Name: イカから顔料を抽出する方法 Doryteuthis pealeii (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: 学ぶイカの色素抽出法：Doryteuthis pealeiiのクロマトフォアからナノ構造顆粒内の色素を抽出し、頭足類の急速な体色変化メカニズムを解明する。海洋生物学と神経科学の研究に応用可能。

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著者は、University Instrumentation Centerを含むニューハンプシャー大学の施設の使用に感謝しています。この研究は、ニューハンプシャー大学化学科の支援を受けました。

本明細書中で行わ無脊椎動物動物研究は、米国では規制されていません。したがって、制度的動物実験委員会は、そのようなプロトコルの見直しのための権限を有しません。これらの代わりに、米国における規制の管轄下に落下する著者がここにこれらの研究は、誠実な倫理的な利用に向けた努力、ケア、およびこれらの動物の治療で行われたと述べている、個人の数が最小化され、これらの努力ではありませんバーゼル宣言と実験動物学のための国際評議会（ICLAS）倫理ガイドラインと一致しています。 1. Doryteuthis pealeii（D.のpealeii）解剖<ol><li>購入断頭イカD.ウッズホール、マサチューセッツ州で海洋生物学研究所で海洋資源省から、または任意の新鮮な魚市場からpealeii。フィレットまたは以前にこの手順を適用するために変更された検体は使用しないでください。具体的には、彩度tophore層は依然として、試料上無傷でなければなりません。 <ol><li>動物をすぐに使用しない場合は、使用するまで-20℃で保存します。標本を解凍するには、前の解剖に1時間室温の水にそれらを配置します。 </li></ol></li><li>動物の後側に沿って切断したステンレス鋼ストレート細かい点解剖ハサミを使用。腹マントルの底から始まり、フィン領域に終わります。 </li><li>鉗子を解剖し、解剖ハサミを使用して結合組織を切断して、それらを持ち上げることによって内臓（胃、鰓、インク腺、生殖器官、全身心臓、および上腕心臓）のすべてを削除します。標本袋に臓器を捨てます。 </li><li>柔軟な解剖パッドを含む標準11-1 / 2 &quot;×7-1 / 2&quot;×1-1 / 2 &quot;アルミ解剖パンにマントル（フィン側まで）をピンに解剖T-ピンを使用してください。組織水没使い捨てポリスチレン真空濾過システムを通して濾過された海水を250ml0.2μmの細孔サイズを含みます。 </li><li>慎重に無傷の皮膚層を含む色素胞を保ち、解剖鉗子で表皮層（不透明色）を取り外します。表皮層が除去されると、試料袋に廃棄します。 </li><li>鉗子や解剖ハサミで色素胞層の小さい（1センチメートル×1センチ）のセクションを分析。 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ内のサンプルを収集する（解剖組織と各空のチューブの半分を埋めます）。 </li><li>チューブを含む組織にフィルタ海水の500μLを加えます。サンプルを、4℃で一晩保存することができます。 </li></ol> 2.単離色素胞色素顆粒<ol><li> 組織消化 <ol><li>パパイン/コラゲナーゼの調製<ol><li>紙の重さ4 &quot;×4&quot;低窒素を使用してコラゲナーゼを30mgおよびパパイン5mgを秤量。スクリューキャップを有する50mLのポリプロピレン遠心管にこれらを移します。 </li><li> deionizの10ミリリットルを測定します目盛り付きピペットを用いて、ED水。パパイン/コラゲナーゼを含むバイアルに直接追加します。最高の設定上の渦溶液が透明になるまで。 </li></ol></li><li>細胞外組織を削除します<ol><li>遠心分離14000×gで5分間のステップ1.7から収集した色素胞組織。廃プラスチックのバケツに海水のトップ層を捨てます。 </li><li> P1000容量可変シングルチャンネルマイクロピペットを用いて組織にパパイン/コラゲナーゼ溶液500μlを追加します。最高設定に1-2分間、各サンプルをボルテックスし。 </li><li>周囲の組織から細胞を解離するためには40kHzの周波数で5分間サンプルを超音波処理します。 </li><li> 14,000×gで5分間遠心分離します。廃プラスチックのバケツに上清を捨てます。 </li><li> G X 14,000で5分間収集色素胞組織を遠心。廃プラスチックのバケツに海水のトップ層を捨てます。もう一度繰り返します。 </li><li>手動で任意の残りの大規模な組織秒を削除次のステップに進む前に、ピンセットで、このプロセスに分解しなかったン。 </li></ol></li></ol></li><li> 顔料顆粒の単離 <ol><li>均質化緩衝液の調製<ol><li> （4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸）（HEPES、100mMの）、塩化マグネシウム（10ミリモル）0.095 gのカリウム、アスパラギン酸（50ミリモル）の0.856 g及び0.015gの2.38グラム計量ジチオスレイトール（1 mM）の。スクリューキャップと150ミリリットルのポリスチレン容器に移します。 1商業ミニタブレットのプロテアーゼ阻害剤を追加します。 </li><li>メスシリンダーを用いて、100mlの脱イオン水を測定します。均質化塩を含有する容器に直接追加します。解決までの渦は明らかです。 </li></ol></li><li>顔料顆粒の均質化<ol><li> 5分間、14,000×gでステップ2.1から各サンプルを遠心分離します。廃プラスチックのバケツに上清を捨てます。このサンプルでは、​​細胞外組織の空隙でなければなりません。 </li><li> 500＆を追加＃181; 1〜2分間ごとに、各チューブとボルテックスに均質化緩衝液のリットルは徹底的にサンプルを混合します。 30分（〜40 kHzの）のためのサンプルを超音波処理し、14,000×gでの遠心分離の5分に従ってください。 </li><li>廃プラスチックのバケツに上清を捨て、そして色素胞の球形嚢とタンパク質テザーの完全な消化を確実にするために、前のステップを2-3回繰り返します。残りの溶液は淡黄色の上澄み液と分離された色素顆粒を含む赤色のペレットを含むべきです。 </li></ol></li></ol></li></ol> 3.顔料の抽出<ol><li> 酸性メタノール（塩酸-メタノール）の製造 <ol><li>慎重にメタノール5ml（メタノール）に濃縮された（36.5から38までパーセント（w / w）の）塩酸（HCl）の25μlを添加します。スクリューキャップガラス製サンプルバイアル中のHCl-MeOH溶液を保管してください。溶液を均一に混合するために穏やかに渦巻。 注：複数の酸性溶液、より多くの顔料はFiの中に抽出されます最初の抽出。 </li></ol></li><li> 顔料の抽出 <ol><li> 14,000×gで5分間（2.2.2から）顔料顆粒サスペンションを遠心し、廃プラスチックのバケツに上清を捨てます。 </li><li>塩酸 - メタノール溶液500μlを加え、3-4分〜のために各サンプルをボルテックス。 10分（〜40 kHzの）のためのサンプルを超音波処理し、その後、14,000×gで5分間遠心します。 </li><li>トランスファーピペットを用いて、1ドラムスクリュートップガラスバイアルに上清を収集します。上清の色は暗赤色でなければなりません。 </li><li>それ以上の色が抽出されなくなるまで抽出ステップ3.2.2を繰り返し（〜4-5回の洗浄）。 注：各抽出は、顔料の〜1.5ミリリットルを得られます。残りの無色のペレットは、顔料抽出した顆粒です。注：無色顆粒抽出顔料の両方は、さらなる使用まで4℃で水中に保存することができます。 </li></ol></li></ol>抽出プロセス全体を通じて4.キャラクタリゼーション<ol><li> スキャンエル顕微鏡ectron <ol><li>抽出プロセスの純度を確認するために、走査電子顕微鏡（SEM）を用いて（ステップ2.2.1および顔料抽出ステップ3.2.3からの未反応の）画像顆粒。 </li><li>イメージングのための顆粒サンプルを調製するには、最初の遠心分離の未反応の顆粒と顔料の両方が14,000×gで5分間顆粒を抽出し、廃プラスチックのバケツに上清を捨てます。再懸濁これらをエタノール1mlに、転送ピペットを用いてアルミニウムSEMスタブ上に顆粒懸濁液を2-3滴を堆積させます。 </li><li>一晩の試料を乾燥した後、15 nmのコーティングを達成するために3分間金 - 白金コーティングでコートスパッタ。 </li><li>ショットキー・エミッタ及び二次電子検出器をSEMを用いて画像。 5-7 kVのビーム電圧および画像への8と9ミリメートルこれらの材料間のワーキングディスタンスを使用します。 </li></ol></li><li> 紫外-可視（UV-VIS）分光光度測定 <ol><li>吸光度のプロを監視します200〜800ナノメートルからデュアルビーム分光光度計を使用して、すべての3つの条件のためのファイル（2.2.2からの未反応顆粒、3.2.3から抽出された顔料、および3.2.4からの顔料抽出顆粒）。 </li><li>未反応の顆粒および顔料抽出顆粒のための1ミリリットルキュベットに脱イオン水を用いてブランク測定を収集します。両方のサンプルのためのUV-Vis吸収スペクトルを収集します。 </li><li>抽出された顔料のための1ミリリットルキュベット中の酸性メタノール溶液を使用してブランク測定を収集します。サンプル用のUV-Vis吸収スペクトルを収集します。 </li><li>吸光度ピークがその最大相対的な高さに到達する波長を識別することにより、各試料の最大波長を決定します。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

