Name: ファストナノ位置決めシステムを用いた単一分子FRET実験から構造情報 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 学ぶ単一分子FRET実験による構造生物学の手法。TIRF顕微鏡とベイズ推論ソフトウェアを用いて、生体分子の柔軟なドメインの局在化と三次元確率分布を解析するプロトコルを解説します。

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著者は、フローチャンバーの機械的な図面を提供してくれたB. Gruchmannに感謝します。さらに、NPSとその基礎となるサンプリングエンジンに関する洞察に満ちたコメントと議論をいただいたMax Beckers氏とFlorian Drechsler氏に感謝の意を表したいと思います。

<ol><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Particle+Cryo-EM+at+Crystallographic+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution.</a> Cell. 161, 450-457 (2015).</li>
<li>Garman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+X-ray+Crystallographic+Structure+Determination+of+Biological+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developments in X-ray Crystallographic Structure Determination of Biological Macromolecules.</a> Science. 343 (6175), 1102-1108 (2014).</li>
<li>Sali, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+the+First+wwPDB+Hybrid%2FIntegrative+Methods+Task+Force+Workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Outcome of the First wwPDB Hybrid/Integrative Methods Task Force Workshop.</a> Structure. 23, 1156-1167 (2015).</li>
<li>Hopfner, K. P., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+nucleic+acid+translocases%3A+lessons+from+structural+biology+and+single-molecule+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics.</a> Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).</li>
<li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+AFM+and+applications+to+biomolecular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">High-speed AFM and applications to biomolecular systems.</a> Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).</li>
<li>Neuman, K. K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5, 491-505 (2008).</li>
<li>Yildiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+walks+hand-over-hand%3A+single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).</li>
<li>Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Single-Molecule+Fluorescence+Methods+for+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology.</a> Annu Rev Biochem. 77 (1), 51-76 (2008).</li>
<li>Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating-laser+excitation%3A+single-molecule+FRET+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond.</a> Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).</li>
<li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+transfer%3A+a+spectroscopic+ruler%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).</li>
<li>Rasnik, I., Myong, S., Cheng, W., Lohman, T. M., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-binding+Orientation+and+Domain+Conformation+of+the+E.+coli+Rep+Helicase+Monomer+Bound+to+a+Partial+Duplex+Junction%3A+Single-molecule+Studies+of+Fluorescently+Labeled+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA-binding Orientation and Domain Conformation of the E. coli Rep Helicase Monomer Bound to a Partial Duplex Junction: Single-molecule Studies of Fluorescently Labeled Enzymes.</a> J Mol Biol. 336 (2), 395-408 (2004).</li>
<li>Andrecka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+tracking+of+mRNA+exiting+from+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 135-140 (2008).</li>
<li>Schröder, G. F., Grubmüller, H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0010465504000748">FRETsg: Biomolecular structure model building from multiple FRET experiments.</a> Comput Phys Commun. 158 (3), 150-157 (2004).</li>
