ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

このリアルタイムPCR検査法の全体的な目標は、DNAとRNAベースの病原体の両方をハイスループットで同時に検出することです。臨床検体からの核酸は、OpenArrayプレートにロードされた共通のプライマープールで事前に増幅され、病原体の存在について分析されます。この方法は、感染症に対するOneHealthの監視活動を促進するのに役立ちます。

従来の手法と比較して、この方法では、互いに競合することなく、より多くのサンプルをより多くのターゲットに対してテストできるため、テスト効率が向上します。この方法では、カスタマイズされたナノスケールPCRプレートを使用します。プライマーとプローブはスルーホールの端に印刷され、サンプルはリキッドハンドラーを使用してロードされます。

馬や犬の呼吸器病原体のパネルについて試験されている臨床検体で、この方法を実演します。この手順を開始するには、テキストプロトコルで説明されているようにプレートを設計します。ここで使用するプレートは、18個のターゲットを3重に構成しています。

綿棒と気管洗浄液にメディアを追加して、少なくとも1〜2ミリリットルの液体があるようにします。チューブ内で綿棒とDMEMを激しく渦巻きます。次に、ピペットを使用して、約1ミリリットルのメディアを新しいチューブに移します。

各ビーズチューブに235マイクロリットルの溶解バッファーと175マイクロリットルのサンプルを追加します。製造元のプロトコールに従って、全核酸を抽出します。テキストプロトコルに記載されているように、まずサンプルマップを確認して、核酸またはプリアンプの逆転写とプレアンプの準備をします。

8.5 μL のプリアンプマスターミックスと 5.5 μL の DNA/RNA サンプルを、プレートの左側のみを使用して、標準的な 96 ウェルプレートの各ウェルに加えます。サンプル、ポジティブコントロール、ネガティブコントロールをプリアンプミックスと組み合わせた後、標準の96ウェルプレートを透明な接着シールで完全にシールします。サイクリング中にシールの隙間が形成されるのを防ぐために、かみそりの刃を使用して余分なシールを取り除きます。

PCRプレートスピナーを使用して、密封されたプレートを20秒間遠心分離します。すべての試薬がプレートウェルの底に結合されていることを確認してください。従来のサーモサイクラーをオンにした後、プリアンプサイクリングプログラムを選択し、プログラムを開始します。

96ウェルプレートをサーモサイクラーに置いたのは、サーモサイクラーの底部が画面上の温度測定値を監視してcDNA産生に必要な温度に達したときのみです。プリアンプの実行が完了したら、プレートが密閉されたままであることを確認します。ダブルグローブとスリーブカバーを着用した後、プリアンププレートからシールをはがします。

次に、アウターグローブを慎重に取り外して廃棄します。96ウェルプリアンププレートのカラム1〜6の各ウェルに56μリットルのTEバッファーを追加し、ピペッティングで上下させて混合することにより、プリアンプ製品を1〜5に希釈します。これを行うには、ピペットの最初のストップまでのみ移動し、下から吸引して高い位置に分注しますが、気泡は発生させません。

未使用のウェルに関係なく、6 つの列すべてに TE バッファーを追加します。テキストプロトコルで説明されているように、増幅プレートへの384ウェル移管の準備をします。準備手順が完了したら、新しいぴったりとフィットしたダブルグローブとスリーブカバーを着用します。

少量のピペッティングでは蒸発速度が高いため、マスターミックスとサンプルを効率的に分注し、プレートをすぐにシールすることが重要です。2.5マイクロリットルの増幅マスターミックスを384ウェルプレートに加えます。ここではデモンストレーション目的で白いプレートを使用していますが、目の疲れを軽減するために黒いプレートを使用する必要があります。

希釈したプリアンプ製品2.5μリットルを、テキストプロトコルのマップに従って384ウェルプレートに移します。ここに示されている色付きのサイコロは、固定チャンネルピペットの移送シーケンスを示しています。すぐにプレートをホイルシールでしっかりと覆います。

アウターグローブとスリーブカバーは捨ててください。PCRプレートスピナーで384ウェルプレートを20秒間遠心分離します。ホイルシールを剥がさず、384ウェルプレートをリキッドハンドラーに入れてください。

ケース入りのパッケージを開けます amplificationプレートを最初のスロットのリキッドハンドラーに慎重に入れ、シリアル番号が右側にあり、プレートの表面に触れないようにケースの端を持ちます。すべての所定の位置に収まったら、リキッドハンドラー内の384ウェルプレートからホイルシールを取り外します。[次へ]をクリックし、各ステップが完了したらすべてのチェックボックスをオンにします。

