Name: 細胞の超高速磁化のためのカチオン化Magnetoferritinの合成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学ぶカチオン化マグネトフェリチンの合成法と幹細胞の超高速磁化技術。低濃度ナノ粒子と短時間インキュベーションで効率的な細胞ラベリングを実現し、MRIや磁気細胞分離への応用が期待されます。

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この研究は、Engineering and Physical Sciences Research Council(EPSRC助成金コードEP/G036780/1)が後援するBristol Centre for Functional Nanomaterialsを通じて資金提供されました。

ヒト間葉系幹細胞（hMSCの）はブリストルSouthmead病院の研究倫理委員会のガイドライン（基準＃078/01）に完全に従うと、患者の同意を得た後に、人工股関節全置換術を受けて変形性関節症患者の近位大腿骨の骨髄から採取しました。 1. Magnetoferritin合成および精製<ol><li> 総説 <ol><li>金属前駆体の酸化を抑制するために窒素雰囲気下で65℃で密閉可能な、二重ジャケット反応容器中magnetoferritin合成を行います。シリンジポンプを用いて反応容器に蓋内のアクセスポートを介して金属塩溶液及び過酸化水素を注入します。 </li><li>合成をmagnetoferritinした後、陰イオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質を精製タンパク質単量体を分離するために（セクション1.5を参照）サイズ排除クロマトグラフィーに続いてタンパク質の空洞に囲まれていないナノ粒子を除去するために、（1.4節を参照）。デブラッドフォードアッセイを用いてtermineタンパク質濃度（1.6節を参照）。 </li></ol></li><li> 合成前の準備 <ol><li> 、水中の窒素ガスボンベに接続されたチューブを配置ラップフィルムで容器を密封し、約60分間窒素ガスをバブリングすることによって脱イオン水500mlを脱酸素。 </li><li> 65°Cに二重ジャケット付き反応容器に接続された水浴を加熱します。約20分間の緩衝液に窒素ガスをバブリングして、反応容器中に50 mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）緩衝液（pH 8.6）75 mlを加え、容器を密閉し、酸素を除去します。同時に、マグネチックスターラーを用いて緩衝液をかき混ぜます。 </li><li> HEPES緩衝液を脱酸素した後、バッファからの窒素ガスの供給管を除去し、窒素雰囲気を維持する容器中に懸濁させておきます。 3ミリグラム/ Mの最終濃度を達成するために、アポフェリチンを追加リットル。磁気攪拌を継続したが、発泡が発生した場合、撹拌速度を低下させます。 </li><li>脱酸素した脱イオン水50mlに0.19グラムを溶解することにより、硫酸コバルト七水和物の25 mMストック溶液を調製します。 </li><li>脱酸素脱イオン水100ml 0.98 gで溶解させてアンモニウム硫酸鉄六水和物溶液の25mMの溶液を調製します。 </li><li>アンモニウム硫酸鉄六水和物溶液を2.5ミリリットルを削除し、硫酸コバルト七水和物の2.5ミリリットルと交換してください。 </li><li>最初の脱酸素脱イオン水9 mlの過酸化水素溶液（30％w / w）のの965μLを添加し、次いで99 mlにこのサブストックを1ml添加することにより脱酸素脱イオン水中の過酸化水素の8.33ミリモルの溶液を調製します脱酸素した脱イオン水。 </li></ol></li><li> Magnetoferritin合成 <ol><li> sの磁気（アポフェリチン溶液中に同時に鉄コバルト前駆体と過酸化水素の両方の10.1ミリリットルを注入しtirred）は、2つのシリンジポンプ（注入された総体積用いて0.15 ml /分の流速：20.2ミリリットル）。 </li><li>注入期間中に、脱イオン水をさらに500ミリリットル脱酸素。 注：反応容器の内容物を徐々に反応が進行するにつれて、暗褐色の色を採用しています。 </li><li>間もなく最初の注射が完了する前に、鉄 - コバルト前駆物質と新たに脱酸素脱イオン水を使用して、過酸化水素溶液の別の100mlと準備します。 </li><li>鉄コバルトと過酸化水素の新たに調製された溶液を用いて、1.3.1で説明した射出工程を繰り返します。 </li><li>噴射期間中に、脱イオン水の別の500ミリリットルを脱酸素化し、1.3.3と1.3.4で説明したように進みます。 </li><li> 3回目の注射の後、撹拌下で15分間成熟するソリューションを残します。 </li><li>溶液中の遊離金属イオンをキレート化するために、反応容器に1 Mクエン酸ナトリウム溶液1.5mlを加えます。 </li><li>反応からの溶液を除去50ミリリットルの遠心分離管、4350×gで30分間遠心分離し、0.22μmのシリンジフィルターを通して上清を渡すに容器。この段階で、濾過した上清を精製まで4℃で保存することができます。 </li></ol></li><li> イオン交換クロマトグラフィー <ol><li> 10ml /分の流量で、蠕動ポンプを使用して、カチオン性マトリックスを含有するカラム（長さ20cm直径2.5cm）にサンプルをロードします。 </li><li> 10ml /分の流速で勾配ポンプを用いて緩衝液（50mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液、pH 8.0）を実行して約100mlでカラムを洗浄します。 </li><li> 150、500から1,000 mMの最終NaCl濃度、各濃度を150ml：タンパク質を溶出し、トリス緩衝液中の塩化ナトリウム（NaCl）の濃度を増加させて10ml /分でカラムを洗浄します。 </li><li>タンパク質は、500mMのNaCl濃度で溶出するように、自動化されたフラクションコレクターを使用して、50ミリリットルの画分でそれを集めます。 注：についてイオン交換クロマトグラフィーの詳細なプロトコールは、以前に公開されたプロトコルを参照してください。 26 </li></ol></li><li> サイズ排除クロマトグラフィー <ol><li> 4ml容量部でを15 mlの遠心フィルターユニットを用いて約2 mlの容量にmagnetoferritin 150mlのを濃縮します。この手順の詳細なプロトコルのための（材料のリストを参照）遠心分離フィルターユニットの製造元の説明書を参照してください。 </li><li>注入ループを用いたゲルろ過カラムに濃縮サンプルをロードします。 </li><li> 1.3 ml /分の流速で（150mMのNaClを含む50mM Tris緩衝液、pH8.0）でランニングバッファーでカラムを洗浄します。 </li><li>自動化されたフラクションコレクターを使用して6ミリリットルの画分を収集します。タンパク質単量体は、最後の溶出します。この時点で、精製magnetoferritinはカチオン化まで4℃で保存することができます。 NOTE：ゲルろ過カラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーの詳細なプロトコルは、相談のためpreviouslyプロトコルを発表しました。 27 </li></ol></li><li> タンパク質濃度を決定します <ol><li>市販のウマ脾臓フェリチンを用いて、50mMのトリス緩衝液中で0.06、0.125、0.25、0.5及び1 mg / mlでのフェリチン基準を準備します。 注：市販のフェリチンのタンパク質濃度は、ボトルに記載されています。ない場合は、この情報をサプライヤーにお問い合わせください。 </li><li>溶液の色は、約0.5 mg / mlで標準の色と一致するまで、50mMのトリス緩衝液中の未知の濃度のmagnetoferritinサンプルを希釈します。希釈係数をメモします。 </li><li> 96ウェルプレートのウェルに三連の各標準とmagnetoferritin10μlのサンプルを追加します。 </li><li> （ブラッドフォードアッセイ試薬の詳細については、材料リストを参照）を各ウェルに既製のBradford試薬200μlのを追加します。 </li><li> 8分間室温でインキュベートします。 </li><li>使用してλ= 595 nmの吸光度を測定しますマイクロプレートリーダー。 </li><li>タンパク質濃度の関数としてのフェリチン標準の吸光度を意味し、magnetoferritin試料の濃度を計算するために線形フィットの傾き及び切片を使用してプロットします。 注：アカウントに標準曲線にmagnetoferritinサンプルを調整するために使用された希釈倍率を取ります。 </li></ol></li></ol> 2. Magnetoferritinカチオン化<ol><li> 総説 注： - （3-ジメチルアミノプロピル） - N &#39;エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）magnetoferritinのカチオンは、N、Nをジメチル-1,3-プロパンジアミン（DMPA）は、Nを用いてMF表面にアスパラギン酸およびグルタミン酸残基に結合させました。 <ol><li>攪拌下、室温で反応を行います。下記のプロトコルを5ml（タンパク質濃度を2mg / ml） を全量magnetoferritinを10mgのカチオン化のためのものです。しかし、アップまたはスケールダウンDMPA：EDC比一貫性、ならびに緩衝液およびmagnetoferritin液の容量の蛋白質を保つことによって。 </li><li>カチオン化反応に先立って、50mMのNaClを含む50mMリン酸緩衝液（pH 7）にmagnetoferritinサンプルを透析します。これは、トリス溶出緩衝液を除去し、トリスアミンおよびEDC活性化カルボン酸の残基間の望ましくない反応を避けることが重要です。透析後のタンパク質濃度を決定し、カチオン化する前に4mg / mlに調整してください。 </li></ol></li><li> カチオン化プロトコル <ol><li> DMPAの374ミリグラムを秤量し、200mMの2-（Nのモルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝液の2.5ミリリットルに溶解します。 </li><li>濃縮して、（6 M）塩酸（HCl）を用いて、溶液のpHを約7に調整します。 注意：DMPAに酸を添加すると、有毒ガスを放出するように、ドラフト内で、この手順を実行します！ </li><li> 4 mg / mlででmagnetoferritin溶液を2.5ミリリットルを追加します（最終concenMESのtrationは、magnetoferritinの最終濃度が2 mg / mlであり、タンパク質の合計量）は10 mgで100 mmです。 </li><li>平衡化するために2時間磁気撹拌機や撹拌を加えます。 </li><li> 1 M HClを用いてpHを5.0に解決策を慎重に調整します。 </li><li> DMPA / magnetoferritin溶液にEDC粉末の141ミリグラムを追加します。 </li><li> 3.5時間攪拌し続けます。 </li><li>任意の沈殿物を除去するために0.22μmのシリンジフィルターを通して溶液をフィルタリングします。 </li><li>透析緩衝液を交換し、12-14 kDaの分子量カットオフを有する透析チューブに溶液を添加し、4℃で2日間、50mMのNaClを含む50mMリン酸緩衝液（pH 7）の4リットルに対して透析少なくとも三つその期間中回。 注：この時点で、カチオンmagnetoferritinはさらなる使用まで4℃で保存することができます。 </li></ol></li></ol>カチオン化Magnetoferritin 3.ヒト間葉系幹細胞標識<ol><li> 総説 <ol><li&gt;は、37℃、5％二酸化炭素雰囲気でクラスIIクリーンベンチ及び加湿インキュベーターを使用して、すべての細胞培養を行います。 </li><li> 4日間-すべての3補充した175cm 2のフラスコおよび培養培地20mlを用いて単層として培養細胞。培養培地は、1000 mg / Lのグルコースを含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％（v / v）のウシ胎児血清、1％（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシン溶液、1％（v / v）のLから成っ-alanyl -L-グルタミン溶液、および5 ngの/新たに補充mlのヒト線維芽細胞増殖因子。 </li></ol></li><li> カチオン化magnetoferritinでのhMSCの磁気標識 <ol><li>シード15万25cm 2のフラスコへのhMSC、37℃で一晩付着したままにします。 </li><li>フィルタは、0.22μmのシリンジフィルターを通してカチオン化magnetoferritinを殺菌し、タンパク質濃度を決定します。 </li><li>カチオン化magnetoferriの0.5μM溶液を調製、無菌状態を維持リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の錫。使用するまで無菌培養フードに蓋をしてください。 </li><li>室温PBSの2mlで播種した細胞を洗浄。 </li><li>播種した細胞に滅菌したカチオン化magnetoferritin溶液1mlを加え、所望の時間（1分〜1時間）インキュベートします。 </li><li>トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を0.5mlを添加し、5分間37℃でインキュベートすることにより、PBSで細胞を、その後収穫細胞を洗浄します。 </li><li>トリプシン/ EDTAを不活性化する524×gで5分間、15mlの遠心チューブと遠心分離機に溶液を転送するために、培養培地1mlを加えます。 </li><li>上清を捨て、ウシ胎児血清およびPBS中の2mMのEDTA（w / v）の0.5％からなる、0.5ミリリットルで細胞ペレット磁気分離バッファを再懸濁。 </li></ol></li><li> 磁気細胞分離 <ol><li>マルチスタンドに磁石を取り付け、磁石に磁気分離カラムを追加します。目の前の分離フィルタを配置E列。 </li><li>プレ分離フィルタで磁気分離バッファの0.5ミリリットルを置き、フィルタおよび洗浄し、それらを濡らす列の両方を介して実行してみましょう。 </li><li>列の下に15ミリリットルの遠心分離管を配置します。 </li><li>磁気分離カラムのフィルター容器内の細胞懸濁液を0.5mlを加えます。 </li><li>リザーバが空になると、磁気分離バッファの0.5ミリリットルを追加します。 </li><li>リザーバが空になると、磁気分離緩衝液のさらなる0.5ミリリットルを追加します。 </li><li> （洗浄に用いた磁気分離緩衝液の全量を1.5ミリリットルでなければならない）もう一回繰り返します。この洗浄工程は、カラム（非磁化細胞画分）からすべての非磁性細胞を溶出します。 </li><li>磁石から列を削除し、新鮮な15ミリリットルの遠心管に入れてください。カラムリザーバーからフィルターを取り外します。 </li><li>リザーバーに磁気分離緩衝液1mlを加え、直ちに製造により供給されたプランジャーを使用してカラムを押し通しますrを。これは、遠心分離管（磁化細胞画分）にカラムから磁化細胞を溶出します。 </li><li> 524×gで5分間遠心チューブの両方。 </li><li>上清を捨て、0.3ミリリットルのPBSで細胞ペレットを再懸濁。 </li><li>血球計数器を使用して、各画分中の細胞数の数をカウントします。 </li><li>磁化された細胞の割合を決定し、M（％）は、以下の式を用いて。 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/54785/54785eq1.jpg" /> ここで、n（M）は、磁化の画分中の細胞の数およびn（M + NM）は、磁化および非磁化画分中の細胞の数の和です。 </li></ol></li><li> 誘導結合プラズマ発光分光法（ICP-OES）を用いて、鉄定量のためにカチオン化magnetoferritinで標識したhMSCの調製 注：プロトコルは、他のICP-OESの楽器のために適合させる必要があるかもしれません。再と相談することをお勧めしますsponsible技術者。 <ol><li>遠心分離機524×gで5分間、細胞の既知の数。 </li><li> PBSの上清を除去し、50％（v / v）の硝酸の0.25ミリリットルを追加します。 </li><li>渦は、酸性化細胞懸濁液を混ぜます。 </li><li>室温で一晩インキュベートします。 </li><li>各サンプルと渦ミックスに蒸留水4.75ミリリットルを追加します。 </li><li> ICP-OESで分析します。 28 </li><li>細胞の鉄含有量の値を決定するために細胞数を測定した鉄含有量を正規化します。 </li></ol></li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

オーロチオグルコースで染色magnetoferritinサンプルのTEMは、タンパク質ケージの中にナノ粒子の成功石灰化を明らかにしました。電子線回折及びナノ粒子コアのラマン分析は、コバルトとナノ粒子コアの成功ドーピングを示し、コバルトフェライトの存在を示しました。これは、混合酸化物ナノ粒子が正常アポフェリチン空洞内に石灰化することができることを示しています。さらに、我々は、磁気特性の調整を可能にする、反応混合物に加え、コバルトドープコバルト前駆体の量を変えることによって変えることができることが以前に示されています。 18 Magnetoferritin合成は、それらがしっかりとシール可能であり、反応物質を導入することができるようなアクセスポート（ 例えば 、三首丸底フラスコ）を有するように、血管の様々な行うことができます。反応温度は、65℃のいずれかで容器を配置することによって維持されるべきです二重ジャケット付き容器を用いて水/油浴または。ここでは、合成を実行するために二重ジャケット電気化学セルのセットアップを使用していました。合成の成功を保証するために、適切なpHを維持し、水溶液の酸素汚染を回避することが重要です。金属塩溶液は、常に事前にではなく、使用する前に新たに準備する必要があります。また、商業アポフェリチン溶液の品質が変化し、合成結果に影響を与えることができる（ 例えば 、ナノ粒子コアの鉱化のサイズ）。それはメーカーによって使用される任意の残留還元剤を除去するために、合成の前に50mMのHEPES緩衝液（pH 8.6）にアポフェリチン溶液を透析することができます。追加の材料を購入する必要があるべき合成に使用されるアポフェリチン溶液のバッチ番号をメモしておくことが有用であるので、それは、具体的には、メーカーから要求することができます。また、市販のアポフェリチンのタンパク質濃度は、缶、ボトルに記載すべき合成に必要なアポフェリチン溶液の体積を計算するために使用されます。そうでない場合は、この情報をサプライヤーにお問い合わせください。 金属塩および過酸化水素を徐々に添加することの利点-ここに提示され、以前の報告のように-は、ナノ粒子コアの石灰化は、異なる負荷率（ すなわち、ナノ粒子のサイズ）を実現することができるように制御することができることです。 図33はまた、さらに、磁気分離カラム、 例えば、電磁石の内部に固定されたステンレス鋼粉末を充填したカラムを用いてmagnetoferritin精製することが可能です。 図34はこのように、高度に単分散ナノ粒子コアは、バルクmagnetoferritinサンプルから単離することができます。ここで提示されるようしかしながら、磁気細胞標識のためにこれは必要ありません。 magnetoferritin合成の限界は10％程度の比較的低い合成収率、および市販のアポFE比較的高コストでありますrritinソリューション。しかしながら、アポフェリチンはまた、確立された脱石灰化プロトコルに従うことによりフェリチン安価に入手できるウマ脾臓から調製することができます。 16 magnetoferritinのカチオンは、DMPAの250分子およびEDCあたり負に荷電した残基（ウマ脾臓フェリチンのアミノ酸配列に基づいて計算）の50分子のモル比を加えることによって達成しました。タンパク質を超える試薬のこの過剰は、以前、フェリチンのカチオン化のために結果を報告するためにも匹敵する、高カチオン化効率が得られました。 MALDI-TOF分析、アポフェリチンとカチオンアポフェリチン35が原因magnetoferritinコアの過度の分子量を用いました。