イカから顔料を抽出する方法 Doryteuthis pealeii

この手順の全体的な目標は、解剖したばかりのイカ、Doryteuthis pealeii 発色団のナノ構造顆粒内に位置する色素を抽出する方法を説明することです。頭足類は、真皮の色に急速かつ適応的な変化を遂げる複雑な海洋動物です。そして、彼らの真皮の色への適応的な変化。

ただし、これらのシステムがどのように機能するかについては、まだ不明な点がたくさんあります。この技術の主な利点は、発色団器官のナノ構造顆粒を特異的に標的とすることです。これにより、ナノスケールに端を発する色の変化のメカニズムを解明することが可能となります。

頭足類の生物学に関する洞察に加えて、あらかじめパッケージ化された色素ナノ粒子を使用して、頭足類に表示される適応色のダイナミックレンジを模倣するように構築された合成システムの設計に情報を提供することができます。一般に、この方法に不慣れな個人は、周囲の組織と近接しているため、純粋な発色団組織の収集が困難であるため、苦労します。私たちの方法は、これらの汚染物質を減らすために最適化されています。

解剖を開始するには、まず約250ミリリットルのろ過された海水を解剖パンに注ぎます。標本を鍋に入れ、ステンレス鋼のまっすぐな細い先端はさみを使用して、腹側マントルの基部から動物の後側に沿って切り取り、ひれの領域で終わります。解剖鉗子で内臓をそっと持ち上げ、ハサミで結合組織を切断して、すべての内臓を切除します。

臓器は標本袋に捨ててください。解剖Tピンを使用して、マントルフィン側を上にして解剖パッドに固定します。鉗子を使用して、発色団を含む皮膚層を無傷に保ちながら、不透明な表皮皮膚層を慎重に取り除きます。

表皮層を検体袋に捨てます。次に、発色団層を除去します。発色団組織を1cm×1cmの小さな切片に切ります。

切片を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れ、各チューブの半分を解剖した組織で満たします。最後に、ろ過された海水の500マイクロリットルをチューブに追加します。色素顆粒を単離するために、まず発色団組織切片を14, 000 x gで5分間遠心分離する。

海水の最上層を捨てます。500マイクロリットルのパパインコラゲナーゼ溶液をサンプルに加え、最高設定で1〜2分間ボルテックスします。次に、サンプルを40kHzで5分間超音波処理して、細胞を周囲の組織から解離させます。

14, 000 x gでさらに5分間遠心分離し、上清を捨てます。遠心分離をさらに2回繰り返し、毎回上清を捨てます。次に、コラゲナーゼに再懸濁液を添加します。

鉗子を使用して、進行する前に消化されなかった残りの大きな組織切片を手動で除去します。出発顆粒溶液の純度は、顔料抽出に影響を与えます。そのため、出発発色団の材料が完全に消化されていることを確認することが重要です。

その結果、約1cmの組織切片が、最も純粋な顆粒集団を収集するのに最適であることがわかりました。150ミリリットルのスクリューキャップチューブを取り、HEPES、塩化マグネシウム、アスパラギン酸カリウム、およびジチオスレイトールを適量添加して、均質化緩衝液を調製します。プロテアーゼ阻害剤の市販のミニ錠剤を1錠加えます。.

メスシリンダーを使用して、100mlの脱イオン水を測定し、均質化塩の入ったチューブに加えます。溶液が透明になるまでチューブをボルテックスして混合します。組織サンプルを遠心分離し、上清を捨てます。

各チューブに500マイクロリットルの均質化バッファーを加え、2分間ボルテックスして完全に混合します。サンプルを40kHzで30分間超音波処理します。そして、それらを再び遠心分離します。

上清を廃棄した後、ホモジナイズ添加、超音波処理、遠心分離を2〜3回繰り返して、細胞外組織の完全な消化を確実にします。最後に、チューブには、淡黄色の上清と単離された色素顆粒からなる赤色のペレットが含まれている必要があります。上清を捨てます。

