B）用の増幅サイクルに対してプロットされています。三角形はCt値を表す示されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54781/54781figure2.jpg" /> 図2.標準曲線を3つの異なる日に試験したRNAおよびDNAアッセイの標準曲線は、ポジティブコントロールを使用して、増幅の直線範囲を示すためにプロットされています。 RNA（A）又はDNAのコピー数のサイクル閾値（Ct）値は対数に対してプロットされている（10）（ <strong&gt; B）標準。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/54781/54781table1.jpg" /> 増幅プレート及びターゲット位置の表1に概略図。このプラットフォーム上でナノスケールのリアルタイムPCR試験のために使用したプレートは、顕微鏡スライドのサイズであり、貫通孔64の48サブアレイに配置され、貫通孔3,072の合計個々の反応のために。一つのサブアレイは三連で18ターゲットに、ここに示されています。各試料は、液体ハンドラーずつサブアレイに添加されます。プレートは、表面張力を介して貫通孔内の試薬を保持するために親水性および疎水性化合物で被覆されています。ステンレス鋼チップは3,072マイクロ加工、320ミクロンdiameteの直線アレイを形成するために、「フォトリソグラフィパターン化およびウェットエッチングでありますrを次のようにターゲットのための33ナノリットルの穴それぞれ「2略語は次のとおりです。BCOR、イヌ呼吸器コロナウイルス（betacoronavirus）; BORD、 気管支敗血症菌 CAV、イヌアデノウイルス; CPIV、イヌパラインフルエンザウイルス; CPNV、イヌニューモ; DISTA / B、イヌを。ジステンパーウイルスA及びB; EADV1 / 2、ウマアデノウイルス1/2; EAV、ウマ動脈炎ウイルス; EHV1 / 4、ウマヘルペスウイルスタイプ1/4; ERVA / B、ウマ鼻炎ウイルスA / B; IVM、インフルエンザマトリックス; MCYNOS、 マイコプラズマカニクイザル 、MS2、内部統制（MS2 RNAファージ）; SEQU、 ストレプトコッカス・エクイ 。 <img alt="表2" src="/files/ftp_upload/54781/54781table2.jpg" /> 表2プレート伝達マップ 384ウェルプレートの96ウェルプリアンププレートから転送するために、固定の8チャンネルピペットを使用するための色分けされたプレート転送マップが示されています。あるいは、調節可能なピペットを使用してもよいです。同じ手順にかかわらず時間のたびに実行されます<html> OW多くのサンプルをプレートにあります。 <img alt="補足ファイル" src="/files/ftp_upload/54781/54781sup.jpg" /> 補足ファイル。サマリーテーブルに結果をフォーマットするための2つのマクロを含むマクロ有効スプレッドシートファイルは、（プロトコールに記載されているように）が設けられています。マクロによって生成される典型的な結果表は（最終結果の下の）ファイルに含まれています。 2のマクロは、（48サンプルまで）最初の列のサンプル名と肯定的な結果とのそれらのため、各ターゲットのための3つのCt値の平均を記入します。増幅しなかったターゲットがこの表に空白表示されていることに注意してください。これは、簡単に用紙1枚に印刷され、効率的に生データを確認するための基準として使用することができます。最終的な結果]タブでは、10の臨床サンプルおよび4のコントロールのための代表的な結果が示されています。アッセイ名の略語は、 表1の凡例に記載されています。www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

