Name: 示差メチル化の測定 INSバイオマーカー膵島のβ細胞死などのヒト血清試料中のDNA種 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学ぶデジタルPCRを用いたヒト血清中の差異的メチル化プレプロインスリンDNA測定法。β細胞死のバイオマーカーとして、1型糖尿病の早期診断と治療介入のタイミング評価に貢献します。

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この作業は、国立衛生研究所の助成金UC4 DK104166（RGMに対して支援を受けました。国立衛生研究所の助成金P30 DK097512によってサポートされているインディアナ糖尿病研究センター翻訳コアの支援に感謝します。

倫理に関する声明: プロトコルは、インディアナ大学の治験審査委員会によって承認されました。被験者の両親は書面によるインフォームドコンセントを提供し、7歳以上の子供は彼らの参加に同意しました。
1. 血清処理
注:記載されているアッセイは、以下のように単離されたヒト血清を用いて厳密に試験されています。
<ol>
	<li>1本の赤いトップ(無添加、コーティングなし)の採血チューブに血液を採取します。</li>
	<li>血栓が形成されるまで、室温で30分間放置します。</li>
	チューブを<li>2,000 x gで室温で10分間遠心分離します。上清(血清)を血清保存用に指定された新しいチューブ(ポリプロピレンスクリュートップチューブ、サイズはサンプルによって異なります)に移します。</li>
	<li>DNA単離の準備ができるまで、サンプルを-80°Cで保存します。</li>
</ol>
2. 血清DNA抽出
注:DNAは、50 μlの血清(推奨)を使用したDNA抽出キットで、メーカーのプロトコルに従っていくつかの変更を加えて抽出します。
<ol>
	<li>微量遠心チューブにサンプルあたり200 μlの溶解バッファー + 1 μlのポリ(A) (5 μg)を調製します。15秒間渦巻きます。ステップ2.3まで取っておきます。</li>
	<li>-80°Cの冷凍庫から血清サンプルを採取し、室温で解凍します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含む) を使用して、血清サンプル量を合計 200 μl まで増やします。</li>
	<li>20 μl のプロテアーゼ (1.4 Anson units/mL) をサンプルに加え、続いて 200 μl の溶解バッファー/polyA ミックス (ステップ 2.2) を加えてサンプルを溶解し、8 秒間ボルテックスします。サンプルを 56 °C で 10 分間インキュベートした後、微量遠心分離機 (>10,000 x g) で最高速度で 7 秒間短時間遠心分離します。</li>
	<li>100%エタノール230μLをサンプルに加え、8秒間ボルテックスしてDNAを沈殿させ、最高速度(>10,000 x g)で7秒間短時間遠心分離します。</li>
	<li>ミニスピンカラムに600μlのサンプル混合物を加えて、DNAをスピンカラムにアプライします。6,000 x gで1分間遠心分離します。フロースルーを捨て、カラムをきれいなチューブに入れます。</li>
	<li>500 μl の洗浄バッファー 1 をカラムに添加して DNA を洗浄します。6,000 x gで1分間遠心分離します。フロースルーを捨て、カラムをきれいなチューブに入れます。500 μl の洗浄バッファー 2 をカラムに加え、最高速度 (>10,000 x g) で 3 分間遠心分離します。新しい1.5 mLの微量遠心チューブにカラムを入れ、再び最高速度で1分間遠心分離します。</li>
	<li>新しい1.5 mLの微量遠心チューブにカラムを入れ、60 μlの溶出バッファーをフィルターに直接加えて、DNAを溶出します。クロスコンタミネーションを防ぐために、サンプル間でチップを交換することが重要です。室温で5分間インキュベートした後、6,000 x gで1分間遠心分離します。さらに60 μlの溶出バッファーを添加し、6,000 x gで1分間遠心分離します。 </li>
	<li>後で使用するためにDNAを-20°Cで保存するか、すぐにバイサルファイト変換に進みます。</li>
</ol>
3. 亜硫酸水素塩変換
