Name: 紫外可視およびラマン分光法イムノアッセイプラットフォームを製作 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 学ぶ金ナノ粒子ベースのイムノアッセイ製作法。紫外可視およびラマン分光法を用いてアッセイを検証し、ナノ粒子の機能化が光学特性に与える影響を評価する柔軟なプラットフォームを構築する方法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業は、ユタ州立大学からのResearch Catalyst Awardによって支援されました。著者は、Annelise Dykes、Cameron Zabriskie、Donald Wooley の貢献に感謝します。

バッファーの調製<ol><li> リン酸緩衝生理食塩水（PBS） <ol><li> 1×PBS濃度を行うには450点mLのHPLC等級の水で10×PBS 50 mlで希釈しました。滅菌フィルター0.22μmのフィルターを用いて溶液。 </li><li>室温で保存液。 </li></ol></li><li> トリス緩衝生理食塩水+トゥイーン20（TBST）の調製 <ol><li> 1倍濃度を作製するには450点mLのHPLC等級の水で10倍トリス緩衝生理食塩水（TBS）を50mlを希釈。 Tween-20を0.05％（v / v）のためのTween-20の250μLを加えます。滅菌フィルター0.22μmのフィルターを用いて溶液。 </li><li>室温で保管してください。 </li></ol></li><li> ブロッキング溶液ヒト血清アルブミン（HSA）の調製 <ol><li> HSA溶液w / vの3％を作るために滅菌濾過した1×PBSの15ミリリットルにHSAの0.45グラムを計量。 HSAまでボルテックス溶液が完全に溶解されます。 </li><li> 4℃で保存HSA溶液。 注：ウシ血清アルブミン（BSA）は、ブロッキング溶液として使用することができます。 </li></ol></li><li> PEG化抗体の作製（PEG-AB）ソリューション 注：抗体溶液は、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）の結合部位について競合することによって結合反応を妨害するBSA、などの担体または安定化タンパク質から自由でなければなりません。抗体は、トリスまたはグリシン緩衝液中に来る場合は、NHSコンジュゲーション反応と干渉アミンまたはアンモニウム塩を防止するために、緩衝液交換を受けなければなりません。抗体は凍結乾燥形態である場合、それは1〜10ミリグラム/ mlの濃度で製造業者の推奨に従って再懸濁することができます。 <ol><li>トリスまたはグリシン緩衝液中の抗体を、脱塩カラムを使用して100mMの炭酸水素ナトリウムを緩衝液交換を行います。結合反応をスピードアップするために約8.5にpHを上げるために100mMのバッファを使用してください。 </li><li> 100 mMのsの水和物、オルトピリジルジスルフィド-PEG-NHS（OPSS-PEG-NHS）1mg / ml以上の濃度で1mlの容量に憎悪炭酸。 注：OPSS-PEG-NHSは、新たに作製し、約20分以内に使用すべきです。 OPSS-PEG-NHSのNHS基は、pH 8.5の水溶液中で、約20分の半減期を有します。 </li><li> 1の比（PEG：抗体）2で抗体溶液にOPSS-PEG-NHSを加える結合比は、試験サンプルのために使用されます。制御のために使用される1結合比：別個のマイクロ遠心管中で、2の抗原溶液にOPSS-PEG-NHSを加えます。 注2：1の比率は、50％の結合効率を仮定しています。目的は、1 PEG鎖で各抗体を標識することです。この工程では、過剰の標識の下の標識よりも良好です。 OPSS-PEG-NHSおよび抗体溶液の適切な量を決定するために、次の式を使用します。 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_2.jpg" /> Vは体積であり、Cは濃度の分子内で発現されますか1mlあたりtibodies。添字PEGおよびAbがそれぞれ、OPSS-PEG-NHSおよび抗体です。最終容量は約250μlのでなければなりません。 </li><li> 8時間または一晩4℃でPEG-Abのソリューションをインキュベートします。凍結融解サイクルを制限し、低結合管を使用することを確認するために-20℃で約25マイクロリットルのアリコートを作業に保管ソリューション。 </li></ol></li></ol> 2.準備紫外可視/ラマンプローブ<ol><li> 裸AuNP溶液を調製します <ol><li>ミリリットル当たり約1×10 11粒子の濃度でAuNPsの2ミリリットル溶液を調製します。 <ol><li> AuNPsが集中する必要がある場合は、20分間または上清が透明になるまで5,000×gで2000株AuNPμlの遠心分離機で低結合遠心分離管を埋めます。 AuNPペレットを乱さないように注意しながら、ピペットで上清を取り除きます。 </li><li> 1チューブに残ったAuNPソリューションを組み合わせるとconcentraを推定UV-Visの測定値を取得し、これが線形関係であるとして知られている濃度に値を比較することによりる。 </li></ol></li></ol></li><li> 適切なラマンレポーター標識比を決定 <ol><li>メタノールに溶解したラマンレポーターのワーキング溶液を調製します。この濃度は、使用されるレポーターに依存することになります。本研究では、200μMの作業溶液に3,3&#39;- diethylthiatricarbocyanineヨウ化物（DTTC）を準備します。 </li><li>各ウェル100μlの最終容量を仮定すると、ラマンレポーターは、0.2μM〜10μMの濃度の範囲でするような96ウェルプレートの最初の行の各ウェルに作業レポーターソリューションを十分に追加します。ボリュームが80μLであることを各ウェルなどに十分なHPLC等級の水を追加します。各ウェルごとに、100μlの最終容量をよく作ることにAuNPの20μLを加えます。例を表1に提供されます。 </li><li> UV-Visスペクトル400からのを測定しますプレート読み取り紫外可視分光光度計を用いて700nmで。適切な濃度は、UV-Visスペクトルのための明確なピークと最も高い濃度です。 AuNPsにラマンレポーターの最高濃度比まで濃度を増加で手順を繰り返し2.2.2が発見されました。 注：染料及びAuNPの形状、サイズ、および製造者は、適切な濃度に影響を与えます。したがって、記載された手順が使用されているコンポーネントに応じて評価し、変更しなければなりません。このプロトコルは、正に荷電した色素の使用を含みます。このように、AuNPとレポーターとの間の結合は、負に帯電しAuNPsを使用することによって改善されました。これは、クエン酸塩キャッピングさAuNPsを用いて行きました。詳細については、議論のセクションを参照してください。 </li></ol></li><li> AuNPにラマンレポーターおよびPEG-ABを結合 <ol><li>ラマンレポーターは、室温で30分間AuNPsに結合することを可能にする、以前に決定された濃度でAuNPとラマンレポーターの2 1.5ミリリットルのバッチを準備します。</li><li>粒子への抗体の1の比率：200を作成するためのAuNPとラマンレポーターソリューションの1バッチにPEG化された抗体（PEG-AB）を追加します。この溶液は、試験サンプルについてです。対照として使用する粒子への抗体の1：1の比の別々のマイクロ遠心チューブでは、200でAuNPとラマンレポーターソリューションの他のバッチにPEG化抗原を追加します。室温で30分間溶液をインキュベートします。 注：粒子に対する抗体の比率はAuNPsに固有となり、使用する色素や個々のケースのために最適化されるべきです。ここでの目的は、粒子の凝集を防止しつつに結合するAuNPプローブに対する抗体の最も高い割合を有することです。一緒に追加するには、適切な量を決定するために、次の式を使用します。 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_200.jpg" /> Vは体積であり、Cは濃度1mlあたり粒子または抗体で発現されます。フィンアルの容量は約1.5ミリリットルでなければなりません。 </li></ol></li><li> mPEG-SHとAuNP表面上の残りのサイトをブロックします。 <ol><li>水を使用して、200μMの濃度に固体メトキシポリエチレングリコールチオールを溶解させることによってのmPEG-SHを準備します。 