Name: 高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学ぶ高スループットリアルタイムアッセイで細胞内細菌増殖阻害剤を同時に宿主細胞毒性と評価する方法。非破壊的検出により抗菌薬スクリーニングの効率化とスケーラビリティ向上に貢献します。

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この原稿で報告された研究では、コンテンツはもっぱら著者の責任であるJEKする賞の数R01AI099122下アレルギーや国立衛生研究所の国立感染症研究所によってサポートされていましたし、必ずしも国立研究所の公式見解を示すものではありません。健康。私たちは、ICCB-ロングウッドスクリーニング施設および/または国立スクリーニング研究室からのジェニファー・スミス、デヴィッド・ローベル、蘇チェンマイ、ダグ洪水、ショーン・ジョンストン、ジェニファーNale、スチュワートルドニツキ、ポール・ヤン、リチャード・シウ、そしてレイチェルウォーデンに感謝したいと思いますニューイングランド地域の生物兵器防衛エクセレンスのセンターと（U54AI057159でサポートされている）新興感染症のハイスループットスクリーニングアッセイの開発と性能での支援のため。また、原稿上で役に立つコメントのためにケネス・P.スミスに感謝したいと思います。

1.リアルタイム細胞内増殖および真核細胞毒性アッセイ<ol><li>準備宿主細胞（J774A.1細胞） <ol><li> 9％の鉄補充ウシ血清を含むRPMI 1640中で懸濁液中文化J774A.1 ハツカネズミマクロファージ様細胞。最初は組織培養フラスコ内の通路。細胞は培地15 ml中に75cm 2の組織培養フラスコ中でコンフルエントになった後、15mlを組織培養フラスコに戻し、50mlを転写された媒体の同じタイプ、65 mlに掻き希釈によって分割250ミリリットルの細菌振とうフラスコに。 </li><li> 250ミリリットルおよび/または組織培養培地との五分の一のボリュームに満たさ千ミリリットル細菌のフラスコ内で懸濁液中のスケールアップ、文化のため。毎分約120回転で回転速度を設定することにより、通気。一貫性のある成長のために、正確に5％CO 2、37℃でインキュベートします。 </li><li>彼らは範囲内の密度に達する収穫細胞2.5×10 6個の細胞/ 5×10 6細胞/ mlで。死細胞は、細胞傷害性アッセイにおけるバックグラウンドノイズを増加させるように（最も容易にトリパンブルー染色によってアッセイ）死細胞の割合は、25％を超えないことを確認してください。 </li><li>白色の組織培養処理したプレートで、384ウェルマイクロプレートウェルあたり30μlの組織培養培地中で5×10 4 J774A.1細胞において。実験の日に90％コンフルエンスを達成するためにマイクロプレートを一晩インキュベートします。 </li></ol></li><li>準備発光または蛍光レジオネラ・ニューモフィラ <ol><li>通路L.ニューモフィラ （LP02 :: flaA ::ルクス8）適当な培地、 すなわち 、バッファリング木炭酵母エキス（BCYE）培地上の細菌。チミジン栄養要求株を使用している場合は、100μg/ mlのチミジンで培地を補います。 （凍結ストックからの場合）コンフルエントを得るために、（前の板通路から場合）新しいBCYEプレート上に厚く生物を広げ、1日をインキュベートすることにより、実験のために、細菌のパッチを準備するか、2〜3日成長。 <ol><li> （2-アセトアミド）-2-アミノエタンスルホン酸、0.35グラムのK 2 HPO 4、および950ミリリットルの脱イオン水に1グラムの一塩基性カリウムαケトグルタル酸- 10グラムの酵母エキス、10gのNを溶解させることによりBCYEプレートを準備します。水酸化カリウム（11.9モル溶液の≥2.5ml）でpHを6.9に調整します。 </li><li> 15グラム寒天および2グラムの活性炭を追加します。そして1 L最終容量にもたらします。磁気攪拌棒、オートクレーブを追加します。クール55℃に培地および0.4グラムのL-システインを含有する濾過滅菌溶液を追加し、脱イオン水に溶解した0.42グラムのアンモニウム鉄（III）、クエン酸。ペトリ皿を注ぐ前に混合するために、磁石撹拌プレートを使用してください。 </li><li>無菌成長培地でのL.ニューモフィラの成長の試験のために、木炭や寒天を除いBCYEに使用されるすべての化学試薬を組み合わせることにより、ACES -酵母エキスブロス（AYE）を準備します。フィルタは、滅菌し、直ちに使用し、以降の実験のために凍結します。 </li></ol></li><li> SAで再懸濁生物必要に応じて100μg/ mlのチミジン補充とJ774A.1細胞に使用私組織培養培地。 </li></ol></li><li>マクロファージ感染<ol><li> （細菌の成長阻害および真核細胞溶解のためのスクリーニング化合物、ならびに陽性および陰性対照）関心のある試験化合物を加えます。好ましくは、車両の十分な希釈を可能にするために、DMSO（ジメチルスルホキシド）、または水溶液中≥500xで原液を溶解します。 <ol><li>ストック溶液を冷凍保存することができますが、不安定な化合物および抗菌剤のための凍結融解サイクルを避けます。 </li></ol></li><li>組織培養培地中に2.5×10 6 CFU（コロニー形成単位）/ mおよび蛍光レポーターで標識された細菌1.0×10 7 CFU / mlでの標的とし、適切な非毒性、膜非透過性、核酸-を追加するために、発光細菌を希釈2.5×最終アッセイ濃度で色素を結合。 </li><li>各J774A.1培養ウェルに混合物の20μl加え、最終アッセイ容量50μlの、最終細菌濃度1×10 6 CFU / mlの（ルクスオペロンレポーター）または4×10 10 6 CFU / mlの（蛍光タンパク質レポーター）。 </li><li>蒸発エッジ効果を防止するために、100％の相対湿度で5％CO 2で1〜3日間37℃でインキュベートします。 </li></ol></li><li>アッセイ読み出し<ol><li>使用されている記者に応じてマイクロプレートルミノメーターや蛍光光度計での細菌の増殖と真核生物の細胞毒性を読みます。 <ol><li>温度関連のエッジ効果を回避するために、熱的には約20分（または約10分間蓋をオフにした状態で生物学的安全キャビネット内）のための半開き蓋つきの実験台上の単一の層に配置することによって、従来の発光読書にマイクロ平衡化。 </li></ol></li><li>後の時点でのリアルタイム読み出しが所望される場合インキュベーターにマイクロ戻ります。 </li></ol></li></ol> 2.データ解析<ol><li>正と負の詐欺にデータを正規化しますントロールは、真核細胞のための細胞内細菌の増殖と細胞毒性パーセントのためのパーセントまたは倍-阻害を計算します。 </li><li> 、アッセイの堅牢性を評価= 1 Z-因子（Z &#39;）Z分析&#39;を用いて、細菌の増殖阻害および細胞毒性の両方に陽性と陰性対照の間に統計的な分離を計算するには- 3（σP +σn）は / |μ のp +μをn個 |。この式において、σp値とσnは、それぞれ、正および負の対照ウェルのための標準偏差です。 μpとμnが 、それぞれ、陽性および陰性対照ウェルの平均値です。 <ol><li>ハイスループットスクリーニングアッセイのために、目的の試験化合物の効果を評価するための標準的なZスコア（または他の代替的な、定量的な統計的尺度）を算出します。また、潜在的に生理的により関連性のような簡単な折りたたみ式の減少またはログ倍の減少を計算します<html>幾何学的に細菌を複製するための効果の大きさの尺度。 </li></ol></li></ol> 3.シングルおよびマルチ次元（ すなわち 、シナジー）用量反応試験およびデータ解釈<ol><li>プロトコルセクション1で説明したように、マクロファージや細菌を準備します。 </li><li>直前に感染または無菌のインキュベーションに、（ すなわち、最小発育阻止濃度またはMIC）とローにハイエンドにスパニングを目標に、希釈系列を倍増、シリアルに完全に成長を排除濃度を実験的興味のある抗菌剤を追加明らかな活性を示さない濃度を終了します。 </li><li>単一用量反応し、製造業者のプロトコルに従って抗菌希釈液を直接、自動化された添加により、セットアップをテストし、組み合わせの相乗効果を容易にするために、自動液体処理システムを使用してください。 </li><li>例えば、サブ倍加希釈物の使用を考慮し、841 / 54841eq1.jpg &quot;/&gt; - 倍希釈系列、および分析は、データの正確さと再現性を高めるために複製します。 </li><li>マクロファージ感染、組織培養培地中2.5×10 6 CFU（コロニー形成単位）/ mlに標的化するために、発光細菌を希釈します。各ウェルJ774A.1文化、最終アッセイ容量を50μl、最終細菌濃度1×10 6 CFU / mlに混合物の20μlのを追加します。 100％の相対湿度で5％CO 2中、37℃でインキュベートします。 <ol><li>無菌の増殖試験のために、AYE培地中1×10 6 CFU / mlの最終濃度になるように、発光細菌を希釈し、384ウェルプレートの各ウェルに50μlを添加し、5％CO 2中で37℃でインキュベート 相対湿度100％。 </li></ol></li><li>細菌の増殖を抑制する抗菌組み合わせについて、分別阻害剤濃度指数を計算します。