高カチオン化効率を得るために、最適なpHも重要です。 EDC媒介架橋は、穏やかな酸性条件下で最も効果的であり、我々は、pH 5はmagnetoferritinに最適なカチオンの結果が得られたことがわかりました。しかしながら、他のタンパク質CのationizationのpHが最適化される必要があるかもしれません。これは深刻な降水量につながる可能性があるためで、カチオンまたはタンパク質の等電点に近いが、避けるべきです。 カチオン化magnetoferritinで幹細胞の磁化は非常に効率的であり、インキュベーション時間井戸下30分を使用して達成することができます。 1分間のインキュベーションは、MRIのためにT2及びT2 *コントラストに影響を与えるために必要な報告範囲内である3.6 PGの細胞の鉄含有量をもたらしました。 36,37なお、この効率的な標識化は、低細胞外の鉄濃度で達成されていることも注目すべきです。例えば、陰イオン性ナノ粒子を用いた以前の研究は、5 mMの鉄と30分間のインキュベーション期間後、細胞あたり10のPGの鉄レベルを報告します。 38と比較して、0.5μMタンパク質を含むカチオン化magnetoferritin溶液とのインキュベーションは、約0.2mMの鉄とのインキュベーションに対応し、また、セルあたりの鉄の約10 PGを生じます30分後リットル。私たちは、明らかに、TEMを用いて、任意のエンドサイトーシス小胞を識別することができませんでした。しかし、カチオン化フェリチンを用いた以前の研究は、内在は、露光の最初の10分以内に発生したことがわかりました。 39,40カチオン化フェリチンは、クラスリンまたはカベオリン依存性エンドサイトーシスを示す、被覆小胞に局在することができました。同様の研究はまた、インキュベーションの30分後、フェリチンをカチオン化することが報告リソソームに似ている、まだ細胞表面上、ならびに多胞体中に存在しました。 さらなる用途は、抗がん剤41または量子ドット42のような他のナノ粒子および/または機能性分子、を装填アポフェリチンケージのカチオンを含むことができます。これらのフェリチンの構築物のカチオンは、細胞への貨物のより速く、より効率的な配信につながる可能性があります。

結合または超常磁性酸化鉄ナノ粒子（SPIONs）の内部表面は、イメージングや遠隔操作などのアプリケーションのための種々の細胞型の磁化を可能にしました。 1ただし、十分な細胞の磁化を達成するSPIONと細胞表面との間の相互作用が弱い場合は特に、挑戦することができます。過去に2は 、長時間の曝露または高SPION濃度は、この課題を克服するための戦略として採用されてきました。彼らは毒性5,6を高め、リンパ球などの低内在化率、との細胞型において非常に限られた成功を持っているので、3,4はそれにもかかわらず、これらの戦略は問題があります。 7 SPIONsの細胞取り込みを強化するために、いくつかの表面機能化のアプローチが検討されています。非特異的な取り込みは、トランスフェクションaを使用して達成することができるが、例えば、抗体は、受容体媒介性エンドサイトーシス、8を促進するために使用されています紳士9,10または例えば、HIVのTATペプチドなどの細胞侵入種。トランスフェクション剤は、ナノ粒子の沈殿を誘導し、不利に細胞機能に影響を与えることができるながら11,12しかしながら 、抗体とペプチド官能化アプローチは、高価な試薬と複合合成調製物によって制限されます。 13,14 我々は最近、化学的にカチオンmagnetoferritinの合成、1分という短いインキュベーション時間を用いて磁化のヒト間葉系幹細胞（hMSC）に非常に有効であった新規SPIONを報告しました。 15 Magnetoferritin鉄貯蔵タンパク質フェリチンの脱イオンキャビティ内SPIONを再構成することにより合成されます。 16このタンパク質ベースのSPIONは、磁気コアの磁気特性を制御、17-19と生体適合性とタンパク質の殻によって付与される水への溶解度などの細胞磁化のため、それが十分に適したものにする多くの特性を、兼ね備えています。さらにより、表面機能化を容易に起因化学20-22または遺伝的に改変することができるアドレス可能なアミノ酸に達成されます。 23-25我々は、タンパク質殻の酸性アミノ酸残基の化学的なカチオンは、容易に迅速かつ持続的な細胞磁化に導く細胞表面上のアニオン性ドメインと相互作用し、安定なナノ粒子を生成することが示されています。この手順は、面倒で官能化および長いインキュベーションプロトコルの必要性を排除し、そして非特異的ラベル付け機構によってこの急速な磁化戦略は、他の細胞型における広範囲の用途を見出すべきです。ここでは、カチオン化magnetoferritinの合成、精製および表面官能化の詳細なプロトコルを含む超高速細胞標識法の深さでレポートを提示します。

<table><tbody><tr><td>4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BPE310-1</td><td>粉末; pH 8.6 の 1 M ストック溶液を調製し、50&nbsp;mMを使用してください。合成前にpHをよくチェックしてください!</td></tr><tr><td>馬の脾臓からのアポフェリチン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3641</td><td>LOT# 081M7011V</td></tr><tr><td>コバルト硫酸塩七水和物を使用しました&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6768</td>は<td>、合成前に塩から新鮮な溶液を調製</td></tr>します アン<tr><td>モニウム硫酸鉄六水和物&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1543</td><td>合成前に塩から新鮮な溶液を調製</td></tr><tr><td>過酸化水素溶液 (30%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td>合成前に塩から新鮮な溶液を調製</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1804</td><td>粉末; 1 M 溶液を調製し、室温で数ヶ月間保持できます</td></tr><tr><td>Millex GP フィルターユニット、0.22&nbsp;ミクロン</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>シリンジ フィルター</td></tr><tr><td>Trizma ベース</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td>粉末; pH 8.0 の 1 M ストック溶液を調製し、50&nbsp;</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434</td><td>poweder を使用する前に、必要に応じてバッファーに追加してください</td></tr><tr><td>Centriprep 遠心フィルターユニット</td><td>Merck Millipore</td><td>4310</td><td>Ultracel YM-50 メンブレン、容量 12 mL; マグネトフェリチン溶液が約 150 ml から 20 ml に濃縮されるまで初期濃縮に使用してください。