開示するものは何もありません。

私たちは、イカ色素胞の顆粒から色素を抽出する方法を示しました。特に顆粒を標的とすることによって、私たちの目標は、適応着色の媒介におけるそれらの役割を決定することです。この方法は、バルク組織サンプル14または凍結乾燥した皮膚15を使用して、頭足類の顔料を特徴付けるために設計された従来の報告とは異なります。 このプロトコルは、色素胞顔料を抽出するのに効果的であるが、それは小さな反応スケールに制限されます。精製された顆粒の〜11 mgの1イカ収量を解剖。この質量の約58％をHCl-MeOH溶液を用いて抽出された水溶性の色素が含まれています。12開始色素胞組織の純度は直接1解剖から製品の歩留まりに影響を与えます。サンプルは過剰表皮や解剖の間に収集虹色素胞組織によって汚染されて表示された場合、それは、サンプルの内容を分離追加bufに再懸濁するのが最適ですFER、および均質化が再びオーバー手順を開始します。色素胞組織から顔料顆粒の純粋な集団を単離すると、4日間にまたがる可能性など、多くの4、8のような時間の超音波処理サイクルを取...

このようなイカ、イカ、タコなどの頭足動的にカモフラージュとシグナリングのため、その外観を変更する能力を持っている。1-6この機能は、色素胞として知られている着色された臓器の選択的な面積の拡大によって部分的にサポートされています。4,7-9色素胞されています筋線維によって放射状に固定されているcytoelastic球形嚢の中に閉じ込められたナノ構造色素顆粒のネットワークを含むソフトアクチュエータ。1,3、それらが作動されるように、色素胞は、臓器全体の顆粒を配布提示表面積が500％によって拡大する。3,7このアクションは色素胞の数の上に協調された場合、10,11は 、動物の全体的な着色が変更されます。それは顔料顆粒は、この色の変化に寄与することが知られているが、それらの組成物が不明のままです。私たちは、将来の組成の研究のために適合させることができる色素胞の顔料を分離し、精製するための手順について説明します。 。3,12色素胞含む組織が頭足類から慎重に摘出を通して収穫されます。消化及び均質化処理は、次に、周囲の組織を解離し、色素胞細胞を分離するために使用されます。ナノ構造の顆粒を繰り返し、超音波処理し、遠心分離を用いて、残りの色素胞から単離され、精製されます。精製の際、顔料は酸性メタノール溶液を使用して蝶の羽からの可視色の抽出から適合されたプロセスにおける顆粒から抽出される。13走査電子顕微鏡（SEM）及び分光光度は色素胞顔料が正常に使用して抽出されていることを確認するために使用されていますこのプロセス。 この方法は、cの分子の寄与を調査するために使用される色素胞顆粒の単離を記載します頭足類でoloration。動物全体から12小分子の抽出は、多くの場合、長くて退屈なプロセスになることがあります。ここでの目的は、頭足類でのナノ構造の顆粒から顔料を取得するための効果的かつ容易なプロトコルの将来の研究者を通知することです。