mPEG-SHが完全に溶解するまで溶液をボルテックス。 </li><li>ステップ2.3で行われたAuNP-PEG-Abの溶液に1比：40,000でのmPEG-SHを追加します。金ナノ粒子上の残りのサイトがブロックされていることを確認するために10分間、室温で溶液をインキュベートします。一緒に追加するには、適切な量を決定するために、次の式を使用します。 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_40000.jpg" /> Vは体積であり、Cは濃度1mlあたり粒子または抗体で発現されます。最終容量は約1.5ミリリットルでなければなりません。 </li></ol></li><li> 官能基化ラマンプローブを回復します。 <ol><li>低バインドCで20分間、5000×gで遠心分離した粒子entrifugeチューブ又は上清が透明になるまで。 AuNPsを乱さないように注意しながらピペットで上清を取り除きます。 </li><li>以前に行われた1×PBS溶液1mlで粒子を再懸濁。少量の溶液（3μL）のUV-Visの測定を行うことにより、AuNP濃度を推定し、既知のAuNP濃度からの測定値に結果を比較します。最終溶液は、1mlあたり少なくとも1×10 11粒子であるように、音量を調整します。 </li><li> 4℃で保存ソリューションは、それが免疫アッセイプレートの官能化のために使用されるまで。 1週間以内のソリューションを使用してください。 </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="3">各コンポーネントの追加するボリューム（ミリリットル） </td></tr><tr><td> DTTC最終濃度（mM）の</td><td> DTTC作業溶液（200 mM）の</td><td> AuNP </td><td>水</td></tr><tr><td> 0.2 </tD&gt; <td> 0.1 </td><td> 20 </td><td> 79.9 </td></tr><tr><td> 0.6 </td><td> 0.3 </td><td> 20 </td><td> 79.7 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.5 </td><td> 20 </td><td> 79.5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1.0 </td><td> 20 </td><td> 79 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 2.5 </td><td> 20 </td><td> 77.5 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 3.5 </td><td> 20 </td><td> 76.5 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 5.0 </td><td> 20 </td><td> 75 </td></tr></tbody></table> 表1 DTTC希釈例。DTTCの様々な希釈液と株式DTTC、金ナノ粒子溶液、および水の関連するボリューム。 3.免疫アッセイプレートの準備<ol><li> イムノアッセイプレートに所望の抗原に結合します。 <ol><li>ポリスチレン井戸を満たすのに十分な希釈抗原（50μg/ ml）を準備します。 、解決策をVORTEXそして、すぐにプレートウェルにソリューションを追加します。抗原は、室温で1時間、プレートに結合することを可能にします。 </li></ol></li><li> 結合していない抗原を洗い流します。 <ol><li>廃棄容器にソリューションをダンプし、紙タオルで覆われた卓上に対してプレートを押すことで、過剰な抗原溶液を除去します。 </li><li>前述と同様に洗浄した後、表面を洗浄除去するために、ウェルにTBSTを追加します。このステップをさらに2回繰り返します。 </li></ol></li><li> ブロックは、非特異的結合を防ぐために、プレート上の結合部位を残り。 <ol><li>プレートの各ウェルにHSAブロッキング溶液70μLを加え、室温で30分間インキュベートします。 </li><li>削除し、ステップ3.2で指定されたものと同じ手順を用いてプレートをすすぎます。さらに使用するまで4℃でプレートや店舗の乾燥をカバー。 </li></ol></li><li> 免疫アッセイプレートを官能。 <ol><li>トンの70μLを追加彼は、96ウェルプレートの最初の列に2節で作製したナノ粒子をプローブと1使用して、後続のカラムを希釈：2連続希釈を。プレートは、少なくとも1時間インキュベートすることができます。免疫アッセイプレートを準備する方法の例を図3に示されています。 </li><li>適切AuNPsを処分することを確認して、ステップ3.2で説明するようにTBSTで5回プレートを洗浄します。最終洗浄の後、各ウェルに1×PBSの70μlを添加し、プレートシールでカバーしています。 注：コントロールサンプルは、明確にする必要があります。非特異的結合が発生した場合、対照試料は試験試料と同様の色を有することになります。 </li></ol></li><li> 紫外可視およびラマン分光法による試験アッセイ感度。 <ol><li>各ウェルについて、UV-Visスペクトルプレート読み取り紫外可視分光光度計を用いて400〜700nmの範囲で測定。 </li><li>倒立ラマン顕微鏡を用いて、AuNPプローブを有するウェルの表面上に目的の焦点を合わせます。オビ井戸のラマンスペクトルをTainの。 1800センチメートルから-1 400センチメートルまでの範囲のスペクトルを収集-1。すべてのウェルに、この手順を繰り返します。 </li><li>適切なスペクトルソフトウェアを使用して、UV-Visスペクトルのためのラマンスペクトルのための第 11次多項式ベースライン補正、3次多項式を行います。 </li><li>適切なスペクトルのソフトウェアを使用して、ラマン及びUV-Visスペクトルを正規化します。 1に最大値を設定し、それに応じて他のすべての値をスケール。ラマンスペクトルを標準化するために、ユニークなポリスチレンピークを選択し、等しく1に設定し、それに応じて他のすべての値をスケール。 </li><li>適切なスペクトルソフトウェアを使用して、各スペクトルのピーク積分を実行。ラマンスペクトルについて、ラマンレポーターを示すピークは、ポリスチレンピークの領域不在でなければなりません。ピーク積分を実行するには、所望のピークの積分の境界を指定し、コントロールを含むすべてのサンプルについて所望のピーク面積を記録します。 </li><li> PLそれに関連する標準偏差を示す各点についてエラーバー付きAuNP濃度の対数の関数としての関心の平均ピーク面積をotの。 4パラメータロジスティック曲線にこれらのキャリブレーションポイントを取り付けます。 </li><li>ブランク試料のための目的のピークの面積を平均化することにより、ブランクの平均値を決定します。これらの領域の標準偏差を決定します。これは、ブランクの標準偏差です。 </li><li>前のステップで分析同じピークについては、最低濃度のためにそのピーク面積の標準偏差を見つけます。 </li><li>代表的な結果セクションに指定された検出のブランクと下限の限界を計算します。 AuNP濃度の点でLLODを決定するために、4PLの検量線で、これらの値を使用してください。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIsraelsen%2C+ND+%22Sci.+World+J%22">Sci. World J</a>. , e124582(2015).</li>
<li>Wang, Y., Schlücker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+and+synthesis+of+SERS+labels%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Rational design and synthesis of SERS labels.</a> Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Yan, B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERS+tags%3A+novel+optical+nanoprobes+for+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis.</a> Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Immunoassay+Handbook%3A+Theory+and+applications+of+ligand+binding%2C+ELISA+and+related+techniques%22">The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques</a>. , Elsevier Science: Oxford. Waltham, MA. (2013).</li>