ml</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 遠心フィルター untis</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC801024</td><td>Ultracel-10 メンブレン, 4&nbsp;ml容量;約20mlからマグネトフェリチン溶液を濃縮するために使用します&nbsp;2 ml</td></tr><tr><td>ANX セファロース 4 ファスト フロー</td><td>GE ヘルスケア</td><td>17-1287-04</td><td>このカラムを自分で詰めました</td></tr><tr><td>HiPrep 26/60 セファクリル S-300 HR カラム&nbsp;</td><td>GEヘルスケア</td><td>17-1196-01</td>この<td>コラムは、準備ができて梱包された</td></tr><tr><td>購入されました&Auml;KTA清浄機システム</td><td>GEヘルスケア</td><td>28406264</td><td></td></tr><tr><td>サンプルポンプ P-960</td><td>GEヘルスケア</td><td>18-6727-00</td><td>10ml/分の流量でサンプルをロード</td></tr><tr><td>自動フラクションコレクター Frac-950</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-00</td><td></td></tr><tr><td>ブラッドフォードアッセイ試薬</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>B6916</td><td>溶液 すぐに使える</td></tr><tr><td>フェリチン、タイプI:馬の脾臓から</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F4503</td>は<td>、この溶液からフェリチン標準を調製して、マグネトフェリチン濃度</td></tr><tr><td>N,N-ジメチル-1,3-プロパンジアミン(DMPA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>308110</td><td>注意:DMPA溶液のpHを調整する場合は、ヒュームフードでこの手順を実行</td></tr>してください<tr><td>N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6383</td><td>冷凍庫で保管しますが、ボトルを開ける前に室温に戻します</td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)エタンスルホン酸 (MES)</td><td>AppliChem</td><td>A0689,0500</td><td>粉末; pH 5 で 200 M ストック溶液を準備し</td></tr>ます 透<tr><td>析チューブ セルロース膜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9652</td><td>使用</td></tr><tr><td>前に脱イオン水に 10 分間浸しますダルベッコのモディファイドイーグル」s Medium (DMEM)、1,000 mg/L グルコース</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5546</td><td>37 °C 温;Cウォーターバス使用前の</td></tr><tr><td>胎児ウシ</td>血清<td>シグマアルドリッチ</td><td>F7524</td>在庫<td>DMEMボトル、10%(v / v)最終濃度</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン溶液</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P0781</td>在庫<td>DMEMボトル、1%(v / v)最終濃度</td></tr><tr><td>グルタマックス溶液</td><td>Gibco</td><td>35050-087</td>在庫<td>DMEMボトル、1%(v / v)最終濃度</td></tr><tr><td>ヒト線維芽細胞成長因子</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td>は、<td>各培地の変更で細胞培養フラスコに新たにDMEMに加えます;最終濃度5 ng / ml</td></tr><tr><td>のリン酸緩衝生理食塩水</td><td>シグマAldrich</td><td>D8537</td><td>滅菌溶液、細胞カルトゥル</td></tr><tr><td>トリプシン/ EDTA溶液</td><td>シグマAldrich</td><td>E5134</td>は<td>冷凍庫に保管し、37&nbspで解凍します。&deg;エ</td></tr><tr><td>チレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td> 粉末を使用する前に C ウォーターバス<td>; PBS で 2 mM 溶液を作る&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td>は<td>、0.5%(w / v)を2&nbspに加えます。PBS中のmM EDTA溶液;マグネチックスターラーで慎重に攪拌し、泡立ちを避けます。