<li>Margittai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer+reveals+a+dynamic+equilibrium+between+closed+and+open+conformations+of+syntaxin+1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15516-15521 (2003).</li>
<li>Kalinin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+and+benchmark+study+for+FRET-restrained+high-precision+structural+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling.</a> Nat Methods. 9 (12), 1218-1227 (2012).</li>
<li>Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nsmb/journal/v23/n2/full/nsmb.3148.html">N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation-elongation dynamics.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (August 2015), 110-115 (2015).</li>
<li>Svensson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+trilateration+of+probes+bound+within+functional+ryanodine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">FRET-based trilateration of probes bound within functional ryanodine receptors.</a> Biophys J. 107 (9), 2037-2048 (2014).</li>
<li>Stephenson, J. D., Kenyon, J. C., Symmons, M. F., Lever, A. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+3D+RNA+structure+by+single+molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing 3D RNA structure by single molecule FRET.</a> Methods. (2016), 1-11 (2016).</li>
<li>Lee, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophys J. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li>
<li>McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+methods+to+recover+absolute+FRET+efficiency+from+immobilized+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules.</a> Biophys J. 99 (3), 961-970 (2010).</li>
<li>Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+molecular+modeling+with+single+molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET.</a> J Struct Biol. 173, 497-505 (2011).</li>
<li>Schuler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+of+protein+structure+and+dynamics+-+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22J+nanoboitechnology%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET of protein structure and dynamics - a primer.</a> J nanoboitechnology. 11, Suppl 1. 1-17 (2013).</li>
<li>Choi, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET-derived+model+of+the+synaptotagmin+1-SNARE+fusion+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (3), 318-324 (2010).</li>
<li>Dale, R. E., Eisinger, J., Blumberg, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientational+freedom+of+molecular+probes.+The+orientation+factor+in+intramolecular+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer.</a> Biophys J. 26 (2), 161-193 (1979).</li>
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<li>Muschielok, A., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+nano-positioning+system+to+the+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Application of the nano-positioning system to the analysis of fluorescence resonance energy transfer networks.</a> J Phys Chem B. 115 (41), 11927-11937 (2011).</li>
<li>Andrecka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano+positioning+system+reveals+the+course+of+upstream+and+nontemplate+DNA+within+the+RNA+polymerase+ii+elongation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase ii elongation complex.</a> Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).</li>
<li>Treutlein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Architecture+of+a+Minimal+RNA+Polymerase+II+Open+Promoter+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic Architecture of a Minimal RNA Polymerase II Open Promoter Complex.</a> Mol Cell. 46 (2), 136-146 (2012).</li>