<table><tbody><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>アルファ エーザー</td><td>9001-12-1</td><td>危険なし</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3482-12-3</td><td>刺激性、急性毒性</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td>軽度の刺激性</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>EMD 化学物質</td><td>7647-01-0</td><td>腐食性</td></tr><tr><td>k-アスパラギン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1115-63-5</td><td>反応酸化剤と激しく</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td>軽度の眼刺激性</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>67-56-1</td><td>非常に可燃性</td></tr><tr><td>のミニ錠剤 prtoease inhibitor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>469315-90-01</td><td>金属や皮膚に腐食性</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-73-4</td><td>刺激性&nbsp;</td></tr></tbody></table>

イカから顔料を抽出する方法<em&gt; doryteuthis pealeii</em

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

頭足類は、感知、コミュニケーション、防御、および生殖の目的で、皮膚の色を急速かつ適応的に変化させることができます。これらの機能は、発色団として知られる色素性器官の面膨張と収縮によって部分的にサポートされています。発色団が色素性顆粒のつながれたネットワークを含んでいることは知られていますが、その構造機能特性は完全には詳細に説明されていません。私たちは、イカDoryteuthis pealeii発色団のナノ構造顆粒を単離する方法を説明し、それらに関連する色素を酸性溶媒で抽出する方法を示します。これを達成するために、真皮層を含む発色団を最初に表在性解剖を使用して手動で単離し、超音波処理、遠心分離、および洗浄サイクルを使用して色素顆粒を除去します。精製された顆粒内に閉じ込められた顔料は、酸性メタノール溶液を介して抽出され、目に見える色がない小さな直径のナノ構造が残ります。この抽出手順により、顆粒から単離された可溶性顔料の収率が58%になります。この方法を使用すると、発色団顔料の組成を決定し、頭足類の適応着色のメカニズムについての洞察を提供するために使用できます。

色素胞は、Dから解剖されていますpealeii背マントル（ 図1A、1B）。それらが削除されると、色素胞を溶解させ、着色された顆粒（ 図2A、2B） を出て分離するために遠心分離し、洗浄サイクルを使用して精製されます。酸性メタノール溶液（塩酸-メタノール）は、可溶性色素の抽出物および不溶性の、無色の顔料抽出顆粒を得、顆粒（ 図2C）から色素を抽出するために使用されます。 抽出プロセスは、顆粒の平均直径を減少させます。これは、走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて観察されます。 （; 図3A N = 100、誤差は標準偏差である）顆粒をHCl-MeOH中に暴露される前に、彼らは（527.3...

イカDoryteuthis pealeii色素胞におけるナノ構造の顆粒から顔料の抽出のためのプロトコルが提示されています。

イカから顔料を抽出する方法<em&gt; Doryteuthis pealeii</em

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities ...