0.22ミクロンシリンジ</td></tr><tr><td>フィルターMACSマルチスタンドでフィルター滅菌します&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>MACSマグネット</td></tr><tr><td>MACS MSカラム</td>の取り付け用<td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td>使い捨て<td>;使い捨て;使い捨てですが、単回使用を目的としていますが、無菌性が必要ない場合は、再利用することができます:脱イオン水と100%エタノールで洗浄し、乾燥オーブンに入れます;錆びたパッチ</td></tr><tr><td>MiniMACSセパレーターマグネット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td>を観察した場合は廃棄しますスターターキットとして購入でき、カラムとスタンドと一緒に</td></tr>購入できます <tr><td>MACSカラム事前分離フィルター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td>30 mmフィルター</td></tr><tr><td>硝酸溶液、64-66%</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>7006</td><td></td></tr><tr><td>タイトランド 907、シリンジポンプ</td><td>メトローム</td><td>2.907.0020</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipmentは、マグネトフェリチンおよびカチオン化マグネトフェリチンの特性評価に使用されます</td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>分子デバイス</td><td></td><td>ブラッドフォードアッセイの吸光度測定に使用</td></tr><tr><td>JEM 1200 EX</td><td>JEOL</td><td></td><td>マグネトフェリチンのTEMイメージングに使用</td></tr><tr><td>InVia ラマン分光計</td><td>レニショー</td><td></td><td>ラマン分光法に使用</td></tr><tr><td>Torus DPSS レーザー</td><td>レーザー 量子</td><td></td><td>ラマン分光法に使用</td></tr><tr><td>ブルカーUltrafleXtreme</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>アポフェリチンおよびカチオン化アポフェリチンのMALDI-TOF分析に使用</td></tr><tr><td>ゼータサイザー Nano-ZS</td><td>マルバーン機器</td><td></td><td>マグネトフェリチンおよびカチオン化マグネトフェリチンの流体力学的直径とゼータ電位の測定に使用</td></tr><tr><td>磁気特性測定システム</td><td>量子設計</td><td></td><td>磁気飽和モーメントと磁化率の測定に使用</td></tr><tr><td>Magnetom Skyra</td><td>Siemens</td><td></td><td>縦方向および横方向の緩和性を決定するために使用されます&nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnai 12 BioTwin</td><td>Spirit FEI</td><td></td><td>カチオン化マグネトフェリチン</td></tr><tr><td>710 ICP-OES</td><td>アジレント</td><td></td>で標識されたhMSCのTEMイメージングに使用 <td>細胞内の鉄含有量の測定に使用</td></tr></tbody></table>

細胞の超高速磁化のためのカチオン化magnetoferritinの合成

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

そのような細胞イメージング及び遠隔操作などの多くの重要な生物医学的用途は、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（SPIONs）で細胞を標識することによって達成することができます。 SPIONsの十分な細胞取り込みを達成することは、伝統的にSPIONsの濃度上昇に細胞を曝露することによって、または（72時間まで）露光時間を延長することによって満たされている課題です。しかしながら、これらの戦略は、毒性を媒介する可能性があります。ここでは、タンパク質ベースのSPIONのmagnetoferritinの合成と同様に低い暴露濃度を使用して、迅速な細胞磁化を可能にする容易な表面機能化プロトコルを提示します。 magnetoferritinのSPIONコアは馬の脾臓アポフェリチンの空洞内の8.2 nmの鉱化の平均粒径を持つコバルトがドープされた酸化鉄で構成されています。 magnetoferritinの化学的なカチオンは、インキュベーション時間などを用いて、ヒト間葉系幹細胞（hMSC）の磁化新規な、高度に膜活性SPIONを生成しました0.2 mmの安値として1分と鉄濃度と短いです。

TEMは、アポフェリチン空洞内のナノ粒子の石灰化を確認し、平均コアサイズ（ 図1Aおよび1B）を決定するために使用しました。未染色magnetoferritinサンプルの画像解析は、8.2±0.7 nmの平均コア直径を与え、アウロチオグルコース染色は、タンパク質ケージ内のナノ粒子の存在を確認しました。画像はさらに均一なナノ粒子コアを分離するために磁気分離を用いて精製したmagnetoferritinサンプルを示すことに注意してください。磁気的に精製しなかったMagnetoferritinサンプルはわずかに広いコアサイズ分布を有します。 29選択されたエリアの電子回折を用いmagnetoferritinコアの構造の解析マグネタイトに基づいて逆スピネル構造の存在の可能性を示した鉄（Fe 3 O 4）および/またはマグヘマイト（γ-Fe 2 O 3）、並びにスピネル構造のCo 3に起因します</サブ&gt; O 4。また、ラマンスペクトルは、Fe 3 O 4、小さなγ- の Fe 2 O 3の量、及びコバルトフェライト（ 図1C）に起因するピークを明らかにしました。 magnetoferritinのICP-OES分析はmagnetoferritinのミリグラムあたりのコバルトの鉄の102μgの0.9μgの平均を示しました。 概略的には、その後のカチオン化工程（ 図2 A）を示す、含まれています。動的光散乱によって決定されるようmagnetoferritinとカチオン化magnetoferritinの流体力学的直径は、それぞれ11.8±1.1 nmおよび12.5±1.4nmでした。 magnetoferritinへの共有DMPA結合のカチオン効率はゼータ電位差及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（MALDI-TOF）質量分析法を用いて評価しました。ゼータ電位は確認し、カチオン化magnetoferritinための+ 8.3 mVのにMFのために-10.5 mVのから変更しました負から正への表面電位の変化（ 表1）。質量分析実験は、カチオン化アポフェリチン（ 図2 B）のネイティブアポフェリチンと21.1 kDaのための20.1キロダルトンのサブユニット分子量を見つけました。