<li>Nagy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+architecture+of+the+archaeal+RNA+polymerase+open+complex+from+single-molecule%5BTitle%5D)+AND+%22FRET+and+NPS.+Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule.</a> FRET and NPS. Nat Commun. 6, 6161(2015).</li>
<li>Grohmann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Initiation+Factor+TFE+and+the+Elongation+Factor+Spt4%2F5+Compete+for+the+RNAP+Clamp+during+Transcription+Initiation+and+Elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Initiation Factor TFE and the Elongation Factor Spt4/5 Compete for the RNAP Clamp during Transcription Initiation and Elongation.</a> Mol Cell. 43 (2), 263-274 (2011).</li>
<li>Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+structural+information+from+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss%22%5BJournal%5D)">Quantitative structural information from single-molecule FRET.</a> Faraday Discuss. 184, 117-129 (2015).</li>
<li>Bennink, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unfolding+individual+nucleosomes+by+stretching+single+chromatin+fibers+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers.</a> Nat Struct Biol. 8 (7), 606-610 (2001).</li>
<li>Chandradoss, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J Vis Exp. (86), e50549(2014).</li>
<li>Würth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M., Resch-Genger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+and+absolute+determination+of+fluorescence+quantum+yields+of+transparent+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Relative and absolute determination of fluorescence quantum yields of transparent samples.</a> Nat Protoc. 8 (8), 1535-1550 (2013).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , Springer US. Boston, MA. (2006).</li>
<li>Korkhin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+complex+RNA+polymerases%3A+The+complete+archaeal+RNA+polymerase+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure.</a> PLoS Biol. 7 (5), (2009).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

私たちは、正確に生体高分子に柔軟なリンカーを介して結合している染料、 すなわち 、核酸および/またはタンパク質間のFRET効率を決定するためのセットアップおよび実験手順を提示します。 精密smFRET測定（セクション3）を確保するためには、測定中の任意の時点でフローチャンバーから空気を排除することが重要です。さらに、蛍光体でフローチャンバーに過負荷をかけないようにしてください。フルオロフォアは明らかに正しい分析を確実にするために分離されなければなりません。ドナーの漂白を示さないsmFRETペアは、分析から除外されなければならないように、視野内の分子の&gt; 80％は映画の終わりに漂白されていることを確認してください。サンプルβ-因子およびγ-ファクタの不均一性を考慮するために、ドナーとアクセプターチャネルのクロストークと相対検出効率を補正し、それぞれ、個別に各FRET対に対して計算されています。 <p class= &quot;jove_content&quot;&gt;カメラ設定（セクション3.9で説明積分時間、電子増倍ゲイン、プリアンプゲインと読み出し速度）は、信号対雑音比、ダイナミックレンジ及び時間分解能信号との間の最良のトレードオフを与える値に設定されるべきです。これらは、異なる実験のために、または異なるハードウェアを使用する場合、再調整する必要があります。フレームの数は、ドナーの大部分は観測時間内漂白分子ことを保証するのに十分に高いことが必要です。 蛍光分光計（セクション7〜9）の測定のための信号強度と記録されたデータのスペクトル分解能との間の良好な妥協点を見つける必要があります。この目的のために蛍光分光計の励起および発光経路のスリットを用いる機器、サンプル濃度に依存するように適合されなければなりません。 さらに、我々は、一過性または動的MACROMの構造情報を得るために高速NPS分析法を提示しますolecular複合体。 NPSは、非鋳型DNA鎖と古細菌RNAポリメラーゼオープン複合体における転写開始因子の位置の経路を明らかにするために適用されています。 60以上の異なる距離測定のネットワークを使用して、我々はその新しく実装されたサンプリング・エンジン（準備中Eilert、T.、ベッカー、M.、・ドレクスラー、F.、＆ミカエリス、J）を装備した高速NPS、示しました元のグローバルNPS法27に比べて、大きさの≈2オーダーすることによって、この複雑なsmFRETネットワークの解析に必要な時間を短縮します。アルゴリズムの堅牢性は、レプリカ交換法のスキームと組み合わせメトロポリス-内-ギブスサンプラーに根ざしています。高速NPSは、ネットワークの結果の正確な再現性を示し、30以前公開された結果と一致しています。 いくつかの異なる方法がsmFRET測定11から構造情報を推測することを目指して公開されています</sアップ&gt;、12、13、14、15、16、17、18。これらのアプローチの全ては、1つの特定の色素のモデルを提供します。このように、それぞれのモデルによって作られた仮定を満たしていない染料は、使用されるか、または虚偽の構造情報に導くことはできません。