細菌グラムの完全または&gt; 99％阻害をもたらす組み合わせで各薬物（A、B、···N）の場合rowth、（FIC、Bを、nは。。。）個々の端数阻害濃度を計算し、次のように：FIC =化合物の濃度&quot;」の最小限の阻害剤濃度で割っを&quot; &quot;それ自体で。 。そして、コンビナトリアルFIC指数を計算したりなど 、FIC bを計算し、同じ数式を使用して<img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/54841/54841eq2.jpg" /> FICは、FICのA + FIC Bは+を=。 。 .FIC nは、それぞれの阻害の組み合わせのために。 <ol><li>相乗効果を評価するために1.0から遠くに外れコンビナトリアルインデックスを使用してください。保守的な相乗効果の指標と≥4、アンタゴニスト作用として≤0.5のカットオフを考えてみましょう。 12 </li><li>プロットは、アイソボログラム等高線アイソボログラム、および/または等値面は、組み合わせの効果の6などの代替グラフィカルな表現をアイソボログラム。 </li></ol></li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

我々は、細胞内の細菌の増殖および宿主細胞の細胞毒性の同時検出のためのリアルタイムアッセイを記載します。プロトコルにおけるいくつかの重要なステップがあります。まず、堅牢なアッセイ性能のために、細菌や細胞毒性の読み出しとの間に十分なスペクトル分離が存在しなければなりません。このような分離は、ルシフェラーゼオペロンの記者や蛍光DNA結合色素の組み合わせのために固有のものです。しかし、私たちの経験（ 表1-3、 図2）、二重の使用に基づいて、蛍光読み出しは非重複蛍光シグナル（ 例えば 、遠赤色蛍光タンパク質レポーターと緑の核酸染色の使用は）堅牢取得するときに必要な、溶液ベースのデータ。また、潜在的に利用可能なリーダーの光学系または溶液の蛍光特性に関連する先行経験から、緑またはオレンジの発光を有する唯一のDNA染色はよりすなわち 、Z &#39;大きく、使用可能な細胞毒性データを与えた&gt; 0.5、STRONを示す指標グラムの分析性能。 4したがって 、溶液ベース、デュアル読み出しアッセイは幾分レポーターを使用すること...

細胞内区画に一時的に成長するか、存在する病原体が治療根絶することは困難です。義務または比較的ようなレジオネラ・ニューモフィラ 、Q熱リケッチア 、 ブルセラ属などの細胞内病原体を義務づけます。 、野兎病菌 、およびマイコバクテリウム属 。多くの場合、数ヶ月から数年もの範囲とすることができる治療法のための抗菌薬治療の長期のコースを必要とします。さらに、細胞外病原体は、一過性の細胞内ニッチを占め、このように抗菌薬治療の通常のコースによってクリアランスを逃れ、後に病原性感染症の新しいラウンドを開始するために出てくることがあります。 黄色ブドウ球菌 1及び尿路病原性腸内細菌2,3感染は2ますます認識の例です。したがって、基本的な薬物発見の目的は、細胞内コンパートメントに浸透新規な抗菌剤を同定することです。迅速に根絶するための最適な治療法細胞内の生物サブ抑制抗菌剤暴露による耐性の発生を防止するには、特に望ましいです。 この目的のために、我々は、モデル病原体、 レジオネラ・ニューモフィラの細胞内増殖を標的細胞内浸透抗菌剤を同定するためのハイスループットスクリーニング技術を開発しました。 4前臨床観察は、標準的な抗菌薬感受性試験は、正確にこの生物に対してインビボ治療効果が予測しなかったことを示しています。このようなβラクタムおよびアミノグリコシドなどの抗菌剤の主要なクラスは、無菌的に成長したレジオネラ菌に対して非常に有効であるが、十分にレジオネラ菌が存在する細胞内コンパートメント内に侵入しないため、 図5は、具体的には、これがありました。 5,6後で証拠は、技術的に、より複雑な細胞内増殖アッセイが効果的に臨床効果を予測することが示唆されました。 7 </sup&gt;残念ながら、これらのアッセイは、コロニー形成単位の計数のために、異なる時間点で、溶解する抗菌剤で処理された感染したマクロファージを、必要とする非常に面倒なエンドポイントアッセイは、ありました。このようなアッセイは、大規模に行うことは非現実的であり、高スループットの薬物発見のために不適当です。 したがって、我々は、細胞内細菌増殖のリアルタイム決意する技術を開発しました。 6これは、4または蛍光タンパク質9レポーター（ここで説明した第二世代、直交アッセイは、）は、細菌染色体に細菌ルシフェラーゼオペロン8（前述した第1世代のアッセイ）のいずれかの統合により改変された細菌株の使用を通じて達成されました。