<li>Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCox%2C+KL+%22Assay+Guid.+Man%22">Assay Guid. Man</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="
	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/
	">
	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/
	</a> (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ELISA+development+guide%22">ELISA development guide</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf">https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf</a> (2016).</li>
<li>Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+Raman-labeled+nanoparticles+for+a+dual-modality%2C+light+scattering+immunoassay+on+a+polystyrene+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate.</a> J. Biol. Eng. 10, (2016).</li>
<li>Menges, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMenges%2C+F+%22Spekwin32+-+optical+spectroscopy+software.+Version+1.72.1%22">Spekwin32 - optical spectroscopy software. Version 1.72.1</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="http://www.effemm2.de/spekwin/">http://www.effemm2.de/spekwin/</a> (2016).</li>
<li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li>
<li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+Antibody+Binding+on+Protein+Microarrays+using+Microarray+Nonlinear+Calibration%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration.</a> BioTechniques. 54, 257-264 (2013).</li>
<li>Armbruster, D. A., Pry, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank%2C+limit+of+detection+and+limit+of+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Biochem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation.</a> Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EP17-A2%3A+Evaluation+of+Detection+Capability+for+Clinical+Laboratory+Measurement+Procedures%3B+Approved+Guideline%22">EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline</a>. 32. No 8, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, 19087, USA. 
 <a target="_blank" href="http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html">http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html</a> (2012).</li>
<li>Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+assessing+the+reliability+of+molecular+diagnostics+based+on+multiplexed+SERS-coded+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles.</a> Plos One. 8 (4), e62084(2013).</li>
<li>Sinha, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+binding+potential+of+cell-surface+receptors+in+fresh+excised+specimens+via+dual-probe+modeling+of+SERS+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles.</a> Sci. Rep. 5, 8582(2015).</li>
<li>Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+cells+using+targeted+surface-enhanced+Raman+scattering+nanoparticles+and+magnetic+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment.</a> J. Biomed. Opt. 19, 056014(2014).</li>
<li>Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silica-coated+dimers+of+silver+nanospheres+as+surface-enhanced+Raman+scattering+tags+for+imaging+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells.</a> Interface Focus. 3 (3), 20120092(2013).</li>
<li>McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+surface-enhanced+Raman+tags%3A+individual+nanorods+for+measurements+from+the+visible+to+the+infrared+%28514-1064+nm%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Nano%22%5BJournal%5D)">Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm).</a> Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