高速NPSは、逆に、各色素分子のための別のモデルを選択することができます。これは、異なるコンホメーションの両方の行動、色素分子自体、ならびにその結合のために使用されるリンカーを説明するために役立ちます。色素分子の局所分子周囲だけでなく、その物理的性質が最も適切であるモデルを決定します。 古細菌の開始複合体の分析smFRETネットワークでは、すべての色素分子のための等方性の仮定は大幅な減少の私につながりますnは信頼できるボリュームのサイズ古典的なモデルと比較して。すべての色素のための平均動的位置との組み合わせで（95％で）すべての信頼できるボリュームサイズの中央値が0.5nm未満3に減少する分子。しかし、これらの色素分子の事後は仮定が偽構造情報とリードを作っていることを示す、そのsmFRET測定値ともはや一致していません。これとは対照的に、古典的なモデルで決定された事後が決定smFRET効率と一致しています。 等方性および/または全ての染料のための平均動的位置の仮定が矛盾につながるように、高速NPSは、各色素が5モデルのいずれかを割り当てることが可能な色素分子の事前確率を可能にします。各モデルは、同じアクセス可能なボリュームを使用しています。色素のAVを計算するためのアルゴリズムは、いくつかの仮定を行います。最初は、フルオロフォアの空間的形状は球で近似されます。このように、直径が考慮フォアのWIDを取ります番目、高さと厚さは、（第12節）を使用する必要があります。また、リンカの形状は、柔軟なロッドで近似されます。第12節で提示値は12-Cリンカーを介して結合した色素アレクサ647用に計算しました。今日まで、実験のジオメトリを考慮すると、正確なモデルが最も適している事前に決定することは不可能であり、したがって、すべてのモデルは、試験されるべきです。静止画データと一致しながら、一般的に、人は、可能な最小後方サイズを与えるモデルを選択します。モデルの選択はsmFRETデータと一致しているかどうかをテストするために、我々は事後尤度の両方を計算します。一貫性は、後方から採取した試料の90％以上は、可能性の95％信頼区間内にあることを意味します。 それが真である間、色素分子のsmFRETネットワークにおいて、距離不確定小さく、異方性低い幾何学的配置も考慮しなければならないこと。したがって、R一方典型的な最初の選択肢は、ISOモデルと低蛍光異方性と染料分子をさepresenting、一貫性のテストは、正しい染料モデルを選択するためのより直接的な手段を提供します。染料モデルの最適な選択は、ローカリゼーション精度の大幅な増加をもたらすと同時に、そのFRETのデータとネットワークの整合性を保持することができます。 要約すると、高速NPSは、大きな高分子複合体の構造や動的な情報を得ることができます。例えば、X線結晶学または低温電子顕微鏡法などの一般的な構造的方法とは対照的に、これは大幅に複雑な生物学的プロセスの我々のメカニズムの理解を広げ、非常に柔軟なまたは一過性の複合体をモニターすることを可能にします。

生体分子の構造を決定することは、その機能を理解するための重要な前提条件です。構造決意ための2つのよく確立された方法は、低温電子顕微鏡法およびX線結晶1、2です。今日では、両方の方法は、オングストロームレベルまで解像度を持つ高解像度の構造情報を提供します。これらの2つの方法は、タンパク質複合体のような大きな生体分子の構造を解明するために広く使用されています。既存の方法は、常に最後の数十年を通じて改善されているが、大規模な動的および過渡複合体は3を検討する際に、生物学的構造の複雑さは、まだ具体的には、構造生物学に大きな課題を提起します。 巨大分子複合体の力学、特に構造 - 機能の関係を研究するために、単一分子方法はPROVを有しますIDED有用な情報4。いくつかの新しい戦略は、構造的および動的な情報を取得するに直交するアプローチを提供する開発されました。例としては、高速AFM 5、機械的操作6、蛍光局在顕微鏡7と同様に、単一分子蛍光共鳴エネルギー移動（smFRET）8、9です。かなり早い段階FRET上ので生体高分子10の長さスケールでの距離依存性に起因する分子定規を 、と呼ばれています。 smFRETの特に興味深い適用は、構造情報11、12、13、14を推測するsmFRET測定から得られた距離情報を使用することで、15 &gt;、16、17、18、19、20、21、22、23。 smFRETの高時間分解能を、タンパク質構造の可動部の位置を局在化することができます。しかし、smFRETデータから定量的情報を抽出するために色素分子に関する重要な補正パラメータは、測定24中に決定される必要があります。これらの補正係数を用いて、FRET効率E FRET式を用いて計算することができます<img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq1.jpg"> 、 ここで、I AとI D 図2参照 ）は、それぞれ、ドナー及びアクセプター分子の蛍光強度です。 βファクタは、アクセプターチャネルに、クロストークのためのドナー発光の漏れを占め、によって計算されます<img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq2.jpg"> I 'AとI D'は、アクセプター分子の光退色後のドナーとアクセプター分子の蛍光強度どこにいます。 γ-要因は、2チャンネルの相対的な検出効率の違いだけでなく、ドナーの蛍光量子収率とアクセプター色素の違いを補正します。それはによってすべての個々の時間トレースから計算されますこの説明は、時には重要になり、同様のために修正する必要があるアクセプター分子の直接励起を無視することを、注意してください。これらの補正係数を決定するためには、光物理的変化と構造力学を区別するために、交互スキーム25にドナーならびにアクセプターの両方を励起するのに便利です。 定量的smFRET効率だけでなく、定量的な構造情報を取得するだけでなく、ためには、ナノポジショニングシステム（NPS）は、2008年26で導入されました。名前は、衛星ベースの全地球測位システム（GPS）との類似性に基づいて選択しました。 NPSは、生体高分子複合体中の未知の色素位置の局在化smFRETとX線結晶学データを組み合わせたハイブリッド技術です。 C言語rystal構造は、参照フレームとして機能し、smFRET結果が不明フルオロフォアの位置（ アンテナ ）と結晶構造（ 衛星 ）からの既知の位置との間の距離情報を取得するために使用されます。連続実験では、アンテナと複数の衛星との間の距離が測定され、アンテナの位置がベイズパラメータ推定に基づいて、統計的に厳密な分析手法によって決定されます。その結果、アンテナの有力位置だけではなく計算されますが、その完全な3Dの不確実性分布、いわゆる後方には、信頼できるボリュームによって可視化しました。また、NPSは完全smFRETネットワーク27の分析を可能にするために拡張されました。 NPSは、真核生物の転写において重要な質問の数、すなわち上流のDNAもちろん、非鋳型DNAとRNAポリメラーゼII伸長共内新生のmRNAを解決するために使用されていますまた、転写開始の効果を実証mplex 12、28は 、26因子と29を開放プロモーターの動的なアーキテクチャが複雑。また、NPSは、転写伸長因子Spt4 / 5 31と同一部位に競合的に結合する転写開始因子TFEのオープン複雑30、特に位置古細菌RNAポリメラーゼの構造を解明するために使用されました。 それ以来、smFRET基づく構造のアプローチの数は15、18、21、23を発表されています。異なるsmFRET基づく構造の方法を比較すると、それは、この方法の明らかな精度は、染料モデルの特定の選択に大きく依存することが明らかとなります。一つは、あることに注意する必要があります色素分子は、それらの局所環境に応じて異なる空間および配向挙動を示すことができます。 このため、高速NPSは32を導入しました。高速NPSは大幅に計算時間を削減する高度なサンプリングアルゴリズムを使用しています。