注:バイサルファイト変換は、バイサルファイト変換キットを使用して、製造元のプロトコルに従っていくつかの変更を加えて実行します。
<ol>
	<li>非メチル化シトシンをウラシルに変換するには、ステップ2.7のDNA20 μlに130 μlのバイサルファイト変換試薬をPCRチューブ(1本の0.2 mL PCRチューブまたは8ストリップPCRチューブ)で加えます。残りの40 μlのDNAは、将来の使用のために保存するか、または複製反応に使用します。ピペッティングで上下させて20回混合し、短時間遠心分離して、側面や蓋に水滴が落ちていないことを確認します。ウォーターバスまたはサーマルサイクラーで、98°Cで8分間、54°Cで60分間、4°Cで5分間インキュベートします。
	<ol>
		<li>手順3.2に進むか、4°Cで最大20時間保存します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>スピンカラムに600 μlの結合バッファーを加え、付属のコレクションチューブにカラムを配置します。重亜硫酸塩DNAをカラムにアプライし、ピペッティングで10回上下させて混合します。最高速度(>10,000 x g)で30秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。</li>
	<li>100 μlの洗浄バッファーをカラムに添加してDNAを洗浄し、最高速度 (>10,000 x g) で30秒間遠心分離します。</li>
	<li>脱スルホン化を行ってスルホン酸基を除去し、非メチル化シトシンからウラシルへの変換を完了するために、200 μlの脱スルホン化バッファーをカラムに添加します。室温で20分間放置した後、最高速度(>10,000×g)で30秒間遠心分離します。</li>
	<li>200 μlの洗浄バッファーをカラムに添加してDNAを洗浄し、30秒間全速力で遠心分離します。フロースルーを破棄し、この洗浄ステップを繰り返します。</li>
	<li>カラムを 1.5 mL の微量遠心チューブに入れます。10 μLの溶出バッファーをカラムフィルターに直接添加してDNAを溶出します。1分間インキュベートします。全速力で30秒間遠心分離し、DNAを溶出します。A260. の分光光度法により回収されたDNAを定量
	注:分光光度法によって検出されるDNAは、主に上記のステップ2.3で追加されたキャリアpolyA DNAを表します。通常、polyAの回収率は入力の≥85%(>4.25μg)です。</li>
	<li>デジタルPCRに進む準備ができるまで、DNAを-20°Cで保存します。</li>
</ol>
4. マルチプレックスデジタルPCR
<ol>
	<li>各サンプルとコントロールに十分な溶液を含むマスターミックスを作成します。水を含むサンプル(ネガティブコントロール)、非メチル化INSを含むプラスミドのサンプル1つ(1 pg、ポジティブコントロール)、メチル化INSを含むプラスミドのサンプル1つ(1 pg、ポジティブコントロール)、およびプラスミドの1:1混合物を含むサンプルを少なくとも1つ含めます。
	<ol>
		<li>PCRマスターミックスを調製するには、PCRバッファーの反応あたり12.5 μl(例:10サンプルあたり125 μl)、反応プライマー/プローブミックスあたり1.25 μl(例:10サンプルあたり12.5 μl)、反応水あたり8.25 μl(例:10サンプルあたり82.5 μl)、反応EcoR1酵素(例:1反応あたり0.5 μl)を添加します。 10サンプルあたり5μl). 
		注:ここで使用されるプライマーとプローブは次のとおりです:フォワードプライマー:5'-GGAAATTGTAGTAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGT-3';リバースプライマー:5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3';FAMプローブ:FAM-5'-ACCCCTACCACCTAAC-3'-MGB;VICプローブ:VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>マルチプレックスPCR反応を96ウェルプレートにセットアップします。各ウェルに19.5μlのマスターミックスを加えます。2.5 μlのバイサルファイト変換DNAサンプルを各適切なウェルに加えます (残りの7.5 μlのバイサルファイト変換DNAを保存するか、反復反応に使用します)。数回ピペッティングで上下させて混合します. 