この質量増加は、約12結合DMPAタンパク質サブユニットあたりの分子、および全体の24サブユニットタンパク質の288残基のカチオンに対応します。 磁気飽和および感受性はSQUID磁気測定を用いて測定し、横方向および縦緩和は、磁気共鳴イメージングを用いて測定しました。磁気特性は、カチオンが封入SPION（ 表1）の磁気特性にほとんど影響を与えたことを示す、magnetoferritinとカチオン化magnetoferritinについて同様でした。さらに、これらの特性は、他の酸化鉄系ナノ粒子、マグネのカチオン19,30実証に似ていますtoferritinは、イメージングのコントラストを高めることで、従来のSPIONベースのMRI造影剤と同様に適しているであろう。 30分間曝露した後、細胞表面に密カチオンmagnetoferritin（ 図3A）で覆った。しかし、1週間後に、何のナノ粒子は、細胞表面（ 図3 B）上で見つかりませんでした。カチオン化magnetoferritinは、磁気標識のhMSCで著しく効果的でした。注目すべきことに、1分間カチオンmagnetoferritinに細胞を曝露する細胞集団の92％の磁化と細胞あたりの鉄の3.6 PGの送達をもたらしました。 15分のインキュベーション時間を増加させると、全体の細胞集団（ 図3 C）の磁化をもたらしました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54785/54785fig1.jpg" /> 図1：magnetof のキャラクタリゼーション<html> erritinコアを、5％のコバルトをドープしました。オーロチオグルコース（A）および非染色（B）で染色magnetoferritinのTEM像。挿入図は、マグネタイトインデックスと対応する電子線回折を示しています。スケールバー：20 nmの。 magnetoferritin用（C）ラマンスペクトル。矢印は、コバルトフェライト（Tの2グラム ）、マグネタイト、マグヘマイト（1グラムの両方）のための主要なラマン振動モードを示しています。 31,32用いるレーザー波長は532 nmでした。 （奥田ら18から適応イメージ）。このmagnetoferritinサンプルがさらに均一にロードされたmagnetoferritin粒子を単離した磁気分離を用いて精製されていたことに注意してください。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54785/54785fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 785fig2.jpg &quot;/&gt; 図2：magnetoferritin のカチオン化。 A）タンパク質表面上の酸性（赤色の分布）および塩基（黄色）のアミノ酸残基を示す溶媒アクセス可能表面積表現。 Magnetoferritin（1）〜（3）タンパク質表面上の酸性アミノ酸残基にDMPAのカルボジイミド媒介架橋によりカチオンmagnetoferritin（2）に変更します。アポフェリチンのB）質量分析とアポフェリチンサブユニットをカチオン化。アポフェリチンの質量対電荷（m / z）スペクトル（ApoF）およびMALDI-TOFによって生成されたカチオンアポフェリチン（CAT-ApoF）。 21.1キロダルトンの20.1キロダルトンの質量の増加は、カチオン化後に観察されます。 （画像はコレイアCarreira ら 15から適応） <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54785/54785fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図3： 磁気標識およびカチオン化magnetoferritinとインキュベートしたhMSCの細胞分離。カチオン化magnetoferritinで30分間のインキュベーション後のhMSCのA）TEM像。矢印は、密に細胞表面上に充填しmagnetoferritinコアの存在を示します。スケールバー：200nmで。標識後のhMSC 1週間のB）TEM像。細胞表面は、カチオン化magnetoferritinのは明らかです。磁気標識の迅速性を調査C）：細胞集団の92％はmagnetoferritinをカチオン化0.5μMで1分間の曝露後に着磁し、全体の細胞集団は、15分以内に磁化されました。細胞当たりの鉄含有量は、ICP-OESを用いて測定しました。 3つの生物学的複製物の平均値と標準偏差を示します。コレイアCarreira らから適応（画像15） <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54785/54785fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> MF </td><td> 猫-MF </td></tr><tr><td> 流体力学的直径[nm]で </td><td> 11.8±1.1 </td><td> 12.5±1.4 </td></tr><tr><td> ゼータ電位[MV] </td><td> （ - ）10.4±0.2 </td><td> 8.3±0.7 </td></tr><tr><td> 磁気飽和モーメント[アム2キロ -1] </td><td> 54.9±1.6 </td><td> 55.3±1.4 </td></tr><tr><td> [10 4メートル 3キロのx -1]質量磁化率 </td><td> 1.75±0.08 </td><td> 1.75±0.07 </td></tr><tr><td>縦緩和さ[mm -1秒-1] </td><td> 2.6±0.1 </td><td> 2.3±0.1 </td></tr><tr><td> 横緩和度[mMの-1秒-1] </td><td> 44.6±1.0 </td><td> 52.8±0.8 </td></tr></tbody></table> 表1：magnetoferritin の物理化学的特性評価（MF）とカチオン化magnetoferritin（猫-MF）。 （表はコレイアCarreira ら15から適応しました）

コバルトドープマグネトフェリチンの合成とカチオン化のためのプロトコールと、カチオン化マグネトフェリチンで幹細胞を迅速に磁化する方法が紹介されています。

細胞の超高速磁化のためのカチオン化Magnetoferritinの合成

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