まず、スクリューキャップガラスサンプルバイルで抽出するための酸性メタノールを調製し、5mlのメタノールと25mcLの濃塩酸を加えます。溶液を静かに渦巻いて混ぜます。1つのサンプルチューブを取っておきます、これが最後の反応顆粒処理になります。

顆粒を含む2番目のチューブから均質化バッファーを取り出します。残りのチューブに500mcLの酸性メタノール溶液を加え、3〜4分間ボルテックスします。サンプルを40kHzで10分間超音波処理し、次に14000 x gで5分間遠心分離します。

マイクロピペットを使用して、上清を1ドラムのスクリュートップガラスバイアルに集めます。これが顔料で、色は濃い赤に見えるはずです。酸性メタノール添加、超音波処理、および遠心分離のステップを4〜5回繰り返し、それ以上の色が抽出されなくなるまで上清を収集します。

残りの無色のペレットは、顔料抽出された顆粒です。イメージング用の顆粒サンプルを調製するには、まず、未反応の顆粒アリコートと顔料抽出顆粒の両方を14000 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、次に各ペレットを1mlの95%エタノールに再懸濁します。トランスファーピペットを使用して、各顆粒懸濁液を2〜3滴ずつ別々のアルミニウムSEMスタブに置きます。

サンプルをデシケーターに入れ、真空下で一晩乾燥させます。スタブに金プラチナコーティングを施したスパッタリングコートを3分間行い、15ナノメートルのコーティングを実現します。走査型電子顕微鏡を使用してサンプルを画像化します。

次に、分光光度計を使用して、未反応の顆粒、抽出された顆粒、および抽出された顔料の吸光度プロファイルを収集します。顆粒サンプルのブランク測定を行うには、きれいなキュベットに1mlの脱イオン水を加えます。ブランクは廃棄物容器に捨てます。

次に、未反応の顔料顆粒を含む懸濁液をキュベットに加えます。顆粒サンプルの紫外可視吸収スペクトルを収集します。抽出した顔料のブランクを1mLの酸性メタノールと清潔なキュベットで2回目の測定を行います。

最後に、顔料のUV-vis吸収スペクトルを取得し、各サンプルの最大波長を決定します。走査型電子顕微鏡法により、顔料抽出プロセスが顆粒の平均直径を減少させることが明らかになりました。抽出前の顆粒の平均直径は527.3nmです。

酸性メタノール法の後、このサイズは約202.6nmに大幅に減少します。顔料の抽出によるものと考えられている減少。酸性メタノールを添加すると、未反応の顆粒に関連する色も目に見えて減少します。

この仮説の確認は、分光光度法を用いて得られた。このグラフは、抽出前に抽出された顆粒の広範な吸光度プロファイルと、抽出後に抽出された顆粒の同様に広範で強度の低いプロファイルを示しています。対照的に、可溶性抽出顔料は、約500nmでラムダmaxを示し、約380nmで明確なショルダーを示します。

まとめると、これらのデータは、顆粒から可視色の抽出が成功したことを示唆しています。一度習得すれば、このテクニックは最初から最後まで約4時間で完了します。この手順を試行する際には、抽出と分析を妨げる可能性のある反射タンパク質血小板を含む組織を完全に除去することを覚えておくことが重要です。

表皮組織は、均質化ステップや色素抽出を妨げることもあります。この手順に続いて、薄層クロマトグラフィーや質量分析などの他の方法を使用して、顔料をさらに精製し、その組成を特徴付けることができます。これらの手順は、頭足類の着色への分子的寄与を解明するのに役立ちます。

この方法は、海洋生物学者、化学者、エンジニアにとって重要な質問に答えるのに役立ちます:色の変更中に使用される顔料の組成は何ですか?また、真皮発色団器官内のナノ構造顆粒の機能と構造にどのように貢献しているのでしょうか?このビデオを見た後、解剖したばかりのイカ、doryteuthis pealeii発色団から色素を抽出する方法をよく理解しているはずです。