この手順の全体的な目的は、解剖したばかりのイカ（Doryteuthis pealeii）の色素胞にあるナノ構造顆粒内に位置する色素を抽出する方法について述べることです。頭足類は、皮膚の色を迅速かつ適応的に変化させる複雑な海洋動物です。しかしながら、これらのシステムがどのように機能しているかについては、依然として不明な点が多く残されています。本手法の主な利点は、色素胞器官内のナノ構造顆粒を特異的に標的とできることです。これにより、ナノスケールで発生する変色のメカニズムを解明することが可能になります。頭足類の生物学的な知見が得られるだけでなく、あらかじめパッケージ化された有色ナノ粒子を用いて、頭足類に見られる適応的な色のダイナミックレンジを模倣するように構築された合成システムの設計に役立てることができます。一般的に、この手法に不慣れな人は、色素胞組織が周囲の組織に近接しているため、純粋な色素胞組織を採取することに苦労します。本手法は、これらの混入物を減らすように最適化されています。解剖を開始するために、まず、ろ過した海水を約250 milliliters解剖パンに注ぎます。個体をパンに入れ、ステンレス製ストレート微細先端鋏を用いて、腹側外套膜の基部から動物の後方側にかけて、鰭の領域まで切開します。解剖用ピンセットで慎重に持ち上げ、鋏で結合組織を切断して、すべての内臓を取り出します。臓器は検体袋に入れて廃棄してください。解剖用Tピンを使用し、外套膜の鰭側を上にして解剖パッドに固定します。ピンセットを用いて、色素胞を含む皮膚層を維持しながら、不透明な表皮層を慎重に取り除きます。表皮層を検体バッグに廃棄します。次に、色素胞層を取り除きます。色素胞組織を1 cm × 1 cmの小さな正方形に切断します。切片を1.5 milliliterのマイクロ遠心チューブに入れ、各チューブの半分まで解剖した組織で満たします。最後に、ろ過済みの海水500 microlitersをチューブに加えます。色素顆粒を単離するため、まず色素細胞組織の切片を14, 000 x gで5分間遠心分離します。海水の上層を廃棄します。サンプルにパパイン・コラゲナーゼ溶液を500 µL加え、最高設定で1〜2分間ボルテックスします。次に、サンプルを40 kHzで5分間超音波処理し、周囲の組織から細胞を解離させます。さらに14,000 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てる。この遠心操作をさらに2回繰り返し、その都度上清を捨てる。その後、コラゲナーゼ懸濁液を加える。次に進む前に、ピンセットを使用して、消化されずに残っている大きな組織片を手作業で除去します。開始時の顆粒溶液の純度は色素抽出に影響するため、開始時の色素胞材料が完全に消化されていることを確認することが重要です。顆粒の最も純粋な集団を回収するには、1 cm程度の組織切片が最適であることがわかりました。150 mLのスクリューキャップチューブを用意し、適切な量のHEPES、塩化マグネシウム、アスパラギン酸カリウム、およびジチオスレイトールを加えてホモゲナイズバッファーを調製します。ここに、市販のプロテアーゼ阻害剤ミニタブレットを1錠加えます。メスシリンダーを用いて脱イオン水100mlを量り取り、ホモジナイズ塩を含むチューブに加えます。溶液が透明になるまで、チューブをボルテックスミキサーで撹拌します。組織サンプルを遠心分離し、上清を廃棄します。各チューブに500 µLのホモジナイズ緩衝液を加え、ボルテックスミキサーで2分間攪拌し、十分に混合させます。サンプルを40kHzで30分間超音波処理します。その後、再度遠心分離を行います。上澄み液を捨てた後、細胞外組織を完全に消化させるため、ホモゲナイザーによる添加、超音波処理、および遠心分離を2〜3回繰り返します。最終的に、チューブ内には淡黄色の上澄み液と、単離された色素顆粒からなる赤色のペレットが含まれているはずです。上澄み液を捨てます。まず、スクリューキャップ付きガラスサンプルバイアルにメタノール5mlと濃塩酸25µLを加え、抽出用の酸性メタノールを調製します。溶液を軽く回して混ぜ合わせます。サンプルチューブを1本取り分けておきます。