ナノスケールPCRによってDNA及びRNAベースの病原体のハイスループット試験は、症候性イヌおよびウマの呼吸PCRパネルを用いて説明します。

ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

このリアルタイムPCR検査法の総合的な目的は、DNAおよびRNAベースの両方の病原体をハイスループットに同時に検出することです。臨床検体からの核酸を、OpenArrayプレートにロードされた共通プライマープールを用いて事前増幅し、病原体の有無を分析します。本手法は、感染症に対するOneHealthサーベイランス活動の促進に寄与します。従来の技術と比較して、本手法ではより多くの検体について、互いに干渉することなくより多くの標的を検査することができ、検査効率を向上させることが可能です。本手法では、カスタムメイドのナノスケールPCRプレートを使用します。プライマーとプローブは貫通孔の縁にプリントされており、サンプルは液体ハンドラーを用いて分注されます。馬および犬の呼吸器病原体パネルを検査する臨床検体を用いて、本手法を実演します。この手順を開始するにあたり、テキストプロトコルに従ってプレートを設計してください。本手順で使用するプレートは、18種類のターゲットを3連（triplicate）で検出するように構成されています。スワブおよび気管洗浄液に培地を加え、液量を少なくとも1〜2 mLにします。チューブ内でスワブとDMEMを激しくボルテックスします。その後、ピペットを使用して、約1 mLの培地を新しいチューブに移します。各ビーズチューブに235 µLの溶解バッファーと175 µLのサンプルを添加します。製造元のプロトコルに従って全核酸を抽出してください。まずサンプルマップを確認し、テキストプロトコルに記載されている手順に従って、核酸の逆転写および前増幅（プリアンプ）の準備を行います。標準的な96ウェルプレートの左側のみを使用し、各ウェルに8.5 µLのpreampマスターミックスと5.5 µLのDNA/RNAサンプルを添加します。サンプル、陽性対照、および陰性対照をpreampミックスと混合させた後、標準的な96ウェルプレートを透明な粘着シールでしっかりと封印します。サイクリング中のシールの隙間形成を防ぐため、余分なシール部分はカミソリで取り除いてください。PCRプレートスピナーを用いて、密閉したプレートを20秒間遠心分離します。すべての試薬がプレートウェルの底に集まっているか確認してください。汎用のサーモサイクラーの電源を入れ、preampサイクリングプログラムを選択してプログラムを開始します。サーモサイクラーの画面上の温度表示を確認し、下部がcDNA合成に必要な温度に達してから、96ウェルプレートをセットしてください。プレアンプ反応の完了後、プレートが密封状態に維持されていたかを確認します。二重手袋とスリーブカバーを着用し、プレアンププレートからシールを取り除きます。次に、外側の手袋を慎重に外して廃棄します。96ウェルプリアンププレートの1列目から6列目の各ウェルにTEバッファーを56 µL添加し、ピペッティングで混合することで、プリアンプ産物を1対5に希釈します。その際、ピペットの第1ストップまでのみ押し込み、底から吸引し、少し高い位置で吐出してください。ただし、気泡を立てないように注意してください。未使用のウェルの有無にかかわらず、6つの全カラムにTEバッファーを添加します。テキストプロトコルに従い、増幅プレートへの384ウェル転送の準備を行います。準備ステップが完了したら、サイズが適合する新しいダブルグローブとスリーブカバーを着用してください。少量のピペッティング時には蒸発率が高くなるため、マスターミックスとサンプルを効率的に分注し、直ちにプレートを密閉することが極めて重要です。384ウェルプレートに2.5 µLの増幅用マスターミックスを加えます。ここではデモンストレーションのために白色プレートを使用していますが、目の疲れを軽減させるには黒色プレートを使用してください。テキストプロトコルのマップに従って、希釈したpreamp製品を2.5 µLずつ384ウェルプレートに分注します。ここに表示されている色付きのサイコロは、固定チャンネルピペットによる分注順序を示しています。分注後、すぐにプレートをアルミ箔シールでしっかりと密封してください。外側のグローブとスリーブカバーを廃棄します。PCRプレートスピナーを用いて、384ウェルプレートを20秒間遠心分離します。ホイルシールは剥がさずに、384ウェルプレートを液体分注機にセットします。封入された増幅プレートのパッケージを開き、シリアル番号が右側にくるように、リキッドハンドラーの第1スロットに慎重に配置します。この際、プレートの表面に触れず、ケースの端を持って保持してください。すべてが正しく配置された後、リキッドハンドラー内にある384ウェルプレートのアルミ箔シールを取り除きます。「次へ」をクリックし、各ステップが完了するごとにチェックボックスにチェックを入れてください。リキッドハンドラーのドアを閉め、すぐに充填プロセスを開始します。リキッドハンドラーのそばに待機し、プレートの充填が完了したら直ちに次のステップに進んでください。リキッドハンドラーの動作中に、ケース蓋の底面から保護フィルムを取り除きます。上のフィルムはそのままにしておきます。赤いテープを軽く引っ張り、粘着剤から剥がしてプライミングします。リキッドハンドラーから増幅プレートを取り出し、シリアル番号が右側にくるようにしてプレートプレスに静かに設置します。プレートの蓋を、切り欠きがある方を右にし、粘着面を下にして置きます。プレートプレスのレバーを慎重に押し下げて閉じると、ライトが20秒間点滅します。この間、プレートプレスに触れないでください。ライトが緑色に点灯したら、レバーを持ち上げ、プレートの端を持って密封プレートを慎重に取り出します。