また、高速NPSは1つが構造解析を実行することを可能にし、ユーザが次に説明する5異なる色素モデルのセットから選択することができ、各色素分子のため。 古典と呼ばれる最も保守的なモデルは、染料が一つだけが、未知の、位置を占めていることを前提としています。この位置では、フルオロフォアは、そのサイズがそのそれぞれの（時間依存性）蛍光異方性から決定される円錐内で自由に回転することができます。円錐の向きは、距離に測定smFRET効率を変換する際に大きな不確実性をもたらす、知られていません。それは他の染料のモードに比べて最小精度につながるので、この点で、このモデルは、保守的ですlsの。ごく短い距離のための前提条件が著しく不正確な位置決意に古典的なモデルのリードによって作らなければなりません。典型的なsmFRET値については、正確な位置は常に比較的大きな信頼できるボリュームで囲まれています。 より高い精度が望まれるので、開発および精度を改善するために役立つ可能性が代替染料モデルをテストすることが重要です。染料は、その固有の蛍光寿命よりもはるかに高速に回転する場合、いわゆるISOモデルを適用することができます。ここでは、2κ配向係数は（特性の等方性のフェルスター半径を計算するために必要な<img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq4.jpg"> ）2/3に設定されています。その結果、計算された信頼性の高いボリュームは、古典的なモデル32におけるものと比較してほぼ2桁小さいです。フルオロフォアは、高速reoriだけでなく、できる環境で発見された場合にはすべてのアクセス可能な容量を超えるentationが、さらに速い動きは、meanposイソモデルを使用する必要があります。このモデルでは、染料は、効果的に空間平均は多項式距離変換15によって占められて唯一の平均位置を占めます。 （例えば、一般的に疎水性）色素が親水性領域、 例えば、DNAに取り付けられている場合、このモデルは適用されます。 meanposイソモデルの適用は、約2倍信頼ボリュームのサイズをさらに低減することができます。しかし、タンパク質に連結された色素は、その立体的にアクセス可能なボリューム（AV）のいくつかの疎水性パッチに可逆的に結合する可能性があります。瞬時にこれらの領域の間にスイッチが、1領域内の自由な回転を受け、高速なローカライズされた動きがVAR-meanpos -イソモデルによって最良に記載されている。フォア似たような状況のためにした染料は、モデルが適用されるVAR-meanposを自由に回転することではありません。以上のDこれらのモデルについてetailsは、私たちの最近の刊行物32に記載されています。 これらのモデルは、具体的には色素が発生する可能性のある様々な環境を考慮し、それらを適用することは賢明にその局在化の精度を最適化する広範なレパートリーを提供します。高速NPSで特定の位置に取り付けられたすべての色素分子は、FRET-パートナーは異なるモデルを持つことが許可されているように、個々のモデルに割り当てることができます。これは無限にあり、近隣ツー自然モデリングを可能にします。しかし、1つが最終的なモデルの組み合わせによって得られた結果は実験データと一致したままであることを保証するために厳密な統計的検定を行うことが重要です。これらのテストは、高速NPSソフトウェアに含まれています。 実験データに高速NPSを適用するために（のみ）3つの入力パラメータの測定が必要とされます。まず、色素ペア固有の等方性のフェルスター半径（/54782/54782eq5.jpg "/&gt;）を決定する必要がドナー色素のあるので、量子収率（QY）、ドナーの蛍光発光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルを測定する必要がある。これらの測定値は、で行うことができますバルクは、標準的な分光計及び標準的な蛍光分光計を用いて、それぞれのペアについて、R 0は、その後フリーPhotochemCADを使用して計算され、NPS分析に使用することができる。また、色素分子の（時間分解）蛍光異方性が必要偏光（及び時間）に敏感な蛍光分光計を用いて得ることができる。しかし、高速NPSのための最も重要な入力パラメータは、全内部反射蛍光顕微鏡（TIRFM）などの単一分子蛍光顕微鏡の設定で測定smFRET効率であります。 ここでは、smFRETデータを取得し、高速NPS（ 図1）を適用するためのステップバイステップのプロトコルを提示します。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Flowchamber preparation</td></tr><tr><td>Customized metall sample holder</td><td>self-built</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>quartz-glass slides, 76&nbsp;mm x 26&nbsp;mm</td><td>テクニカルガラス製品</td><td>26007</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス、60 mm x 24&nbsp;mm</td><td>マリエンフェルト</td><td>101242</td><td></td></tr><tr><td>洗剤、ヘルマネックス II</td><td>ヘルマ</td><td>320.001</td><td></td></tr><tr><td>超純水 シナジー UV</td><td>ミリポア</td><td>2512600</td><td></td></tr><tr><td>ゼプト プラズマ クリーナー</td><td>ディーナー</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>(3-アミノプロピル)-トリエトキシシラン、ペンシルバニア州</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>メトキシ PEG-スクシンイミジル吉草酸エステル、5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化 PEG-スクシンイミジル吉草酸エステル 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>BIOTIN-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>バイオカーボネートナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127 Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>シーリングフィルム(Nescofilm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12981805</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8&nbsp;mm ID, 2.4&nbsp;mm OD</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics</td><td>720958</td><td></td></tr><tr><td>Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12665497</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Life Technologies</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Total internal reflection fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Nd:YAG