リキッドハンドラーのドアを閉め、すぐに充填プロセスを開始します。リキッドハンドラーの隣に留まり、プレートが満たされたらすぐに次のステップに進みます。リキッドハンドラーが作動している間に、ケースの蓋の底から保護フィルムをはがします。

トップフィルムはそのままにしておきます。赤いテープを少し引っ張って接着剤から離して、下塗りします。ロードされたを取り外します ampリッドハンドラーからプレートを取り外し、右側のシリアル番号でプレートプレスにそっと置きます。

プレートの上部に蓋を置き、切り欠きのある端を右側に、接着剤を下部に置きます。プレートを押し下げてレバーを慎重に閉じると、ライトが20秒間点滅します。この間、プレートプレスには触れないでください。

ライトが緑色に点灯したら、レバーを持ち上げ、密封されたプレートを端に持って慎重に取り外します。密封された増幅プレートをケースの端で垂直に保持しながら、すぐにシリンジの先端をケースの端にあるローディングポートに挿入し、その後、浸漬液を1回の穏やかな連続動作でゆっくりと分注し、プレートと蓋の間のスペースを埋めます。プレートが浸されたら、隅に小さな気泡を1つ残します。

プレートを端で垂直に保持し続けながら、プラグをポートに挿入してプラグを時計回りにひねってローディングポートを密閉し、ハンドルが折れるまで十分な圧力をかけます。エタノールを十分に噴霧した糸くずの出ないワイプでケースを清掃します。ケースを乾かすには、きれいなワイプでケースを下向きに拭きます。

密封されたプレートを増幅機に持って行きます。「instrument」タブで、「instrument console」を選択します。を選択します ampリフィケーションマシンをクリックし、ドアの開いたボタンをクリックします。

アンププレートをプレートアダプターの最初のスロットに配置し、アダプターが左上隅に1つと正しく並んでいることを確認します。バーコードを上に向けて機器の前面に向けてプレートを向けます。ドアを閉じるボタンをクリックした後、画面下部のホームタブに移動します。

[実行] メニューで [OpenArray] を選択します。[プレート ID の取得] をクリックします。実行を開始するには、[実行の開始] をクリックします。

結果マクロを含むスプレッドシートを開きます。エクスポートされたデータファイルで、画面下部のタブを右クリックし、[移動]または[コピー]を選択します。[To Book] フィールドで、[results macro] を選択します。

次に、[move to end]をクリックし、[create copy]というラベルの付いたチェックボックスをオンにします。最後に、[OK]をクリックします。古いエクスポートタブを削除してから、新しく追加したタブの名前をエクスポートに変更します。

[表示]、[マクロ] の順にクリックし、マクロを選択して [実行] をクリックします。次に、Macro2 に対してこれを繰り返します。[View] をクリックし、[Macros] をクリックし、[Macro2] を選択して [Run] をクリックします。増幅装置ソフトウェアで、各サンプルの曲線を確認し、画面左側の分析/増幅プロットを選択してマクロテーブルと照らし合わせて制御します。

次に、サンプルタブを選択し、各サンプルをクリックして、テーブル内の各正の結果に2つまたは3つの正の増幅曲線があることを確認します。蛍光測定値は、リアルタイムPCRが正常に実行されたことを示すために、増幅サイクルに対してプロットされます。ほとんどのサンプルは、リアルタイム PCR 反応のサイクル 2 から 25 の間に相対的な閾値レベルに達しました。

3つの異なる日に実行された標準曲線をプロットして、ポジティブコントロールを使用した増幅の線形性と範囲を示します。サイクルの閾値は、核酸標準のコピー数の対数基数 10 に対してプロットされます。2 つのマクロは、最初の列のサンプル名と、肯定的な結果が出たターゲットの各ターゲットの 3 つの Ct 値の平均を入力します。

増幅されなかったターゲットは、この表では空白で表示されます。10の臨床サンプルと4つのルーチンコントロールの定量結果が示されていますが、この場合と同様に、ネガティブ増幅コントロールはすべてのターゲットに対してネガティブであるべきであり、ネガティブ抽出コントロールは内部コントロールのみを含むべきです。このセットの 1 つのサンプルは、サンプル中に阻害剤が存在することを示す内部コントロールの失敗を示しています。

このビデオを見れば、ナノスケールのPCR実験の実施方法について十分に理解できるはずです。この手順により、獣医診断で症候群ベースのパネルを実行することが容易になります。この方法は、多くの異なる感染症の原因物質のエッセイを含めるように適応させることができます。