天然化合物ライブラリーの探査に適した抗バイオフィルムアッセイのプラットフォーム

このアッセイプラットフォームの全体的な目標は、新しい抗バイオフィルム化合物の同定と特性評価のために、関連するエンドポイント、生存率、バイオマス、およびバイオフィルムマトリックスの3つを組み合わせた有意義なスクリーニングワークフローを提供することです。このプラットフォームは、短期の化学療法効果と長期化学療法効果を早期に区別し、互換性のある方法で説明することにより、抗バイオフィルム剤探索の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この開発されたプラットフォームの主な利点は、さまざまなアッセイを組み合わせて、化学ライブラリ、特に天然化合物の抗バイオフィルム効果をより完全に把握できることです。

実験を開始するには、滅菌済みの96マイクロウェルプレートのウェルあたり1ミリリットルの細菌培養物あたり10〜6CFUの200マイクロリットルで未処理のコントロールサンプルを調製します。細菌培養を含まない培地コントロールを含めます。次に、同じ96ウェルプレート上に、ウェルあたり4マイクロリットルの50倍抗生物質ストック溶液と196マイクロリットルのバクテリア培養物を含むサンプルを調製し、培養物をインキュベートします。

マルチチャンネルピペットを使用して、バイオフィルムに触れたり気泡を発生させたりすることなく、プランクトン溶液全体を慎重に、別の清潔な96ウェルプレートに移すことにより、レサズリン染色を続けます。再度、マルチチャンネルピペットを使用して、バイオフィルムをウェルあたり200マイクロリットルを追加して滅菌PBSで一度洗浄し、溶液を慎重に除去します。バイオフィルムプレートのウェルごとに200マイクロリットルの20マイクロモルのレサズリン溶液を加え、未処理のバイオフィルムコントロールが均一にピンク色になるまで、暗闇で200rpmで20分間バイオフィルムをインキュベー

次に、プレートリーダーで蛍光を測定します。ウェルからレサズリンの汚れを慎重に取り除きます。バイオフィルムを200マイクロリットルのメタノールで15分間固定します。

固定後、メタノールを取り出し、プレートを10分間自然乾燥させます。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、190マイクロリットルの0.02%クリスタルバイオレット溶液をバイオフィルムに慎重に加えます。ピペッティング中は、ウェルの側面や汚れに触れないようにし、気泡の形成を防ぎ、ピペットを押して完全に吹き飛ばさないでください。

その後、プレートを室温で5分間インキュベートします。マルチチャンネルピペットで汚れを慎重に取り除きます。バイオフィルムを200マイクロリットルの脱イオン水で洗浄します。

ウェルを室温で5分間乾燥させ、残りの汚れを33%酢酸に溶解します。プレートを室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、595ナノメートルの吸光度を読み取ります。

調製したプランクトン溶液プレートの595ナノメートルでの濁度を測定します。これは、クリスタルバイオレット染色プレートのインキュベーション中に行うことができます。次に、ウェルごとに10マイクロリットルのレサズリンストックを追加することにより、プランクトン性細菌をレサズリンで染色します。

溶液をピペットで動かしてよく混ぜます。プレートを暗闇で室温、200rpmで約5分間インキュベートし、未処理のコントロールが均一にピンク色になるまでインキュベートします。次に、蛍光を測定します。

この染色のために平行サンプルプレートの1つを入手し、マルチチャンネルピペットを使用してウェルからプランクトン溶液を除去します。バイオフィルムに触れずに、滅菌PBSでウェルを一度慎重に洗います。ウェルごとに200マイクロリットルの小麦胚芽凝集素、またはWGA溶液を加えて染色します。

その後、プレートをインキュベートします。インキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄し、結合していない汚れを取り除きます。プレートを室温で15分間乾燥させます。

蛍光顕微鏡とFITCフィルターでサンプルを可視化します。結合した染色液をウェルあたり200マイクロリットルの33%酢酸に溶解します。ストリップキャップでウェルを密封し、ウォーターバスソニケーターを使用してそれらを超音波処理します。

超音波処理後、プレートを摂氏37度で1時間インキュベートします。1時間後、超音波処理ステップの間にウェルを密閉したまま、超音波処理を繰り返します。プレートリーダーで蛍光を測定します。

再度、この染色のために平行サンプルプレートの1つを取り、マルチチャンネルピペットを使用して、ウェルからプランクトン溶液を取り出します。次に、ウェルを滅菌PBSで一度洗います。ウェルあたり6マイクロリットルの染色液を加え、プレートを暗闇で15分間インキュベートします。

顕微鏡検査の前に、マルチチャンネルピペットを使用して手動で余分な液体を取り除きます。蛍光顕微鏡とFITCフィルター(緑色蛍光の場合)を使用して生存細胞を視覚化し、TRITCフィルター(赤色蛍光の場合)を使用して死細胞を視覚化します。この染色には、平行サンプルプレートの1つを使用し、プランクトン溶液をウェルから取り出し、マルチチャンネルピペットを使用してウェルを滅菌PBSで一度洗浄します。

次に、ウェルごとに200マイクロリットルの染色溶液を加え、暗闇で15分間インキュベートします。最後に、プレートリーダーで蛍光を測定します。未処理のバイオフィルムコントロールに対するプラットフォームの性能を実証するために、2回のスクリーニングを実施しました。

キナアルカロイド誘導体ライブラリーのスクリーニングにより、1つの活性化合物が同定されました。アビエタン型ジテルペノイドおよび誘導体のライブラリーをスクリーニングした結果、5つの活性化合物が同定されました。ペニシリンGとシプロフロキサシンはどちらも、バイオフィルム形成前に生存率、バイオマス、およびバイオフィルムマトリックスPNAG含有量を大幅に減少させます。

しかし、ポストエクスポージャーを用いた場合はそうではありませんでした。最も顕著な結果は、バイオフィルムマトリックスの増加は、事前に形成されたバイオフィルムが高濃度のペニシリンG.This蛍光画像で処理されたときに、バイオフィルムマトリックスの増加であり、ペニシリンGは、事前に形成された黄色ブドウ球菌、バイオフィルム、細菌集団の約50%を殺すことを確認します。未処理のバイオフィルムウェルの緑と赤の蛍光比の平均は、生細胞が優勢であることを示しています。

一方、ペニシリン処理された井戸には約56%の生細胞があります。ペニシリン処理後に生き残った細胞は、未処理のバイオフィルムと比較して、有意に高い量の細胞外高分子物質(EPS)を産生しました。この手順を試行する際は、細菌の汚染やウェル間の汚れを避けるために、ピペットの手動取り扱いに注意を払うことを忘れないでください。

このプラットフォームにより、黄色ブドウ球菌に対して有効な抗バイオフィルム化合物を迅速に同定し、特性評価することができます。他の細菌種を使用する場合、染色プロトコルの他の最適化が必要になりますが、プラットフォームの合理性は同じままです。