	注:行内の8つのウェルすべてにサンプルまたはバッファーコントロールが含まれている必要があります。</li>
	<li>プレートシーラーを使用してホイルシールでシールし、ウェルの側面に液体がなくなるまでプレートスピナーで遠心分離します。</li>
	<li>タッチスクリーンで自動液滴発生器を設定します. 
	注:カートリッジ内の8つのウェルすべてに、サンプルまたはバッファーコントロールが含まれている必要があります。
	<ol>
		<li>ステップ4.2から96ウェルプレート上のサンプルがロードされる行に触れて、使用する行の数を設定し、行を青色で強調表示してアクティブな行を示します。</li>
		<li>汚染を避けるために、消耗品を背面から前面にロードします。まず、装置の後列に沿ってカートリッジを追加します。チップを機器の中央列にロードします. 
		注意: カートリッジは、正しい向きでホルダーに収まるだけです。</li>
		<li>96ウェルプレートを装置にセットします。-20°Cの冷凍庫からコールドブロックを取り出し、新しいスカート付き96ウェルプレートをその中に入れます。サンプルをロードした96ウェルプレートの隣の装置内に置きます。</li>
		<li>機器の前面にあるディスペンサーにオイルを追加します。タッチスクリーンでオイルの種類を選択します。</li>
		<li>青いスタートボタンをタッチして、実行を開始します。プレートのセットアップを確認し、スタートランボタンをタッチして開始します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>終了したら、新しく形成された液滴を含む96ウェルプレートを取り外し、プレートシーラーを使用してホイルシールでシールします。</li>
	<li>サーマルサイクラーで PCR10 を以下のプログラムで実行します: 95 °C で 10:00 分、40 サイクル: 94 °C で 00:30 分、57.5 °C で 01:00 分、98 °C で 10:00 分、12 °C で 10 分または最大 24 時間。</li>
	<li>プレートを液滴リーダーに置き、リーダーをセットアップします。
	<ol>
		<li>[設定] タブをクリックします。[テンプレート] > [新規] をクリックして新しいテンプレートを開きます。ファイル名を入力します。</li>
		<li>ウェルエディターを使用して、各サンプルのパラメーターを設定します。各サンプルに一意の名前を付け、実験をレアイベント検出(R-RED)に設定し、マスターミックスをステップ4.1で使用したミックスに設定します。</li>
		<li>Target 1 に名前 (つまり、非メチル化) を付け、Target 1 を不明 (U) に設定します。Target 2 に名前 (メチル化) を付け、Target 2 を参照 (R) として設定します。</li>
		<li>「実行」タブをクリックして、実行を開始します。実行オプションウィンドウで、検出ケミストリー(FAM/VIC)を選択します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. データ分析
<ol>
	<li>解析タブで結果を開き、ポジティブコントロールに基づく2Dプロットを使用して解析します(図1を参照)。</li>
	<li>Droplet Readerで生成したCSVファイルを表計算ソフトにエクスポートして、データ解析を行います。</li>
	<li>血清の「1μlあたりのコピー数」を生成するには、(濃度*250)/(DNA単離に使用した血清の量(μl))の式を使用します。6 
	注:データは通常、ヒト血清から取得すると、正規分布を確保するためにlog10に変換されます。あるいは、データをlog10スケールでプロットし、ノンパラメトリック統計で分析することもできます。</li>
</ol>
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<li>Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