詳細なプロトコルでは、対処するためのいくつかの重要なポイントがあります。 1つの問題は、ラマンレポーターと金ナノ粒子の選択です。プロトコルは、個々の使用に適合するように書かれたが、ラマンレポーターDTTCを例として使用しました。 DTTCは、正に帯電したレポーターであり、負のクエン酸キャップ化AuNPsなどの表面に帯電するために特異的に結合します。このプロトコルは、正の表面電荷を有する金ナノ粒子を使用して、負に帯電したレポーターに適合させることができます。例えば、ポリエチレンイミン（PEI）キャップされたAuNPsは正の表面電荷を提供し、より良好な負に帯電したレポーターと結合します。 タンパク質とナノ粒子の間のバランスを維持することは、このプロトコルの重要なステップです。このバランスは200の金ナノ粒子の比に最適化された抗体にPEG化抗体を添加することによって達成される：1。 PEG化された抗体は、Th1よりも有意に高い比率で金ナノ粒子溶液に添加された場合S、イオン誘発性粒子の凝集が発生する可能性があります。また、比、タンパク質凝集および不溶性の小さすぎる時に起こるであろう。この比...

典型的なサンドイッチイムノアッセイは、間接的に二つの抗体を用いて抗原の存在を検出します。捕捉抗体は、固体表面に結合したときに適切な抗原に近接して抗体 - 抗原複合体を形成します。検出抗体は、次いで、導入された抗原に結合します。洗浄後、抗体/抗原/抗体複合体が残存し、 図1Aに示されたように標識した検出抗体によって検出されます。典型的な検出は、広いスペクトルのピーク2,3に起因する10の検体に多重化を制限し、蛍光または比色検出器によって行われます。これとは対照的に、ラマンベースのシステムには、最大100の検体2,3の同時検出を主張ソースで強化された多重化機能が得られはるかに狭い発光ピークを持っています。 このようなステップ・バイ・ステップとして6 -多くの文献情報源は、イムノアッセイ4に関連する重要な側面をカバーしているご利用いただけます詳細は、パーソナライズされたELISAキットを作成します。残念ながら、これらのプロトコルは、カスタマイズされた免疫アッセイの多重化能力を制限し、蛍光または比色検出のためのものです。この必要性に対処するために、我々は、 図1Bに示すように、直接イムノアッセイについて以前に公開され7 UV-可視/ラマンイムノアッセイを作製する詳細な手順を提示します。 このプロトコルは、図2に示した官能基化金ナノ粒子ベースのプローブの製造を含んでいる。ラマン/ UV-Visのプローブを作成する手順は、金ナノ粒子（AuNPs）の表面にラマンレポーターを結合することによって開始します。 AuNPsは、その後、ポリエチレングリコール（PEG）と関連している抗体を用いて官能化されます。 AuNPsの残りの結合部位は、分析の間の結合、その後の非特異を防止するAuNPsにメトキシポリエチレングリコールチオール（MPEG-SH）を結合することによってブロックされます。準備AuNPプローブは、抗原に結合することによってテストされます図1Bに示すように、ポリスチレンプレートのウェルに固定されています。関連ラマンレポーターは、ラマン分光法を用いて検出している間にプレートを洗浄すると、AuNPプローブは、紫外可視分光法を用いて検出されます。 UV-Visのラマンスペクトルデータを組み合わせることにより、この免疫アッセイの能力を強化、分析の2つのメソッドを提供します。