密封された増幅プレートのケースの端を持ち、垂直に保持したまま、直ちにシリンジチップをケース端の注入ポートに挿入し、プレートと蓋の間の隙間を満たすように、浸漬液をゆっくりと一定の動作で注入します。プレートが浸漬された後、隅に小さな気泡を一つ残しておいてください。プレートの端を持って垂直に保持したまま、プラグをポートに挿入し、時計回りにひねってローディングポートを密閉します。ハンドルが折れるまで十分な圧力を加えてください。エタノールを十分にスプレーしたリントフリーワイプでケースを清浄します。ケースを乾燥させるには、清潔なワイプで下方に向かって拭き取ってください。密封したプレートを増幅装置へ運びます。インストゥルメントタブで「インストゥルメントコンソール」を選択してください。増幅装置を選択し、「ドアを開く」ボタンをクリックします。増幅プレートをプレートアダプターの最初のスロットに配置し、アダプターが左上隅の1つのマークと正しく揃っていることを確認します。プレートのバーコードが上を向き、かつ装置の前方を向くように配置してください。ドアを閉じるボタンをクリックした後、画面下部のホームタブに移動します。「run」メニューから「OpenArray」を選択します。「get plate IDs」をクリックし、「start run」をクリックしてランを開始します。結果マクロを含むスプレッドシートを開きます。エクスポートされたデータファイルで、画面下のタブを右クリックし、「移動またはコピー」を選択します。「移動先ブック」フィールドで、「results macro」を選択してください。次に、「末尾に移動」をクリックし、「コピーを作成」というラベルのボックスにチェックを入れます。最後に、「OK」をクリックします。古い「export」タブを削除し、新しく追加されたタブの名前を「export」に変更します。「表示（view）」から「マクロ（macros）」をクリックし、マクロを選択して「実行（run）」をクリックします。次に、「表示（view）」から「マクロ（macros）」をクリックし、Macro2を選択して「実行（run）」をクリックすることで、Macro2に対しても同様の操作を繰り返します。増幅装置のソフトウェアにおいて、画面左側の「解析/増幅プロット（analysis/amplification plot）」を選択し、各サンプルおよびコントロールの曲線がマクロテーブルと一致しているかを確認してください。次に、「sample」タブを選択し、各サンプルをクリックして、表の陽性結果それぞれについて2〜3本の陽性増幅曲線があることを確認します。リアルタイムPCRが正常に実施されたことを示すために、増幅サイクルに対する蛍光強度がプロットされています。ほとんどのサンプルにおいて、リアルタイムPCR反応の2サイクルから25サイクルの間に相対閾値レベルに達しました。陽性コントロールを用いて増幅の直線性と範囲を実証するために、3つの異なる日に作成した標準曲線を作成します。サイクルしきい値（Ct値）を、核酸標準のコピー数の常用対数に対してプロットします。2つのマクロを使用して、1列目にサンプル名を、陽性結果が得られたターゲットについては3つのCt値の平均値を入力します。増幅しなかったターゲットはこの表では空白で表示されています。10検体の臨床サンプルと4つのルーチンコントロールの定量結果が示されています。ここにあるように、増幅ネガティブコントロールはすべてのターゲットで陰性である必要があり、抽出ネガティブコントロールには内部コントロールのみが含まれている必要があります。このセットのうち1つのサンプルでは内部コントロールが不合格となっており、これはサンプル中にインヒビターが存在することを示しています。このビデオを視聴することで、ナノスケールPCR実験の実施方法について十分に理解できるはずです。この手順により、獣医診断における症候群ベースのパネル検査の実施が容易になります。また、この手法は、多くの異なる感染症の原因物質を検出するアッセイに適用することが可能です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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ナノポア技術を用いた狂犬病ウイルスの迅速な特性評価のための全ゲノムシーケンシング

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SARS-CoV-2、インフルエンザA/B、MERS-CoVを検出するためのマルチプレックスリアルタイムRT-qPCRアッセイの開発

さまざまな細菌性病原体は、正確に検出され、迅速に治療されない場合、気道感染症を引き起こし、深刻な健康問題を引き起こす可能性があります。ループを介した等温増幅...

マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

ここでは、増幅可能な細胞溶解、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、およびCRISPR/Cas12aアッセイを使用して、 Lotmaria passim や Nosema ceranae...

RPA/CRISPR/Cas12aシステムへのアルカリ溶解によるトリパノソーマ科寄生虫および Nosema ceranae のオンサイトDNA検出

学ぼう、ナノスケールPCRを用いた犬と馬の呼吸器病原体のハイスループット検出法。リアルタイムPCRでDNA・RNA病原体を同時検出し、OneHealth監視を支援する効率的な診断技術です。

ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

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