DNAメチルトランスフェラーゼによってシトシンのメチル化は、多くの遺伝子における転写のエピジェネティックな制御を可能にします。ヒトでのINS遺伝子がほぼ独占的に膵島β細胞で発現し、その転写11のサイレンシングにINS遺伝子中のシトシンのメチル化の頻度との間に相関関係があるように表示されます。 13 -このように、ほとんどの細胞型は、β細胞11に比べ、様々なシトシンにおけるINS遺伝子のメチル化の実質的に高い周波数を示します。それらのDNA 12を遊離β細胞死滅から主として生じるであろう、β細胞死の有病率は、無細胞非メチル化INS DNAの血清レベルの分析によって監視することができることが提案されています。 重亜硫酸塩反応は14不変のメチル化シトシンを残し、ウラシルに非メチル化シトシンを変換します。シークエンシングまたはPCR分析OFの重亜硫酸塩変換DNAは、した...

1型糖尿病（T1D）は、自己反応性T細胞1によるインスリン産生膵島β細胞の破壊により特徴付けられる自己免疫疾患です。 T1Dの診断は、通常、インスリン欠乏の証拠としてケトアシドーシスを呈する可能性があるリーン、若い個体で高血糖（血糖値&gt;が200mg / dl）の測定時に行われます。 T1Dの診断時に、β細胞機能及び質量の実質的な損失の証拠がある（50〜 - 90％）2。臨床研究では、診断時に制定されたいくつかの免疫調節薬は、疾患の臨床的寛解をもたらしたβ細胞機能（およびおそらく質量）が、いずれの安定化の発展のためにコールを調達している知見をもたらしました病気の早期発見のためとの併用療法3,4の有効性の長手方向の追跡のためのバイオマーカーの。国際コンソーシアムの取り組み、などヒース5の国立研究所のヒト膵島研究ネットワークコンソーシアムはね、T1D中のβ細胞ストレスと死に焦点を当てたバイオマーカーを開発する必要性を強調してきました。 9 -これらの取り組みに沿って、私たちのグループなどが最近β細胞6を死んでから主に生じる循環、エピジェネティック修飾されたDNA断片を測定するバイオマーカーアッセイを開発しました。現在まで発表されたアッセイの全てにおいて、焦点は他の細胞型と比較して、コードおよびプロモーター領域における非メチル化CpG部位のより大きな程度を実証するヒト遺伝子をコードするプレ（INS）の定量にされています。非メチル化INS DNA断片の放出は（壊死性、アポトーシス）β細胞を瀕死から主に発生していると仮定しました。我々の最近の研究では位置で、若者にいることを非メチル化とメチル化の両方INS DNAの上昇を示した-69 bpの（トンへの相対彼は新たな発症T1Dで観察され、そして一緒にこの集団6のような特異的バイオマーカーを務めた）転写開始部位。これらのバイオマーカーアッセイは、（ウラシルに非メチル化シトシンを変換するために、無傷のメチル化シトシンを残して）単離されたDNAの重亜硫酸塩変換に続く商用スピンキットを用いて、血清または血漿からの無細胞DNAの単離を伴います。 この報告書では、我々は、血清からの無細胞DNA、重亜硫酸塩変換、および示差的メチル化INS DNAのための液滴のデジタルPCR（以下、デジタルPCR）の性能の単離を、血清サンプル収集の技術的側面を説明します。

<table><tbody><tr><td>レッドトップバキュテイナー&nbsp;</td><td>Beckon Dickinson</td><td></td><td>366441 無添加、コーティングなしの内部、10 ml</td></tr><tr><td>クライオバイアル チューブ</td><td>Simport</td><td>T310-3A</td><td>ポリプロピレン、スクリュー キャップ チューブ、任意のサイズ</td></tr><tr><td>QIAamp DNA 血液ミニ キット</td><td>Qiagen</td><td>51106</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A)</td><td>Sigma</td><td>P9403</td><td>TE バッファー (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) から 5 &micro;g/&micro;l&nbsp;</td></tr><tr><td>無水エタノール (200プルーフ)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (with CaCl2 and MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml PCR 8ストリップチューブ</td><td>MidSci</td><td>AVST</td><td></td></tr><tr><td>8ストリップキャップ、ドーム</td><td>MidSci</td><td>AVSTC-N</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA メチル化-ライトニングキット</td><td>Zymo</td><td>D5031</td><td></td></tr><tr><td>プローブ用ddPCRスーパーミックス(dUTPなし)</td><td>プローブ用バイオラド</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>バッファー制御</td><td>バイオラッド</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>ヒト非メチル化/メチル化プライマー/プローブミックス</td><td>Life Technologies</td><td>AH21BH1</td><td></td></tr><tr><td>EcoR1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101L</td><td></td></tr><tr><td>twin.tec PCRプレート96、セミスカート</td><td>エッペンドルフ</td><td>951020346</td><td></td></tr><tr><td>ピアス可能なホイルヒートシールBiorad</td><td></td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCRプレートシーラー</td><td>Biorad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QX200 AutoDG液滴デジタルPCRシステム</td><td>Biorad</td><td>1864101</td><td></td></tr><tr><td>プローブ用自動液滴生成オイル</td><td>Biorad</td><td>186-4110</td><td></td></tr><tr><td>DG32 自動液滴発生器用カートリッジ</td><td>Biorad</td><td>186-4108</td><td></td></tr><tr><td>自動液滴発生器用ピペットチップ</td><td>Biorad</td><td>186-4120</td><td></td></tr><tr><td>自動液滴発生器用ピペットチップビン</td><td>Biorad</td><td>186-4125</td><td></td></tr><tr><td>C1000 タッチサーマルサイクラー</td><td>Biorad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Reader</td><td>Biorad</td><td>186-4003</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Droplet Reader Oil</td><td>Biorad</td><td>186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