Laser, 532 nm</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td>EXLSR-532-100-CDRH</td><td></td></tr><tr><td>ダイオード励起固体レーザー、491 nm、Calypso</td><td>Cobolt</td><td>904010050</td><td></td></tr><tr><td>ダイオードレーザー643 nm、iBeam smart</td><td>Toptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td></td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー、532 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-540</td><td></td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー、476 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-476z</td><td></td></tr><tr><td>音響光学チューナブルフィルターAA</td><td>光電子</td><td>AOTFnC-VIS</td><td></td></tr><tr><td>平凸円筒レンズ、f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1703L1-A</td><td></td></tr><tr><td>平凹円筒、f = -300&nbsp;mm</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr>プ<tr><td>リズム、PS 991</td><td>Thorlabs</td><td>PS991</td><td></td></tr><tr><td>集光レンズ、f = 75&nbsp;mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1608-B</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ、PHD 2000</td><td>ハーバード装置</td><td>70-2002</td><td></td></tr><tr><td>2ステッピングモーター、Z812B</td><td>Thorlabs</td><td>Z812B</td><td></td></tr><tr><td>圧電アクチュエータ、PE4</td><td>Thorlabs</td><td>PE4</td><td></td></tr><tr><td>IRダイオードレーザー</td><td>エドモンド光学</td><td>CPS808</td><td>オートフォーカスシステム</td></tr><tr><td>ダイクロイックミラーの一部、775 DCXR</td><td>クロマ</td><td>775 DCXR</td><td></td></tr><tr><td>位置検出検出器(PSD)、PDP90A</td><td>Thorlabs</td><td>PDP90A</td><td>オートフォーカスシステム</td></tr><tr><td>水浸対物レンズの一部、プランApo 60X WI、NA 1.2</td>ニ<td>コン</td><td></td><td>MRD07601</td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー、645 DCXR</td><td>クロマ</td><td>645 DCXR</td><td>発光</td></tr><tr><td>経路発光フィルターの一部、3RD550-510</td><td>オメガオプティカル</td><td>3RD550-510</td><td>グリーンチャンネル発光経路</td></tr><tr><td>発光フィルター、3RD660-760</td><td>オメガ光学</td><td>3RD660-760</td><td>発光経路の赤チャンネル</td></tr><tr><td>EMCCD カメラ、iXon+ DU897EBV</td><td>Andor</td><td>AND-20-00032</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD カメラ、iXon3 DU897D-BV</td><td>Andor</td><td>AND-20-000141</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Miscellaneous</td></tr><tr><td>Varian 50</td><td>Cary</td><td></td><td>紫外可視分光器</td></tr><tr><td>Fluorolog2</td><td>SPEX</td><td></td><td>蛍光分光器</td></tr><tr><td>Solis (V4.15)</td><td>EM-CCDカメラ用</td><td>Andor</td><td></td>制御ソフトウェア</tr><tr><td>Apt ユーザーユーティリティ&nbsp;(V1.022)</td><td>ピエゾモーター用</td><td>Thorlabs</td><td></td>制御ソフトウェア</tr><tr><td>Norland光学接着剤68</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>接着剤</td></tr><tr><td>PC-AFN-0.8ナイルレッド</td><td>Kisker Biotech</td><td></td><td>アビジンコーティング蛍光マルチスペックビーズ&nbsp;</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>技術計算言語、ダウンロード、ソフトウェア</td></tr><tr><td>、Origin(V9.0)</td><td>Originlab</td><td></td><td>、科学グラフ作成、データ分析ソフトウェア</td></tr><tr><td>、Hellma 105-202-15-40</td>、<td>Hellma</td><td>105-202-15-40</td>、<td>1&nbsp;cm光路長</td></tr><tr><td>Hellma 105-251-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-251-15-40</td><td>蛍光キュベット、光路長3 mm</td></tr></tbody></table>

ファストナノ位置決めシステムを用いた単一分子fret実験から構造情報

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

単一分子フェルスター共鳴エネルギー移動(smFRET)は、生体分子複合体の構造情報をリアルタイムで取得するために使用できます。これにより、複数のsmFRET測定を使用して、三辺測量によってタンパク質複合体内の未知の色素位置を局在化します。ナノポジショニングシステム(NPS)は、定量的な情報を得るために、確率的データ解析を用いてX線結晶構造解析の構造情報と1分子蛍光データを組み合わせて、最も可能性の高い位置だけでなく、実験の不確実性を示す事後と呼ばれる完全な3次元確率分布を計算します。この概念は、多数の色素分子を含むsmFRETネットワークの解析のために一般化されました。NPSの最新バージョンであるFast-NPSは、マルコフ連鎖モンテカルロサンプリングと並列テンパリングに基づくベイジアンパラメータ推定を使用した新しいアルゴリズムを備えており、大規模なsmFRETネットワークを比較的短時間で解析できます。さらに、Fast-NPSは、各色素に対して5つの異なるモデルから1つを選択することにより、事後部の計算を可能にし、これらのモデルは、その局所環境のために色素分子が示す異なる空間的および配向的挙動を説明することができます。