<table><tbody><tr><td>60 nm 金ナノ粒子</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15708-6</td><td>これらはクエン酸塩をキャップした金ナノ粒子です。ラマンレポーターとAuNP表面電荷の関係と、AuNPおよび/またはラマンレポーターの適切な選択への影響については、ディスカッションを参照してください。</td></tr><tr><td>ナトリウムの重炭酸</td><td>塩のフィッシャー科学</td><td>的なS233-500</td><td></td></tr><tr><td>のメタノール</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr><td>トリス緩衝生理食塩水(10x) pH 7.5</td><td>Scy Tek</td><td>TBD999の</td><td></td></tr><tr><td>びんの上ろ過単位</td><td>VWR</td><td>97066-202</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (ポリソルベート20)</td><td>Scy Tek</td><td>TWN500</td><td>洗浄ステップのための乳化剤として使用される。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水10倍濃縮液、pH 7.4</td><td>Scy Tek</td><td>PBD999</td><td></td></tr>タンパク質<tr><td>LoBindチューブ2.0&nbsp;ml</td><td>Eppendorf</td>チューブ<td>22431102</td><td>LoBindチューブは、タンパク質とAuNPがチューブの表面に結合するのを防ぎます。</td></tr><tr><td>タンパク質LoBindチューブ0.5&nbsp;ml</td><td>Eppendorf</td>チューブ<td>22431064</td><td>LoBindチューブは、タンパク質とAuNPがチューブの表面に結合するのを防ぎます。</td></tr><tr><td>マイクロプレートデバイス UniSeal</td><td>GE Healthcare</td><td>7704-0001</td><td>機能性プレートのシールと保管に使用されます。</td></tr><tr><td>アッセイプレート、低蒸発蓋付き、96ウェル平底</td><td>Costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>HPLCグレードの水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-4L</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-ジエチルチアトリカルボシアニンヨウ化物(DTTC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>381306-250MG</td><td>ラマンレポーター</td></tr><tr><td>mPEG-チオール、MW 5,000 - 1グラム</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td>MPEG-SH-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>OPSS-PEG-SVA, 5,000 - 1&nbsp;グラム</td><td>・レイサン・バイオ(株)</td><td>OPSS-PEG-SVA-5000-1G</td><td>OPSS-PEG-SVA には NHS エンドがあります。</td></tr><tr><td>マウスIgG、全分子制御</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31903</td><td>抗原</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG(H + L)交差吸着二次抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31164</td><td></td></tr>抗体<tr><td>ヒト血清アルブミンブロッキング溶液</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A1887-1G</td><td>ウシ血清アルブミンを代わりに使用することができます。</td></tr><tr><td>小型遠心分離機</td><td>Fisher Schientific</td><td>12-006-900</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis 分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis 分光光度計</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>脱塩カラム</td><td>Thermor Scientific</td><td>87766</td><td></td></tr><tr><td>社内造 785&nbsp;nm倒立ラマン顕微鏡ユニット</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>倒立ラマン顕微鏡は、ウェルプレートの表面に適切に焦点を合わせるのに最適です。それ以外の場合は、96ウェルプレートの高さのために非常に低い倍率が使用されます。ベンダーから購入するよりも安価であるため、自社で構築したシステムを使用しました。ただし、市販の倒立ラマン顕微鏡システムであれば、いずれでも使用することができます。</td></tr></tbody></table>