示差メチル化の測定<em&gt; ins</em&gt;バイオマーカー膵島のβ細胞死などのヒト血清試料中のdna種

Measurement of Differentially Methylated INS DNA Species in Human Serum Samples as a Biomarker of Islet &#946; Cell Death

膵島β細胞の死は、事実上すべての形態の糖尿病の病因の根底にあり、特に1型糖尿病における率直な高血糖症の発症に先行すると考えられています。β細胞死の高感度で信頼性の高いバイオマーカーの開発により、糖尿病の発症を予防または遅延させるための早期治療介入が可能になる可能性があります。最近、私たちのグループを含むいくつかのグループが、循環中のプレプロインスリン(INS)をコードする無細胞の差別化メチル化DNAが、プレタイプ1糖尿病および新たに発症した1型糖尿病のβ細胞死と相関していることを報告しています。ここでは、-69 bp(転写開始部位に対して)のシトシンで差動的にメチル化される無細胞INS DNAを測定するためのデジタルPCRを使用した段階的なプロトコールを示します。このアッセイは、-69 bpの位置でメチル化シトシンと非メチル化シトシンを区別でき、数桁にわたって直線的であり、DNAコピー数の絶対定量を提供し、新たに発症した1型糖尿病および無病対照の個人のヒト血清サンプルに適用できることを示しています。ここで説明するプロトコルは、循環からであろうと単離された細胞や組織からであろうと、異なるメチル化シトシンの検出が望まれる任意のDNA種に適合させることができ、DNA断片の絶対定量を提供することができる。

適切にデータを解釈するために、我々は各デジタルPCR実行で非メチル化およびメチル化ターゲットINS DNAの両方のためのプラスミドコントロールを使用します。これらのコントロールは、メチル化および非メチル化DNAに対応する信号が明確に区別されていることを確認してください。 図1は、重亜硫酸塩変換されメチル化されていないINS DNA（ 図1A）を含むプラスミド対照、メチル化INS DNA（ 図1B）が液滴に対応する2次元散布図を示しており、1：二つのプラスミド（ 図1C）の1：1混合物。メチル化INSを含むプラスミドは、VIC信号に対する陽性の液滴によって示されているのに対し、非メチル化INSを含むプラスミドは、6-カルボキシフルオレセイン（FAM）信号用ポジティブ液滴によって示されています。 1：1のプラスミド混合物、二重陽性の液滴の人口は、両方の種...

膵島β細胞死は1型糖尿病の発症に先行し、このプロセスを検出することで早期の治療介入が可能になるかもしれません。ここでは、β細胞死のバイオマーカーとして、ヒト血清中の異なるメチル化INS DNA種を測定する方法について詳しく説明します。

示差メチル化の測定<em&gt; INS</em&gt;バイオマーカー膵島のβ細胞死などのヒト血清試料中のDNA種

The death of islet &#946; cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank ...