ここでは、smFRETデータを取得し、Fast-NPSを適用するための詳細なプロトコルを提示します。Fast-NPSの3つの入力パラメータ(smFRET値、色素分子の量子収率と異方性)の取得について、詳細な手順を提供します。最近、NPSは古細菌のオープンプロモーター複合体のアーキテクチャを解明するために使用されています。このデータは、5つの異なる色素モデルが事後分布に及ぼす影響を示すために使用されます。

転写は全ての生物における遺伝子発現の最初のステップです。古細菌では、転写は、単一のRNAポリメラーゼ（RNAP）によって行われます。単純な転写機構を有しながら、真核生物と比較して、古細菌のRNAPは彼らの真核生物のカウンターパートへの印象的な構造似ています。このように、古細菌は、RNAポリメラーゼII（ポルII）の真核生物の転写開始を研究するためのモデル系として使用することができます。最近、古細菌RNAポリメラーゼオープン複合体の完全なアーキテクチャは、単一分子FRETおよびNPSから決定されています。 NPS分析からのデータは、転写開始のメカニズムに有益な洞察を提供し、完全な古細菌オープンプロモーター複合体のモデルを構築するために使用されました。 この構造を解明するために、smFRET効率がオープンプロモーターコム内に位置する未知のアンテナ色素分子間で測定しました。プレックスとポジション結晶構造（PDB-ID：2WAQ）から知られているRNAP、の5つの参照サイトで組み込まれたいくつかの既知の衛星色素分子37。アンテナ色素は、非鋳型DNA、TFB、TBPまたはTFEの異なる位置のいずれか一方に取り付けられました。本研究で用いた完全なネットワークは、60以上の測定された距離から成っていました。 図7は、NPS分析から構築された完全な古細菌オープンプロモーター複合体のモデルを示しています。これは、二本鎖プロモーターDNA（光とダークブルー）、RNAポリメラーゼ（灰色）および転写開始は、TBP（紫）、TFB（緑）、TFE（黄色）の係数を備えます。モデルは、古典的なモデル（A）、ISOモデル（B）、meanposイソモデル（C）、VAR-meanposイソモデルを用いて計算したNPS分析の結果、信頼性の高いボリュームと重畳されます（D）とVAR-meanposモデル（E）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig1.jpg"> 図1： ファスト-NPS計算に必要なパラメータの取得および処理のワークフロー。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig2.jpg"> 図2：smFRET イベントの代表的な蛍光強度の時間トレース。ドナー（緑色）の蛍光強度と3つの特徴の段階、すなわちI示すアクセプター分子（赤）：smFRET、II：アクセプター光退色後のドナー蛍光、III：バックグラウンド蛍光ドナー退色後を。g2large.jpg "ターゲット=" _空白 "&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig3.jpg"> 図3：smFRET 実験のためのフローチャンバの模式図。フローチャンバーは、アクリルガラスホルダーでカスタマイズ金属ホルダに取り付けられます。フローチャンバーのサンドイッチ設計は、石英ガラス（溶融シリカ）入口および出口チューブを取り付けるための2つの穴を有するスライド、封止膜とフローチャンバーを閉鎖カバースリップを含みます。 TIRF照明のためのプリズムは、フローチャンバの下半分に取り付けられます。中空タブねじはフローチャンバーのための入口と出口を提供します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img> ALT = "図4" SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg" /&gt; 図4： 石英ガラススライドの調製及び封止膜。 （ミリメートル単位で与えられる）の穴の位置を示す石英ガラススライドの機械的な図。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig5.jpg"> 図5： フローチャンバーの機械製図。アルミプリズムホルダのための対策は、アクリルガラスホルダーとアルミ取付枠の単位はmmです。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> igure 6 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg "/&gt; 図6：smFRET 実験に使用したプリズム型TIRFセットアップの模式図。光学部品用略語：A、開口; DM、ダイクロイックミラーと、 F、発光フィルター; L、レンズ; M、ミラー; O、客観; P、プリズム。 PSD、位置敏感型フォトダイオード。 S、サンプル; PS、位置決めステージ。 T、望遠鏡。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig7.jpg"> 図7： 異なるモデルの仮定のシミュレーション結果。 、（それぞれ、青、シアンでTDNAとntDNA）プロモーターとともにDNAのためのモデルとTBP（紫）、TFB（緑）、TFE（黄色）：全ての写真は古細菌RNAポリメラーゼ（2WAQ、上面図PDB-ID）を表示します古細菌に複雑な30を開きます。信頼できるボリュームは、（A）の古典的モデル、（B）は、ISOモデル（C）meanposイソモデル、（D）VAR-meanposイソモデル及び（E）のNPSのシミュレーション結果をVARのために重畳されます-meanposモデル。すべてのボリュームは68％の信頼性で示されています。クラシックとVAR-meanposネットワークはsmFRETデータと一致しています。これとは対照的に、すべての染料のISO、meanpos - イソまたはVAR-meanpos - イソモデルが選択されているネットワークは、測定したデータと矛盾しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

TIRF顕微鏡を用いて大規模なドナー・アクセプターネットワークからsmFRETデータを取得するためのセットアップと実験手順を提示します。ベイズ推論ソフトウェアFast-NPSを使用したこれらの測定値の段階的な解析では、適応色素モデルの適用により、高解像度の構造情報が得られます。

ファストナノ位置決めシステムを用いた単一分子FRET実験から構造情報

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