紫外可視およびラマン分光法イムノアッセイプラットフォームを製作

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

免疫アッセイは、関連する抗体の存在に基づいて、タンパク質を検出するために使用されます。そのため、研究と臨床現場での広範な使用の、免疫測定機器および材料の大規模なインフラを見つけることができます。例えば、96および384ウェルポリスチレンプレートは、市販されており、種々の製造業者からの紫外 - 可視（UV-Vis）で分光機を収容するために、標準的な設計を有します。また、このような酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）などのカスタマイズされた免疫アッセイの設計のための免疫グロブリン、検出タグ、およびブロッキング剤の多種多様なご利用いただけます。 既存のインフラストラクチャにもかかわらず、標準的なELISAキットは、高価で時間がかかる可能性が個別のイムノアッセイの開発を必要とする、すべての研究の必要性を満たしていません。彼らは通常、蛍光またはCOLに依存するように例えば、ELISAキットは、低多重化（一度に複数の分析物の検出）機能を持っています検出のためのorimetric方法。比色や蛍光ベースの分析は、広いスペクトルのピークに起因する多重化機能が制限されています。対照的に、ラマン分光法に基づく方法は、狭い放射ピークのために多重化するためのはるかに高い能力を有します。ラマン分光法の別の利点は、ラマンレポーターは、蛍光タグ1よりも大幅に少ない光退色が発生することです。ラマンレポーターは、蛍光比色タグの上に持っていることを利点にもかかわらず、ラマンベースのイムノアッセイを製造するためのプロトコルは限られています。この論文の目的は、UV-Visの分析及びラマン分光法による分析物の直接検出のためのポリスチレンプレートと組み合わせて使用​​するために官能化プローブを調製するためのプロトコルを提供することです。このプロトコルは、事前に確立されたインフラストラクチャを活用しながら、研究者は、将来の多検体の検出のための日曜大工のアプローチを取ることができます。

この研究では、60nmの金粒子は、紫外可視分光法のために使用しました。 UV-Visのオープンソースのスペクトル分析ソフトウェア8を用いて決定した各AuNP濃度400 700に収集されたnmおよびピーク面積から吸収スペクトル。統合をピークに先立ち、収集されたスペクトルは、3点多項式フィットを使用して、ベースライン補正を行いました。ピーク面積は、 図4に示されているように、対数較正曲線を生成するために使用された。 図4及び図 5は、対数較正曲線を組み入れていることに留意すべきです。非線形検量線の使用が大幅にアッセイのダイナミックレンジを拡大することができ、低域検出機能9,10を必要とする様々なイムノアッセイのために受け入れられるの練習となっています。 定量的アッセイの感度、ブランク（LOB）の限界を評価するために、と次のよう...

ナノ粒子ベースの光学プローブは、ラマン分光法とUV-Vis分光法を使用して抗原を検出するための手段として設計されています。ここでは、UV-Vis/ラマン分光法イムノアッセイ用のプローブを調製するためのプロトコルについて、将来のマルチプレックス機能を組み込むための方法について説明します。