この手順の全体的な目的は、β細胞死のバイオマーカーとして、ヒト血清中のメチル化状態が異なるプレプロインスリンDNA種を測定することです。この手法は、1型糖尿病の発症過程における特定の時点においてβ細胞死が起こっているかなど、糖尿病分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、デジタルPCRを利用することで、ごく少量の血清からβ細胞死の量を決定できることです。テキストプロトコルに従ってヒト血液サンプルから血清を回収した後、マイクロ遠心チューブにサンプルあたり 200 µL の溶解バッファーと 1 µL の poly(A) を用意します。チューブを 15 秒間ボルテックスします。-80 °C のフリーザーから血清サンプルを取り出し、室温で解凍します。次に、PBSを用いて血清サンプルの液量を200 µLに調整します。プロテアーゼ20 µLと溶解バッファーpoly(A)mix 200 µLを添加し、サンプルを溶解させます。チューブを8秒間ボルテックスし、56 °Cで10分間インキュベートします。次に、チューブを最高速度で7秒間遠心分離します。サンプルに230 µLの100% ethanolを加えてDNAを沈殿させ、チューブを8秒間ボルテックスします。その後、チューブを最高速度で7秒間遠心分離します。次に、600 µLのサンプル混合液をスピンカラムに添加し、6000 ×gで1分間遠心分離します。ろ液を捨て、カラムを清潔なチューブに移します。500 µLの洗浄バッファー1をカラムに添加し、サンプルを6000 ×gで1分間遠心分離します。次に、フロースルーを捨て、カラムを清潔なチューブに移します。500 µLの洗浄バッファー2をカラムに加え、最高速度で3分間遠心分離します。その後、カラムを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、さらに1分間回転させます。DNAを溶出させるため、カラムを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、溶出バッファー60 µLをフィルターに直接加えます。室温で5分間インキュベートした後、サンプルを6000 ×gで1分間遠心分離します。カラムを廃棄し、重亜硫酸塩変換を行うまでサンプルを保存します。非メチル化シトシンをウラシルに変換するために、PCRチューブに入れた20 µLのDNAに、130 µLの重亜硫酸塩変換試薬を加えます。ピペッティングによりサンプルを20回混ぜ、チューブを短時間遠心し、側面や蓋に液滴が付着していないことを確認します。ここに示すように、ウォーターバスまたはサーマルサイクラーでサンプルをインキュベートします。カラムを付属の回収チューブにセットし、スピンカラムに600 µLの結合バッファーを加えます。ビスルフィート処理したDNAをカラムに適用し、ピペッティングで10回混ぜ合わせます。その後、最高速度で30秒間遠心分離し、ろ液を捨てます。次に、カラムに100 µLの洗浄バッファーを加え、30秒間遠心分離します。続いて、非メチル化シトシンのウラシルへの変換を完了させるためにスルフィン酸基を除去するため、カラムに200 µLの脱スルフィン化バッファーを加えます。サンプルを室温で20分間静置した後、カラムを30秒間遠心分離します。カラムに200 µLの洗浄バッファーを加え、30秒間遠心分離してDNAを洗浄します。その後、ろ液を捨て、洗浄ステップを繰り返します。カラムを1.5 mLマイクロ遠心チューブに設置し、カラムフィルターに10 µLの溶出バッファーを直接加えてDNAを溶出させます。サンプルを1分間インキュベートし、その後30秒間遠心分離してDNAを溶出させます。カラムを廃棄し、サンプルを保存してください。回収したDNA量を、吸収波長260 nmでの分光光度法により定量します。各サンプルおよびコントロールに十分な量のマスターミックスを作成します。少なくとも1つの水を含むサンプル、非メチル化インスリンを含むプラスミドのサンプル1つ、およびプラスミドを1:1で混合したサンプル1つを含めてください。まず、96ウェルプレートの各ウェルにマスターミックスを19.5 µLずつ加え、マルチプレックスPCR反応をセットアップします。2.5 µLの重亜硫酸塩変換済みDNAサンプルを適切なウェルに加えます。次に、ピペッティングを数回繰り返し、ウェル内のサンプルを混合します。アルミ箔とプレートシーラーでプレートを封止し、ウェルの側壁に液体が残らなくなるまでプレートスピナーで遠心分離します。