高速ナノポジショニングシステムの全体的な目標は、単一分子FRET実験と厳密な統計分析を組み合わせることで、生体分子の構造情報をリアルタイムに提供することです。この手法は、標準的な構造生物学のツールを適用できない高分子のフレキシブルドメインの局在化など、構造生物学の分野における重要な疑問に答えます。他のFRETベースの構造ツールと比較した高速NPSの主な改善点は、最も可能性の高い位置だけでなく、3次元の確率分布を使用してさまざまな色素モデルを比較できることです。この手法の主な利点は、タンパク質データベースからの構造データと定量的な単一分子蛍光測定を組み合わせることです。手順を開始するには、フローチャンバーとサンプルホルダーを組み立てます。インレットスクリューとアウトレットスクリューを準備するには、シリコンチューブを中空タブスクリューにねじ込み、カミソリの刃でチューブの両端をまっすぐに切断します。タブネジをサンプルホルダーにねじ込みます。フローチャンバーの石英スライド穴をサンプルホルダーのネジ山に合わせます。ガラスホルダーのネジをそっと締めて、フローチャンバーを所定の位置に固定します。長さ20センチメートルのシリコンチューブをインレットスクリューとアウトレットスクリューに通します。フローチャンバーを500マイクロリットルのPBSで洗浄します。次に、PBS中の100マイクロリットルのニュートラアビジン溶液でフローチャンバーを洗い流し、インレットチューブの端に液滴が形成されて、空気がサンプルチャンバーに入るのを防ぎます。操作のたびに入口と出口のチューブをclで閉じて、フローチャンバーから空気を排除します。チャンバーを室温で15分間インキュベートします。次に、ニュートラアビジン溶液を500マイクロリットルのPBSで洗い流します。プリズムに一滴の浸漬油を加え、プリズムをサンプルチャンバーにねじ込みます。単一分子FRETデータは、全反射蛍光顕微鏡を使用して取得されます。カメラソフトウェアとステージピエゾモーターソフトウェアを起動します。チャンバーをTIRF顕微鏡のマイクロメータステージに水平に、できるだけまっすぐに、3つのレーザーすべてと交差するように取り付けます。液浸液を追加し、IR反射を確認して顕微鏡の対物レンズに焦点を合わせます。カメラ パラメータ、ファイル パス、および自動インクリメント パラメータを設定します。ライブカメラフィードを開始し、3つのレーザーすべてを全強度で使用して背景蛍光を漂白します。次に、レーザー強度を下げます。次に、100マイクロリットルの蛍光ビーズ溶液をチャンバーにロードします。ビーズがチャンバー表面に結合するまで10分待ちます。50〜100ビーズの視野で動画を録画し、高いピーク検出しきい値でバッチ分析を実行します。ムービーファイルをロードし、視野の反対側の角に異なる中心を持つ 2 つのビーズを選択します。これらのビーズの最大強度のピクセルを選択します。プリズムを取り外して清掃します。2つ目のサンプルチャンバーを用意し、プリズムホルダーをチャンバーにねじ込みます。チャンバーをマイクロメータステージに取り付けます。次に、ビオチン化蛍光標識サンプルの50〜100ピコモル溶液100マイクロリットルをチャンバーにロードします。分子がチャンバー表面に結合するのを待ちます。同時に「信号を取る」をクリックして録音を開始し、ドナー励起レーザーをオンにします。レーザー出力を調整して、視野内の分子の少なくとも80%が漂白されるようにし、次に、チャンバーを動かして漂白されていない領域を表示し、次のムービーを録画します。この方法でサンプルチャンバーの残りの部分を漂白します。TIRF顕微鏡での測定後、取得した単一分子FRETデータを分析して、平均FRET効率を得る必要があります。サンプルのドナームービーとアクセプタームービーのバッチ解析を実行します。次に、バッチ処理された動画ファイルをデータ解析ソフトウェアに読み込みます。「選択されていません」ボタンをクリックして、個々のFRETフェーズを示します。FRET期間の開始をクリックし、次に漂白によりアクセプター強度が減少する時点、最後に漂白によりドナー強度が減少する時点をクリックします。次のウィンドウで、[はい] を選択して、選択した FRET 効率トレースを保持します。すべての分子が分析されたら、トレースを保存して次の動画を分析します。解析が完了したら、スクリプトを実行してFRET結果を結合します。デフォルトの入力オプションを使用して、結合されたフレーム単位のFRETファイルをデータ分析ソフトウェアにインポートします。データをヒストグラムとしてプロットし、非線形曲線近似ツールを使用してガウス分布に近似します。超過値は主なFRET効率です。UV VISと蛍光分光法を使用して、各色素の等方性Forster半径と定常状態の異方性値を決定します。ナノポジショニングシステムは、よく知られているGPSに触発され、未知の位置であるアンテナといくつかの既知の位置、衛星の位置を特定します。NPS分析を開始するには、FastNPSソフトウェアを起動し、新しいジョブファイルを作成します。ラベル付けされたアンテナとサテライトの位置事前分布を定義するには、ModelDyePrior ウィンドウで、定義する位置の空間分解能を入力します。高分子内部を除外するには、対応する中心に配置されたPDBファイルを読み込みます。染料の直径とスケルトン化距離を入力します。可能な染料位置の最小位置座標と最大位置座標を入力します。定義する位置が衛星の場合は、Flexible Linkerによる色素付着を選択し、中心のPDBファイルから原子座標を入力します。リンカーの長さと直径を入力します。「アクセス可能な体積を計算」をクリックし、前の位置を保存して、視覚化のためにエクスポートします。すべての衛星とアンテナについて、このプロセスを繰り返します。位置を定義したら、「Define Measurement」ウィンドウを開き、新しい色素分子を作成します。その染料に事前に関連付けられた位置をロードします。蛍光異方性を充填し、適切な色素モデルを選択して、色素を活性化します。すべての染料が定義されるまで、このプロセスを繰り返します。次に、新しい測定値を作成します。定義された染料からFRETペアを選択します。誤差のある単一分子のFRET効率と、この色素ペアの等方性フォースター半径を入力し、測定をアクティブにします。これをすべての色素ペアについて繰り返します。次に、計算ウィンドウを開きます。染料が異なるモデルに割り当てられている場合は、[ユーザー定義]を選択します。それ以外の場合は、すべての染料に使用するモデルを選択します。計算を実行し、結果ウィンドウを開きます。FastNPSを使用する際には、信頼性のある量を最小限に抑えるために、すべての色素にモデルを適合させることを忘れず、もちろん一貫性を保つことが重要です。濃度が90%未満の場合は、[詳細な濃度]をクリックし、濃度が90%未満のエントリーに共通する色素を特定します。「Define Measurement」ウィンドウを開き、問題の染料のモデルを変更します。[ユーザー定義]モードで計算を再実行します。染料の信頼できる量を単独で、またはバッチとしてエクスポートします。視覚化ソフトウェアで密度ファイルを開き、信頼性を希望のレベルに調整します。古細菌のRNAポリメラーゼ開放型プロモーター複合体内の未知のアンテナ分子といくつかの既知の衛星分子との間で、単一分子のFRET効率を測定しました。このデータのNPS分析により、これらの色素分子の古細菌RNAポリメラーゼ開放型プロモーター複合体と比較して信頼性のある量が決定されました。色素分子を使用した5つの異なるモデルと結果を比較しました。信頼できる体積は、色素が未知の向きの円錐内でのみ自由に回転できると仮定したモデルで計算した場合、測定データと一致していました。特にクラシックモデルは、染料が固定された場所にあることをさらに前提としているため、最も保守的です。これにより、比較的大きな信頼性のあるボリュームが作成されますが、通常、ボリュームは正しい位置を囲みます。高精度のモデルでは、色素が蛍光寿命内で完全に自由に回転できるという仮定を使用します。iso モデルは、クラシック モデルと同様に、染料がアクセス可能なボリューム内の固定位置にあることを前提としています。meanpos-iso モデルは、すべての可能な位置で動的平均化を前提としています。アイソモデルの信頼できるボリュームは、非アイソモデルによって計算されたボリュームよりもはるかに小さいですが、測定データとは一貫性がありません。私たちは、既存の構造ツールでは解決できなかった問題である過渡錯体の動的構造情報を捉えることができる技術を開発したいと考えていました。単一分子のFRETデータが記録されると、FastNPS分析は数時間で完了し、異なる色素モデルを迅速に比較することができます。この手順に続いて、実験的な単一分子FRETデータと一致する構造化モデルを取得するために、MDシミュレーションなどの他の方法を後で実行できます。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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