成体マウスの脊髄組織からの初代混合グリア培養の調製

このプロトコルの全体的な目標は、in vitro研究のために成体マウス脊髄から一次混合グリア培養を確立することです。この手法は、神経障害性疼痛や多発性硬化症など、脊髄内の病理学的変化を伴う神経疾患におけるグリア細胞の役割を調べるためのin vitroシステムを提供します。この技術の主な利点は、グリア培養物が成体マウスの脊髄から調製され、in vivo条件をより正確に反映するシステムを提供することです。

この手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるJennifer Malonです。組織培養フードで作業し、4つのマウス脊髄をHBSSのペトリ皿に移します。滅菌ハサミと鉗子を使用して、各脊髄を細かく切ります。

次に、パパインDNAse酵素混合物を含む50ミリメートルの円錐形チューブにピースを移します。HBSSを酵素混合物に移すと、酵素の性能が低下する可能性があるため、避けてください。単一細胞懸濁液を得るためには、組織片が十分に消化されることが重要です。

しかし、過剰に消化すると、生存細胞が少なくなります。各ラボは、自社の細胞に最適なものに基づいて正確な消化時間を決定するためのパイロットテストを実施する必要があります。次に、チューブを穏やかにボルテックスし、摂氏37度で1時間インキュベートし、1分間に150回転で軌道を振とうします。

インキュベーション後、チューブをボルテックスし、5ミリリットルのピペットを使用して組織を激しく粉砕し、さらなる解離を促進します。次に、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移し、室温で300 x gで5分間遠心分離します。遠心分離中に、再構成されたアルブミンオボムコイド阻害剤溶液300マイクロリットルで、滅菌チューブ内のABSS2.7ミリリットルによく混合します。

次に、150マイクロリットルのDNAse溶液を追加します。centifugationに続いて、上清を取り除き、新たに調製したアルブミンオボムコイド阻害剤とDNAse溶液に細胞ペレットを再懸濁します。細胞ペレットを破砕するためによくボルテック

次に、DNAseを含まない3ミリリットルの再溶解アルブミンオボムコイド阻害剤溶液を細胞懸濁液に加えます。細胞を70 x gで室温で6分間遠心分離します。スピン後、膜片を含む上清を取り除き、ペレットを保持します。

解離した脊髄細胞からミエリンを除去するには、まず、細胞ペレットを含むチューブに室温20%勾配密度培地を8ミリリットル加え、穏やかにボルテックスします。次に、細胞を800 x gで室温で30分間遠心分離し、壊れないようにします。遠心分離後、主にミエリンと上清を含む破片の最上層を慎重に吸引し、ペレットを離れます。

残っている密度勾配を除去するには、HBSSで希釈した8ミリリットルのcDMEMでペレットを再懸濁して細胞を洗浄します。細胞を400gで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を取り除き、前回と同様に希釈したcDMEMで細胞を洗浄します。

上清を取り除いた後、ペレットは細胞に播種するまで氷上に保存できます。プレーティングの準備ができたら、細胞を14ミリリットルのcDMEMに再懸濁し、2-メルカプトエタノールを添加します。そして、1ミリリットルの細胞懸濁液を12ウェルプレートの各ウェルに加えます。

プレート追加のウェルは、ウェルあたりの平均細胞数と培養物のミクログリア含有量を決定するために使用できます。細胞を播種したら、細胞を摂氏35.9度で5%の二酸化炭素とインキュベートします。めっきの翌日である1日目に培地を交換してください。

一部の細胞は培養プレートに付着していますが、それでもほとんどは丸いです。また、多くの浮遊セルとかなりの破片があります。その後3〜4日後に培地交換を繰り返し、12日目から14日目の間に細胞が治療の準備が整うまで

成体C57ブラック6マウスの混合グリア細胞を摂氏37度または摂氏35.9度で培養し、フローサイトメトリーで分析しました。ご覧のとおり、これらの温度では、全細胞集団に明らかな違いはありません。これらの代表的なプロットは、前に示した全細胞集団から単離されたCD45陽性CD11b陽性ミクログリア集団を示しています。

この図は、混合グリアを摂氏37度ではなく摂氏35.9度で培養すると、より高いミクログリア含有量が得られることを示しています。成体脊髄、混合グリア培養物は、C67黒色6匹マウスから調製した。1日目、4日目、8日目、12日目の培養細胞の代表的な画像を示します。

文化の典型的な進歩を示すイメージは、メディアの重要性を示すだけでなく、ポストカルチャーの設立初日から変化します。一度習得すれば、混合グリア細胞培養の初期設定は、適切に行えば約4時間で完了します。混合グリア培養の確立に続いて、この初期の混合集団から、枯渇したミクログリア、および濃縮されたミクログリア濃縮培養を得ることができます。

しかし、ミクログリアが豊富な細胞の収量は、培養を確立するために多数の脊髄を使用しない限り、制限されます。この技術は当初、神経因性疼痛の発症におけるグリア細胞の役割を調査するために設計されました。ただし、成人の脊髄内の病理学的変化を伴う他の神経疾患の研究に使用できます。