本手法の全体的な目的は、タンパク質ケージ内部で磁性ナノ粒子を合成し、次いで、磁性ナノ粒子を細胞へ迅速に付着させることができるようタンパク質を機能化することです。この手法は、細胞の迅速かつ効率的な磁気ラベル化を可能にする磁性ナノ粒子の作製に使用でき、これはMRIや磁気細胞分離などのアプリケーションにおいて重要です。本技術の主な利点は、低濃度のナノ粒子と短時間のインキュベーションで細胞の磁性化を達成できることであり、これによりナノ粒子への曝露による潜在的な悪影響を防ぐことができます。まず、脱イオン水 500 milliliters に窒素ガスシリンダーに接続したチューブを挿入し、容器をラップで密閉して脱酸素を行います。その後、窒素ガスを約 60 minutes 間バブリングさせます。二重ジャケット反応容器に接続されたウォーターバスを 65 degrees Celsius まで加熱します。次に、50 millimolar HEPES緩衝液（pH 8.6）75 millilitersを反応容器に加えます。容器を密閉し、緩衝液中に窒素ガスを約20分間バブリングして脱酸素化します。同時に、マグネチックスターラーを用いて緩衝液を撹拌します。HEPES緩衝液の脱酸素処理後、窒素雰囲気を維持するために窒素チューブを液面上に保持したまま、緩衝液から取り出します。最終濃度が3 mg/mLとなるようにアポフェリチンを加えます。磁気攪拌を継続しますが、泡が発生した場合は攪拌速度を下げてください。マグネトフェリチンの合成には、2台のシリンジポンプを用いて、鉄・コバルト前駆体10.1 millilitersと過酸化水素10.1 millilitersを、0.15 milliliters/minの流速でアポフェリチン溶液に同時に注入します。その後、テキストプロトコルに記載されている合成手順を継続します。次に、ペリスタルティックポンプを使用し、10 milliliters/minの流速でサンプルをカチオン性マトリックスを含むカラムにロードします。グラジエントポンプを用い、流速 10 milliliters/min でカラムを約 100 milliliters のランニングバッファーで洗浄します。タンパク質を溶出させるため、塩化ナトリウム濃度を上昇させた Tris バッファー 150 milliliters を 10 milliliters/min でカラムに流します。タンパク質が塩化ナトリウム濃度 500 millimolar で溶出されるため、自動分画回収装置を用いて 50 milliliters ずつ分画して回収します。15 mLの遠心ろ過ユニットと、それに続く4 mLのユニットを用いて、150 mLのマグネトフェリチンを約2 mLの容量まで濃縮します。この手順の詳細なプロトコルについては、遠心ろ過ユニットの製造元の指示書を参照してください。次に、注入ループを使用して、濃縮したサンプルをゲルろ過カラムにロードします。流速 1.3 milliliters per minute でランニングバッファーを用いてカラムを洗浄します。自動分画回収装置を用いて、6 milliliter ずつ分画して回収します。タンパク質のモノマーは最後に溶出します。この時点で、精製したマグネトフェリチンはカチオン化まで4 °Cで保存することが可能です。10 mgのマグネトフェリチンに対し、374 mgのDMPAを量り取り、2.5 mLの200 mM MES緩衝液に溶解させます。濃塩酸を用いて、溶液のpHを約7に調整します。塩酸を用いてDMPA溶液のpHを調整すると、有毒なガスが発生します。必ずドラフトチャンバー内でこれらの材料を取り扱ってください。4 mg/mLの濃度で調製したマグネトフェリチン溶液を2.5 mL添加します。マグネチックスターラーを加え、平衡状態にするため2時間撹拌します。溶液をpH 5.0に調整した後、141 mgのEDC粉末をDMPAマグネトフェリチン溶液に加えます。そのままさらに3時間半撹拌を続けます。沈殿物を除去するため、溶液を0.22 micronのシリンジフィルターでろ過し、テキストプロトコルに従ってタンパク質を透析します。テキストプロトコルに従ってhMSCを培養します。播種した細胞を2 mLの室温PBSで洗浄します。次に、プレートに播種した細胞に、滅菌済みのカチオン化マグネトフェリチン溶液を1 mL加え、任意の時間インキュベートします。細胞をPBSで洗浄し、0.5 mLのTrypsin-EDTAを加えて37 °Cで5分間インキュベートして細胞を回収します。Trypsin-EDTAを不活化させるために1 mLの培地を加えた後、溶液を15 mL centrifuge tubeに移し、524 ×gで5分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを0.5 mLの磁気分離バッファーで再懸濁します。次に、マルチスタンドにマグネットを取り付け、マグネットに磁気分離カラムを装着します。カラムに分離前フィルターを設置してください。その後、分離前フィルターに磁気分離バッファーを0.5 milliliters加え、フィルターとカラムの両方を通過させて洗浄します。次に、15 mL遠心チューブをカラムの下に配置し、0.5 mLの細胞懸濁液を磁気分離カラムのフィルターリザーバーに加えます。リザーバーが空になったら、0.5 mLの磁気分離バッファーを加えます。再びリザーバーが空になったら、さらに0.5 mLの磁気分離バッファーを加えます。洗浄をもう一度繰り返し、磁気分離バッファーの総量を1.5 millilitersにします。この洗浄ステップにより、磁性を持たないすべての細胞がカラムから溶出されます。カラムを磁石から取り外し、新しい15 milliliter遠心チューブに入れます。次に、カラムリザーバーからフィルターを取り除きます。リザーバーに磁気分離バッファーを1 milliliter加え、メーカー提供のプランジャーを使用して直ちにカラムを押し出します。これにより、磁気的に捕捉された細胞がカラムから遠心チューブ内へ溶出されます。本文のプロトコルに従って鉄の定量を行ってください。ネガティブ染色したマグネトフェリチンの透過電子顕微鏡画像により、タンパク質ケージ内部にナノ粒子が形成されていることが示されました。ゼータ電位測定により、カチオン化後、マグネトフェリチンが正の表面電荷を持つことが確認されました。ヒト間葉系幹細胞をカチオン化マグネトフェリチンに1分間曝露させたところ、細胞集団の92%が磁性化され、1細胞あたり3.6 picogramsの鉄が導入されました。インキュベーション時間を15分に延長すると、細胞集団全体が磁性化されました。このビデオを視聴することで、タンパク質溶液に金属塩前駆体を順次添加し、アポフェリチン腔内に磁性ナノ粒子を合成する方法について理解することができます。次に、TMPAカップリングを用いてタンパク質を化学的にカチオン化する方法を説明します。習得すれば、適切に行うことでマグネトフェリチンの合成、精製、およびカチオン化を3日間で完了させることができます。この手順を行う際は、酸素混入を避け、マグネトフェリチンの合成を通じて適切な温度とpHを維持することが重要です。本手順に続き、量子ドットや治療薬などの他の貨物をカチオン化したアポフェリチンケージに封入することで、これらの物質を細胞へより効率的に輸送することが可能です。この手法は、磁気細胞操作の分野の研究者が、ナノ粒子の取り込み効率が低い細胞や、ナノ粒子の長時間曝露または高濃度曝露に非常に敏感な細胞における磁気標識を探索するための道を開く可能性があります。

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