このように、発光または蛍光シグナルは、細菌数のサロゲート、リアルタイムの読み出しを提供します。 しかし、これらの属性は、細胞内infectioの主要な交絡因子に対応していません宿主細胞上のnアッセイ、オフターゲット効果。具体的には、宿主細胞の死は、本質的に細胞内増殖を制限し、抗菌効果の偽陽性の同定をもたらします。スクリーニングライブラリのように多くの化合物は、毒性の真核細胞であり、このような偽陽性は、解決のためのフォローアップ、エンドポイントの細胞毒性アッセイを大量に必要と、真の抗菌剤を圧倒だろう。 これにより、同時に、真核生物細胞の生存および細胞内増殖を評価できることが非常に重要でした。注目すべきことに、非生存真核細胞の特性は、細胞膜の完全性の喪失です。細胞膜の透過性を試験するプローブは、したがって、細胞の生存率を評価するために使用されてもよいです。我々は、以前にアクセスし、死細胞の核DNAを染色する推定細胞膜非透過性、蛍光DNA結合色素の一連の能力を特徴とします。 4核DNAを結合すると、これらの染料はquantuの大幅な増加を表示しますバックグラウンド溶液蛍光にわたって増加したシグナルが得られメートル蛍光収率。このように、これらの色素は、真核細胞死の定量的な読み出しを提供しました。 4は注目すべきことに、我々はいくつかは、J774マクロファージとの長時間の同時インキュベーションの間に自分自身に非毒性であることがわかりました。初期感染の間に添加された場合、それらは、マイクロプレート蛍光光度計により測定又は顕微鏡で観察することができる真核細胞死のリアルタイム蛍光読み出しが得られました。 従って、細菌のレポーターおよび非毒性、膜非透過性、DNA結合色素の使用を組み合わせることにより、我々は、同時に細菌負荷および真核細胞毒性の両方を測定するための簡単な、非破壊、リアルタイムアッセイを開発することができました。このアッセイは、私たちは〜250抗菌剤との細胞内増殖を阻害する能力のために機能的に特徴付けられていない活性を有する&gt;24万小分子を含む384ウェルプレートフォーマット〜万知られている生物活性物質にスクリーニングすることができましたレジオネラ・ニューモフィラ 、同時に、各化合物の真核細胞の細胞毒性データを生成します。 6 レジオネラ菌の細胞内増殖に対する既知の抗菌剤の我々の分析は、これまでのこのタイプの最も包括的な探査ました。 6 組み合わせて使用​​する我々のアッセイフォーマットの効率に基づいて、我々はまた、続いて既知の抗菌剤の潜在的な相乗効果を調査しました。最も一般的な相乗作用試験の一つ、いわゆるチェッカーボードアッセイは、標準的に二つ以上の抗菌剤の二倍連続希釈の組み合わせ効果を評価することによって行われます。二つ以上の抗菌剤を別々に適用各々の効果の和よりも一緒に適用されたときに、これらのアッセイでは、図10に示すように 、相乗効果は、より大きな効果を観察することにより定義されます。注目すべきは、これまで、唯一の集中と選択の相乗試験は、細胞内のレジオネラ・ニューモに対して行いました</em&gt;が必要な組合せの順列を乗じた伝統的なエンドポイントアッセイに関与して多大な努力のため。 相乗効果のテストを容易にするために、我々は、自動化されたデジタルディスペンシング技術6との組み合わせで、当社のリアルタイム細胞内増殖/真核生物の細胞毒性アッセイを利用しました。この自動化は、384ウェル形式でDMSO単独の水溶液で、または組み合わせ中に溶解した化合物の連続希釈液を分配するために、私たちを可能にしました。 11はまた、このような強固な液体処理技術は、簡単に、より高い解像度を実行するために私達を許可し、平方根-の-2（むしろ標準よりも、低い解像度、倍増）我々の2つの次元で特異性の高いレベルを達成するために希釈組み合わせを、チェッカーボード相乗効果分析。この解像度が2倍希釈系列12を使用した場合の再現性についてのシナジーフィールドの懸念に対処する上で特に有用でした。最後に、私たちのアッセイは、定量的ともTHERましたEFORE阻害の階調を測定しました。その結果、アッセイは、成長阻害の同様のレベルでのコンビナトリアル濃度を接続アイソコンターする等高線アイソボログラムで発現抑制情報の全体を、捕獲しました。 6このプロット戦略は組み合わせ用量反応曲線の可視化を可能にしました。我々の方法論を例示するために、我々は、これらのアッセイを実施するための我々のプロトコルを記述し、代表的な結果を示します。