タッチスクリーンで自動ドロップレットジェネレーターを設定するには、プレートのウェルにサンプルがロードされている行をタッチして、使用する行数を設定します。コンタミネーションを避けるため、消耗品は装置背面側の行にあるカートリッジから始めて、後ろから前に向かってロードしてください。次に、中央の行にチップをロードします。次に、96ウェルプレートを装置にセットします。続いて、-20 °Cのフリーザーからコールドブロックを取り出し、新しいスカート付き96ウェルプレートをそこに配置します。プレートを入れたブロックを、サンプルが入ったプレートの隣に装置へ挿入します。装置前にあるディスペンサーにオイルを加え、タッチスクリーンでオイルの種類を選択します。青色のStartボタンをタッチしてランを開始します。次に、プレートの設定を確認し、Start Runボタンをタッチして開始してください。ランが終了したら、新しく形成されたドロップレットを含む96ウェルプレートを取り出し、プレートシーラーを用いてアルミ箔で密封します。次に、以下のプログラムを用いてサーマルサイクラーでPCRを行います。プレートをドロップレットリーダーにセットし、「Setup」タブをクリックしてリーダーの設定を行ってください。次に、[Template New]をクリックして新しいテンプレートを開きます。ウェルエディターを使用して、各サンプルのパラメータを設定してください。各サンプルに固有の名前を付けます。実験設定を「Rare Event Detection」に設定し、マスターミックスに反応調製に使用したミックスを選択します。ターゲット1に「Unmethylated」などの名前を入力し、ターゲット1を「unknown（U）」に設定します。ターゲット2に「Methylated」などの名前を入力し、ターゲット2を「reference（R）」に設定します。「Run」タブをクリックしてランを開始し、ファイル名を入力します。次に、「Run Options」ウィンドウで検出化学を選択します。データを解析するには、「Analyze」タブで結果を開き、ポジティブコントロールに基づいた2Dプロットを使用して解析を行います。この図は、重亜硫酸塩変換済みの非メチル化インスリンDNA、メチル化インスリンDNA、およびこれら2つのプラスミドを1:1で混合したプラスミドコントロールに対応するドロップレットの2D散布図を示しています。このパネルでは、FAM陽性のドロップレットがVICチャンネル側へわずかにシフトしており、これがメチル化インスリンDNA用のプローブを示していることに注目してください。同様に、FAMチャネルにおいてVIC陽性ドロップレットに極めてわずかなシフトが見られ、これは非メチル化DNA用プローブがメチル化DNAと交叉反応していることを示しています。プライマーの直線性を実証するため、数桁にわたる範囲の2種類のプラスミド混合物をPCR反応に使用しました。ここに示されているように、一方のプラスミドの濃度を変化させても、もう一方のプラスミドが一定量存在する場合、直線的に検出することが可能です。この図では、新規発症の1型糖尿病患者4名からのサンプルと、1型糖尿病のない対照群4名のサンプルを解析しました。データは、既報の通り、1型糖尿病患者では対照群と比較して、非メチル化およびメチル化の両方のインスリンDNAレベルが上昇していることを示しています。この手法に習熟し、適切に実施すれば、30サンプルを8時間で処理することが可能です。この手順を実施する際は、すべてのステップにおいて汚染を避けることが重要です。この手法の開発後、糖尿病分野の研究者は、1型糖尿病の発症におけるバイオマーカーとして本手法を利用する道を切り拓きました。このビデオを視聴することで、ヒト血清中のセルフリーDNAにおける非メチル化およびメチル化preproinsulinを測定し、ベータ細胞死の量を決定する方法について十分に理解できるはずです。DNA抽出バッファーの使用は非常に危険であるため、本手順の実施中は、手袋や白衣の着用、および漂白剤を含む消毒剤の使用を避けるなどの予防措置を常に講じる必要があります。

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Research

JoVE Journal

Genetics

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示差メチル化の測定

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