これは反応終了後の顆粒処理に使用します。顆粒が入った2本目のチューブからホモジナイズ緩衝液を除去します。残りのチューブに酸性メタノール溶液を500mcL加え、3〜4分間ボルテックスします。サンプルを40kHzで10分間超音波処理し、その後14000 x gで5分間遠心分離します。マイクロピペットを用いて、上清を1ドラマのスクリューキャップ付きガラスバイアルに回収します。これが色素であり、色は濃赤色に見えるはずです。酸性メタノールの添加、超音波処理、および遠心分離のステップを、色が抽出されなくなるまで4〜5回繰り返し、その都度上清を回収します。残った無色のペレットが色素抽出後の顆粒です。イメージング用の顆粒サンプルを調製するには、まず未反応顆粒のアリコートと色素抽出後の顆粒の両方を14000 x gで5分間遠心分離して上澄みを捨て、その後、各ペレットを1mlの95%ethanolで再懸濁させます。移送ピペットを用いて、各顆粒懸濁液を2〜3滴ずつ、別々のアルミニウム製SEMスタブ上に滴下します。サンプルをデシケーターに入れ、真空状態で一晩乾燥させる。スタブに金白金コーティングを3分間スパッタリングし、15 nanometerのコーティング層を形成する。走査電子顕微鏡を用いてサンプルの観察を行う。次に、分光光度計を用いて、未反応顆粒、抽出済み顆粒、および抽出済み色素の吸光度プロファイルを収集します。清潔なキュベットに1mlの脱イオン水を加え、顆粒サンプルのブランク測定を行います。ブランク液は廃棄容器に捨ててください。次に、未反応の色素顆粒を含む懸濁液をキュベットに加えます。顆粒サンプルのUV-vis吸収スペクトルを測定します。酸性メタノール1mLと清潔なキュベットを用いて、抽出色素の2回目のブランク測定を行います。最後に、色素のUV-vis吸収スペクトルを測定し、各サンプルの最大波長を決定します。走査電子顕微鏡での観察により、色素抽出工程によって顆粒の平均直径が減少することが明らかになりました。抽出前の顆粒の平均直径は527.3nmです。酸性メタノール処理後、このサイズは約202.6nmまで大幅に減少します。この減少は、色素の抽出によるものと考えられます。酸性メタノールを添加すると、未反応の顆粒に伴う色も目に見えて減少します。この仮説の確認は、分光光度法を用いて行われました。このグラフは、抽出前の顆粒の広範な吸光プロファイルと、同様に広範ながら強度の低い抽出後の顆粒のプロファイルを示しています。対照的に、可溶性の抽出色素は、500nm付近に最大吸収波長（lambda max）を示し、380nm付近に明確なショルダーピークを示しています。これらのデータを総合すると、顆粒から可視色を抽出することに成功したことが示唆されます。この手法に習熟すれば、開始から終了まで約4時間で完了させることができます。この手順を行う際は、抽出および分析を妨げる可能性のある反射性タンパク質小板を含む組織を完全に除去することが重要である点に注意してください。表皮組織がホモジナイズ工程や色素抽出を妨げる場合があります。本手順の後、薄層クロマトグラフィーや質量分析などの他の手法を用いて、色素をさらに精製し、その組成を特性評価することができます。これらの工程は、頭足類の呈色の分子的な寄与を解明するのに役立ちます。本手法は、海洋生物学者、化学者、およびエンジニアにとって重要な以下の問いに答えるのに役立ちます。体色変化の際に使用される色素の組成は何であるか。そして、それらは真皮の色素胞器官内にあるナノ構造顆粒の機能と構造にどのように寄与しているのか。このビデオを視聴することで、新鮮に解剖されたイカ（Doryteuthis pealeii）の色素胞から色素を抽出する方法について、十分な理解を得ることができるはずです。

a-method-for-extracting-pigments-from-squid-doryteuthis-pealeii

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イカから顔料を抽出する方法

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