HIV-1感染細胞からのエキソソームのSILACベースのプロテオミクス特性評価

この手順の全体的な目標は、HIV-1感染細胞からのエキソソームプロテオームを特徴付けることです。この方法は、エキソソームプロテオームの組成に対する外部ストレスの影響など、エクソソーム生物学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、プロテオミクスやエクソソーム生物学の限られたバックグラウンドでも学習できることです。

この方法はHIV感染に関する洞察を得ることができますが、細菌感染症などの他の疾患研究にも適用できます。この実験ではH9細胞株を使用しますが、活発に増殖する段階にあり、選択した試験条件の影響を受けやすい細胞株であれば、さまざまな細胞株を使用できます。2つの細胞培養フラスコにそれぞれ9個の細胞を第6段階まで10回2回播種する。

10%定型化されたFBS、1リットルあたり100ミリグラムのC13標識L-リジン、および1リットルあたり100ミリグラムのC13およびN15標識L-アルギニンを含む標識培地10ミリリットルで1つの集団を成長させます。10 ミリリットルのラベルなし培地で、10% 様式化された FBS、L-リジン、および L-アルギニンで他の人口を増やします。細胞を6倍増殖させると、標識培地中の細胞のタンパク質が99%以上重アミノ酸で標識されます。

新しいメディアを追加するか、セルのタイプに応じて一定の時間間隔でメディアを交換します。標識の最後に、より多くの細胞の成長に対応するために、培養量を30ミリリットルに増やします。標準的なHIV-1感染プロトコルを使用して、標識された細胞にHIV-1のNL4-3株を感染させます。

細胞に適切な量のウイルスを添加し、非標識細胞がHIV-1感染することなく非標識培地で増殖し続ける間、48時間インキュベートします。HIV-1感染の終わりに、両方の細胞集団から上清が採取され、エキソソームが単離されます。細胞を避けて、培養物の上清を50ミリリットルの円錐管に集めます。

300倍g、摂氏4度で10分間遠心分離し、残りの細胞を除去します。新しい50ミリリットルの円錐形の管に上清を集め、死んだ細胞を取除くために2, 000倍gで10分間遠心分離機にかけます。得られた上清を、超遠心分離に耐えることができる市販のローター適合チューブに移します。

超遠心チューブのバランスを取ってください。細胞の破片を取除くために10, 000倍のgで30分間管を遠心分離する。上清を新しい超遠心チューブに集めます。

100, 000倍gで70分間遠心分離し、上清を捨てます。各エキソソームに富むペレットを5ミリリットルの新鮮なPBSに再懸濁し、溶液を新鮮な超遠心チューブに移します。

再度、100, 000回gで70分間遠心分離します。最後のスピンの後、上澄みを捨てます。これで、細胞ペレットはタンパク質抽出の準備が整いました。

この手順を開始するには、単離された各エキソソームペレットを100〜200マイクロリットルのfer-pa-lai-sesおよび抽出緩衝液に溶解し、全範囲のプロテアーゼを阻害できるプロテアーゼ阻害剤を添加します。溶解した溶液を13, 000倍g、摂氏4度で10分間遠心分離します。透明化した上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。

標準アッセイで各サンプルのタンパク質濃度を定量した後、標識サンプルと非標識サンプルから同量のタンパク質を混合します。均等な混合物を4〜20%SDS-PAGEゲルで30分間分析します。ゲルをクーマシーブルーで染色し、続いて脱染します。

カミソリの刃を使用して、ゲルからサンプルレーンを切り取り、次にゲルレーンを10〜15等分に切ります。各ピースを新鮮な1.5ミリリットルの微量遠心チューブに合計10〜15本のチューブに入れ、テキストプロトコルに記載されているタンパク質抽出手順を続行します。プロテオミクスデータ解析の手順は示されませんが、このフローチャートにまとめられています。