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

本プロトコルの全般的な目的は、UV-Vis（紫外可視）分光法およびラマン分光法を用いて解析可能な、カスタマイズ可能な金ナノ粒子ベースの免疫測定法の開発を実証することです。2つの光学的手法を用いることで、アッセイの内部検証が可能となり、アッセイの柔軟性が向上します。本手法は、金ナノ粒子ベースの免疫測定法の開発に関する重要な疑問に答えるものです。また、このアッセイでナノ粒子の機能化がどのように利用され、それが光吸収と光散乱にどのような影響を与えるかについて説明します。本プロトコルは、一般的な研究室にある材料を用いて、個々の研究ニーズに合わせてカスタマイズ可能なイムノアッセイプラットフォームを作製できるという点でユニークです。このイムノアッセイは、UV-Vis分光法およびラマン分光法に基づいています。ラマン分光法は、帯域幅が狭いため複数のバイオマーカーを同時に検出することができ、蛍光法や比色法よりも優れています。まず、二機能性架橋剤である pyridyl disulfide PEG-NHS を 100 mL の炭酸水素ナトリウムで水和させます。ortho pyridyl 末端は金ナノ粒子表面に結合し、NHS 末端は活性化後、タンパク質表面の一次アミンと反応します。架橋溶液は、使用する約20分前に調製してください。次に、2:1の結合比で、二官能性架橋剤を抗体溶液に添加します。抗体溶液に、反応を阻害する可能性のあるキャリアタンパク質が含まれていないことを確認してください。別のマイクロ遠心チューブに、コントロールで使用するのと同じ比率で、抗原溶液に二官能性架橋剤を加えます。2:1の比率は、接合効率を50%と想定したものです。目的は、各抗体に単一のPEG鎖を標識することです。このステップでは、ラベル化が不十分であるよりも、過剰にラベル化されている方が望ましいです。最後に、ペグ化抗体溶液を4°Cで8時間インキュベートします。凍結融解サイクルを制限するため、溶液を25 µLずつ低吸着チューブに分注し、-20°Cで保存してください。各分注液を必要に応じて使用します。ラマンプローブを調製するには、まず、付属のテキストプロトコルに従って決定した濃度のラマンレポーターを用いた金ナノ粒子を、1.5 mLずつ2バッチ作成します。これは、ラマンレポーターと金ナノ粒子溶液を混合し、室温で30分間結合させることで行います。次に、ペギル化抗体溶液をレポーター結合金ナノ粒子溶液のいずれかに加え、抗体と粒子の比率が200:1になるように調製します。この溶液をテストサンプル用に使用します。別のマイクロ遠心チューブにおいて、もう一方のレポーター結合金ナノ粒子溶液にペギル化抗原を加え、抗原と粒子の比率が200:1になるように調製し、これをコントロールとして使用します。両方の溶液を室温で30分間インキュベートします。次に、ナノ粒子表面の残りの部位をブロッキングします。これを行うには、まず固体のメトキシポリエチレングリコールチオールをHPLC用水を用いて200 µMの濃度に溶解させます。チオールが完全に溶解するまで溶液をボルテックスします。次に、ナノ粒子結合PEG抗体溶液にチオール溶液を40,000：1の割合で添加し、金ナノ粒子の残りの部位が確実にブロックされるよう、室温で10分間インキュベートします。続いて、上澄みが透明になるまで低吸着遠心チューブを用いて粒子を遠心分離し、機能化されたラマンプローブを回収します。ピペッティングにより上清を除去しますが、その際、ナノ粒子を乱さないように注意してください。その後、1 mLのPBSでナノ粒子を再懸濁します。溶液から約3 µLを分取してUV-Vis測定を行い、金ナノ粒子濃度を推定します。この関係は線形であるため、既知の金ナノ粒子濃度の測定結果と比較してください。ナノ粒子が十分にブロッキングされていない場合、粒子間の付着力によって凝集が起こり、試薬が不適切な濃度で添加されたことを示唆します。通常、溶液は濃い赤色を呈しますが、凝集が起こると灰色になります。最終的な溶液の粒子濃度が少なくとも1×10¹¹ particles/mLになるように容量を調整し、アミノ化アッセイプレートの機能化に使用するまで溶液を4 °Cで保存してください。これらの溶液は1週間以内に使用してください。まず、ポリスチレンウェルを満たすのに十分な量の希釈抗原を調製します。次に、溶液をボルテックスし、直ちにプレートのウェルに加えてください。室温で1時間、抗原をプレートに結合させます。その後、溶液を捨て、ペーパータオルを敷いたテーブルの上にプレートを叩きつけて、余分な抗原溶液を除去します。ウェルにTBSTを加えて表面を洗浄し、再び溶液を捨ててプレートをペーパータオルを敷いたテーブルの上に叩きつけることで、洗浄液を除去します。次に、プレートの残りの結合部位をブロックして非特異的結合を防ぐため、プレートの各ウェルに70 µLのHSAブロッキング溶液を加え、室温で30分間インキュベートします。その後、ブロッキング溶液を除去し、前述の手順に従ってTBSTでプレートを3回洗浄します。最後の洗浄液を除去した後、プレートに蓋をして、次に使用するまで4 °Cで乾燥状態で保存します。あらかじめ調製したプローブナノ粒子 140 µL を、96ウェルプレートの1列目に加えます。最初の5行にテスト用ナノ粒子を、続く最後の3行にコントロール用ナノ粒子を配置します。その他のすべての列には、PBS 70 µL を加えます。1対2の連続希釈を用いて、各カラムを希釈します。まず、1番目のカラムから70 µLを分取し、2番目のカラムに加えて混合します。次に、2番目のカラムから70 µLを分取し、3番目のカラムに加えます。これを順次繰り返します。プレートを少なくとも1時間インキュベートします。その後、未結合のナノ粒子プローブを除去し、既述の手法に従ってTBSTでプレートを5回洗浄します。最終洗浄後、各ウェルに70 µLのPBSを加え、プレートシールでプレートを密閉します。コントロールサンプルが透明であることを確認します。非特異的結合が起こっている場合、コントロールサンプルはテストサンプルと同様の色になります。各ウェルについて、プレートリーダー搭載の紫外可視分光光度計を用い、400から700ナノメートルの範囲で紫外可視スペクトルを測定します。倒立ラマン顕微鏡を用い、金ナノ粒子プローブが入ったウェルの表面に対物レンズの焦点を合わせます。そのウェルのラマンスペクトルを取得します。1800 cm⁻¹から400 cm⁻¹の範囲でスペクトルを収集し、これを各ウェルについて繰り返します。最後に、付属のテキストプロトコルの最終セクションの手順に従い、セットアップの感度を決定します。60 nmの金粒子を本ビデオの説明通りに調製しました。その後、これらの粒子を紫外可視分光法およびラマン分光法を用いて分析しました。各金ナノ粒子の濃度におけるピーク面積をオープンソースのスペクトル解析ソフトウェアを用いて算出し、ここに示すような対数較正曲線を作成しました。このデータに基づき、検出下限はUV-Vis検出で3.5 picomolar、ラマン分光法を用いた場合は1.7 picomolarであることが分かりました。このビデオを視聴することで、UV-Visおよびラマン分光法を用いたナノ粒子プローブベースの免疫測定法をどのようにカスタマイズするかについて、十分に理解できるはずです。

