細胞の超高速磁化のためのカチオン化Magnetoferritinの合成

本手法の全体的な目的は、タンパク質ケージ内部で磁性ナノ粒子を合成し、次いで、磁性ナノ粒子を細胞へ迅速に付着させることができるようタンパク質を機能化することです。この手法は、細胞の迅速かつ効率的な磁気ラベル化を可能にする磁性ナノ粒子の作製に使用でき、これはMRIや磁気細胞分離などのアプリケーションにおいて重要です。本技術の主な利点は、低濃度のナノ粒子と短時間のインキュベーションで細胞の磁性化を達成できることであり、これによりナノ粒子への曝露による潜在的な悪影響を防ぐことができます。

まず、脱イオン水 500 milliliters に窒素ガスシリンダーに接続したチューブを挿入し、容器をラップで密閉して脱酸素を行います。その後、窒素ガスを約 60 minutes 間バブリングさせます。二重ジャケット反応容器に接続されたウォーターバスを 65 degrees Celsius まで加熱します。

次に、50 millimolar HEPES緩衝液（pH 8.6）75 millilitersを反応容器に加えます。容器を密閉し、緩衝液中に窒素ガスを約20分間バブリングして脱酸素化します。同時に、マグネチックスターラーを用いて緩衝液を撹拌します。

HEPES緩衝液の脱酸素処理後、窒素雰囲気を維持するために窒素チューブを液面上に保持したまま、緩衝液から取り出します。最終濃度が3 mg/mLとなるようにアポフェリチンを加えます。磁気攪拌を継続しますが、泡が発生した場合は攪拌速度を下げてください。

マグネトフェリチンの合成には、2台のシリンジポンプを用いて、鉄・コバルト前駆体10.1 millilitersと過酸化水素10.1 millilitersを、0.15 milliliters/minの流速でアポフェリチン溶液に同時に注入します。その後、テキストプロトコルに記載されている合成手順を継続します。次に、ペリスタルティックポンプを使用し、10 milliliters/minの流速でサンプルをカチオン性マトリックスを含むカラムにロードします。

グラジエントポンプを用い、流速 10 milliliters/min でカラムを約 100 milliliters のランニングバッファーで洗浄します。タンパク質を溶出させるため、塩化ナトリウム濃度を上昇させた Tris バッファー 150 milliliters を 10 milliliters/min でカラムに流します。タンパク質が塩化ナトリウム濃度 500 millimolar で溶出されるため、自動分画回収装置を用いて 50 milliliters ずつ分画して回収します。

15 mLの遠心ろ過ユニットと、それに続く4 mLのユニットを用いて、150 mLのマグネトフェリチンを約2 mLの容量まで濃縮します。この手順の詳細なプロトコルについては、遠心ろ過ユニットの製造元の指示書を参照してください。次に、注入ループを使用して、濃縮したサンプルをゲルろ過カラムにロードします。

流速 1.3 milliliters per minute でランニングバッファーを用いてカラムを洗浄します。自動分画回収装置を用いて、6 milliliter ずつ分画して回収します。タンパク質のモノマーは最後に溶出します。

この時点で、精製したマグネトフェリチンはカチオン化まで4 °Cで保存することが可能です。10 mgのマグネトフェリチンに対し、374 mgのDMPAを量り取り、2.5 mLの200 mM MES緩衝液に溶解させます。濃塩酸を用いて、溶液のpHを約7に調整します。

塩酸を用いてDMPA溶液のpHを調整すると、有毒なガスが発生します。必ずドラフトチャンバー内でこれらの材料を取り扱ってください。4 mg/mLの濃度で調製したマグネトフェリチン溶液を2.5 mL添加します。

マグネチックスターラーを加え、平衡状態にするため2時間撹拌します。溶液をpH 5.0に調整した後、141 mgのEDC粉末をDMPAマグネトフェリチン溶液に加えます。そのままさらに3時間半撹拌を続けます。

沈殿物を除去するため、溶液を0.22 micronのシリンジフィルターでろ過し、テキストプロトコルに従ってタンパク質を透析します。テキストプロトコルに従ってhMSCを培養します。播種した細胞を2 mLの室温PBSで洗浄します。

次に、プレートに播種した細胞に、滅菌済みのカチオン化マグネトフェリチン溶液を1 mL加え、任意の時間インキュベートします。細胞をPBSで洗浄し、0.5 mLのTrypsin-EDTAを加えて37 °Cで5分間インキュベートして細胞を回収します。Trypsin-EDTAを不活化させるために1 mLの培地を加えた後、溶液を15 mL centrifuge tubeに移し、524 ×gで5分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを0.5 mLの磁気分離バッファーで再懸濁します。

次に、マルチスタンドにマグネットを取り付け、マグネットに磁気分離カラムを装着します。カラムに分離前フィルターを設置してください。その後、分離前フィルターに磁気分離バッファーを0.5 milliliters加え、フィルターとカラムの両方を通過させて洗浄します。

次に、15 mL遠心チューブをカラムの下に配置し、0.5 mLの細胞懸濁液を磁気分離カラムのフィルターリザーバーに加えます。リザーバーが空になったら、0.5 mLの磁気分離バッファーを加えます。再びリザーバーが空になったら、さらに0.5 mLの磁気分離バッファーを加えます。

洗浄をもう一度繰り返し、磁気分離バッファーの総量を1.5 millilitersにします。この洗浄ステップにより、磁性を持たないすべての細胞がカラムから溶出されます。カラムを磁石から取り外し、新しい15 milliliter遠心チューブに入れます。

次に、カラムリザーバーからフィルターを取り除きます。リザーバーに磁気分離バッファーを1 milliliter加え、メーカー提供のプランジャーを使用して直ちにカラムを押し出します。これにより、磁気的に捕捉された細胞がカラムから遠心チューブ内へ溶出されます。

本文のプロトコルに従って鉄の定量を行ってください。ネガティブ染色したマグネトフェリチンの透過電子顕微鏡画像により、タンパク質ケージ内部にナノ粒子が形成されていることが示されました。ゼータ電位測定により、カチオン化後、マグネトフェリチンが正の表面電荷を持つことが確認されました。

ヒト間葉系幹細胞をカチオン化マグネトフェリチンに1分間曝露させたところ、細胞集団の92%が磁性化され、1細胞あたり3.6 picogramsの鉄が導入されました。インキュベーション時間を15分に延長すると、細胞集団全体が磁性化されました。このビデオを視聴することで、タンパク質溶液に金属塩前駆体を順次添加し、アポフェリチン腔内に磁性ナノ粒子を合成する方法について理解することができます。

次に、TMPAカップリングを用いてタンパク質を化学的にカチオン化する方法を説明します。習得すれば、適切に行うことでマグネトフェリチンの合成、精製、およびカチオン化を3日間で完了させることができます。この手順を行う際は、酸素混入を避け、マグネトフェリチンの合成を通じて適切な温度とpHを維持することが重要です。

本手順に続き、量子ドットや治療薬などの他の貨物をカチオン化したアポフェリチンケージに封入することで、これらの物質を細胞へより効率的に輸送することが可能です。この手法は、磁気細胞操作の分野の研究者が、ナノ粒子の取り込み効率が低い細胞や、ナノ粒子の長時間曝露または高濃度曝露に非常に敏感な細胞における磁気標識を探索するための道を開く可能性があります。