抽出されたタンパク質は、最初に液体クロマトグラフィー、タンデム質量分析法によって分析され、データの品質が評価されます。次に、定量化されたペプチドが2つ未満のタンパク質を除去することにより、データを前処理します。その後、大幅にアップレギュレーションされたタンパク質とダウンレギュレーションされたタンパク質が同定されます。

最後に、有意な候補の反復が比較されて一貫性が達成され、すべての反復のデータがマージされます。同定されたタンパク質の特性評価を開始するには、GenBankアクセッション番号またはUniProt IDを使用して、現在のエクソソームデータベースを検索してください。このデモではExoCartaを使用します。

「クエリ」をクリックし、遺伝子またはタンパク質の名前またはアクセッション番号を入力します。エキソソーム中の証拠は、候補タンパク質が以前にエキソソーム中に発見されたことを検証し、候補が実際にエキソソーム中にあるという信頼性の層を追加します。次に、HIV-1とヒトタンパク質相互作用データベースと照らし合わせて候補を検索します。

タンパク質ドメイン名のエントリで、候補の名前またはアクセッション番号を入力し、[検索]をクリックします。検索結果は、HIV-1とタンパク質候補との間の相互作用についての洞察を提供し、どの候補が本当にHIV-1に関連している可能性があるかを示唆することができます。3つ目のステップは、遺伝子オントロジーやfun-brichなどのGO解析ソフトウェアを使用して、候補に関するグローバルな洞察を得ることです。

「エンリッチメント分析」で、「データセットを追加」をクリックし、候補の GenBank アクセッション番号または UniProt ID をアップロードし、GO 分析を視覚化するグラフタイプを選択します。GO解析結果は、生物学的プロセス、細胞成分、分子機能領域の候補タンパク質に関する情報を提供する円グラフの形で視覚化されます。次のステップは、DAVID分析を通じて統計的に過大評価されているGO用語を特定することです。

機能アノテーションツールをクリックし、候補リストを入力し、UniProt IDなどの遺伝子の識別子を選択します。検索が完了したら、gene ontologyカテゴリーの下にあるアノテーションサマリー結果ページをクリックして、エンリッチされたGO用語、p値、およびその他のパラメータを表示します。最後に、オープンにアクセス可能なSTRINGデータベースを使用して、潜在的なタンパク質間相互作用と可能な生化学的経路を調査します。

指定された検索ボックスにタンパク質IDまたは配列を入力し、解析に適した分子種を選択します。[検索] をクリックします。結果は、直接的および間接的な関連性に関する情報を提供します。

結果に表示されたエキソソーム候補の既知の一致上位 10 件は、重要な候補選択のために考慮する必要があります。14種類のタンパク質のセットのDAVID分析の代表的な結果が示されています。生物学的プロセスの濃縮は、細胞死に関連するプロセスが有意に濃縮されていることを示しました。

細胞成分の濃縮は、細胞内起源の多くのタンパク質を示し、分子機能の濃縮は、ほとんどの候補のタンパク質結合における役割を特定しました。L-乳酸デヒドロゲナーゼB鎖またはLDHBが最有力候補として選択され、STRING解析によりLDHBの上位10の相互作用パートナーが特定されました。LDHBパートナーの大多数は、機能的および位置的にもHIV-1のエクソソームに関連していました。

このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば1週間で習得できます。この手順を試行するときは、適切な温度と条件で各ステップを実行することを忘れないでください。この手順に続いて、バイオインフォマティクス分析の予測を確認するために、アフィニティー分離などの他の方法を実行することができます。

その開発後、この技術は、生物学におけるHIV-1感染に関連するエキソソームプロテオームの変化を探求するためのエキソソーム分野の研究への道を開きました。このビデオを見れば、細胞培養からエクソソームを単離する方法、そのプロテオームを分析する方法、HIVとの関連を調査する方法について十分に理解できるはずです。HIVやその他の感染性病原体を扱う作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に個人用保護具の着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。