fabricating-a-uv-vis-and-raman-spectroscopy-immunoassay-platform

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

定量的な、高スループット、リアルタイム、及びSiO上にラベルフリー生体分子の検出（DNA、タンパク質など）...

干渉反射イメージングセンサー（IRIS）を用いた生体分子の検出

このビデオでは、特定の標的抗原を検出するためのラマン分光法に基づく直接免疫測定法について説明します。ラマンプローブに付着した金ナノ粒子の表面に吸着した抗体は、標的抗原と相互作用して特異的なラマンスペクトルを生成し、その後検出されます。...

ラマン分光法を用いた直接免疫測定法による特異的抗原検出法

私たちは、固定化されたタンパク質やアプタマーとナノ構造基板と対峙するナノ生物学的システムの作製と特性評価について説明します。ナノ構造基板のリソグラフィー作製、バイオ機能化、表面増強ラマン分光法(SERS)の特性評価を含む関連する実験ステップが報告されています。表面固定化タンパク質のSERS検出、およびタンパク質-リガンドおよびアプタマー-リガンド結合のプローブが実証されています。...

表面EBL作製したナノ構造基板を用いた生体分子のラマン分光検出の強化

製造や化学汚染物質（ すなわち、農薬フェルバムと抗生物質アンピシリン）の検出のためのラマン分光（SERS）アッセイ強化フィルタベースの表面を実行するための手順が提示されています。...

化学汚染物質の迅速検出のためのラマン分光アッセイ強化フィルターベースの表面

我々詳細イムノアッセイの開発で使用するための三次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスを製造する方法。装置アセンブリへの我々のアプローチは、多層の種類、添加剤の製造です。我々は、紙ベースのデバイスのこれらの種類の代表的な結果を提供するためのサンドイッチイムノアッセイを示します。...

イムノアッセイのための3次元紙ベースのマイクロ流体デバイスの作製

このプロトコルでは、操作が簡単です、1...

キャピラリー配列で複数の核酸の視覚的検出

現在では、複雑なサンプル準備と高価な計測器が必要し、低リソース環境では使用しにくいジカ、チクングニア ウイルスおよびデング...

多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

このプロトコルは、単一セル分解能を達成することができる統合ラマン分光質量分析(MS)プラットフォームを提示します。ラマン分光法は、薬物に対する細胞応答を研究するために使用することができ、MSは薬物の取り込みと代謝の標的および定量的分析に使用することができます。...

単細胞薬の取り込み、代謝、および効果を研究するための統合ラマン分光法と質量分析プラットフォーム

エレクトロウェッティングベースのデジタルマイクロ流体は、マイクロリットル体積液滴の見かけの接触角の電圧駆動変化を利用して、その操作を容易にする技術です。これを機能化された磁気ビーズと組み合わせることで、酵素結合免疫測定アッセイ(ELISA)を用いた複数の実験ユニット操作を組み合わせて、サンプル調製と病原体の同定を可能にします。...

酵素結合免疫吸着アッセイ用エレクトロウェッティングベースのデジタルマイクロ流体プラットフォーム

この論文は、細胞外小胞サブセットの特性評価のためのスループットを向上させた新世代のマルチパラメトリック分析プラットフォームを提案します。この方法は、多重化されたバイオセンシング法と、原子間力顕微鏡による計量学的および形態力学的分析とラマン分光法の組み合わせに基づいており、マイクロアレイバイオチップにトラップされた小胞ターゲットを認定します。...

細胞外小胞サブセット解析のための多重化表面プラズモン共鳴イメージングチップ上のマルチモーダル解析プラットフォーム

ここでは、ラベルフリー表面強化ラマン分光法(SERS)を用いて個々の小さな細胞外小胞(sEV)を解析するプロトコルを提示し、低侵襲疾患の診断と治療的投与手段としてのsEVの評価を可能にします。...

個々のsEVの表面強化ラマン散乱に基づくバイオセンシングの疾患診断および治療への応用を探る

学ぶ金ナノ粒子ベースのイムノアッセイ製作法。紫外可視およびラマン分光法を用いてアッセイを検証し、ナノ粒子の機能化が光学特性に与える影響を評価する柔軟なプラットフォームを構築する方法です。

紫外可視およびラマン分光法イムノアッセイプラットフォームを製作

さらに動画を探す