<table><tbody><tr><td>J774A.1細胞</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB-67</td><td>Host cell</td></tr><tr><td>ACES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9758&nbsp;</td><td>緩衝炭酵母エキス寒天培地および緩衝酵母エキス培地を作るため</td></tr><tr><td>酵母抽出物、限外ろ過</td><td>ベクトン・ディキンソン/ディフコ</td><td>210929</td><td>緩衝炭酵母抽出物寒天および緩衝酵母抽出培地を作るため。低グレードは成長障害を引き起こし、および/または成長阻害剤に対するレジオネラ菌の感受性を変える可能性があります</td></tr><tr><td>アルファ-ケトグルタル酸、モノカリウム塩</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>K2000</td><td>緩衝炭酵母エキス寒天および緩衝酵母エキス培地を作るため</td></tr> ピル<tr><td>ビン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>緩衝炭酵母抽出物寒天および緩衝酵母抽出培地</td></tr><tr><td>リン酸カリウム、二塩基性</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P288-500</td><td>緩衝炭酵母抽出物寒天および緩衝酵母抽出培地</td></tr><tr><td>L-システイン</td><td></td><td>C-7755</td><td>緩衝炭酵母抽出物寒天および緩衝酵母抽出培地</td></tr><tr><td>の製造用クエン酸アンモニウム鉄(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879</td><td>緩衝炭酵母抽出物寒天および緩衝酵母抽出培地を作るため; ピロリン酸第二鉄を代わりに使用することができるが、正確に計量することはより困難である</td></tr><tr><td>水酸化カリウム溶液、濃縮</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SP236-500</td><td>緩衝炭酵母抽出物寒天および緩衝酵母抽出媒体</td></tr><tr><td>脱イオン水</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>緩衝炭酵母エキス寒天培地および緩衝酵母エキス培地を作るため</td></tr><tr><td>チミジン(組織培養グレード)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>RPMI 1640と緩衝酵母抽出物寒天培地の両方を補充するため、後者には低グレードのチミジンを使用できますが、RPMI 1640 RPMI 1640では細胞増殖の障害および/または細胞死を引き起こす可能性があります</td></tr>。<tr><td>標準製剤</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10-040-CV</td><td>プレーティング前にJ774A.1細胞を増殖させるため、2 mM L-グルタミンを含む</td></tr><tr><td>RPMI 1640はフェノールレッドを欠</td>いています <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-105-CV</td>経由 <td>J774A.1細胞を384ウェルディッシュにプレーティングするため(プレーティング前の成長には適していません);また、L-グルタミンを欠いています。使用前に2 mMにL</td></tr><tr><td>-グルタミンを補給し、0.85% NaCl (組織培養グレード)で200 mM</td>を補充しますサー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SH30034.02</td><td>L-グルタミンを欠くRPMI 1640を補充するため、 最終濃度 2 mM まで</td></tr><tr><td>鉄添加子牛血清</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-510</td><td>RPMI 1640 を添加するため、最終濃度 9.1% まで</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>J774A.1 細胞死測定のための染色用細胞密度をカウントしながら</td></tr><tr><td>SYTOX Green、DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td> <td>の 5 mM 溶液蛍光読み取りまたは落射蛍光顕微鏡法によるJ774A.1細胞死測定のための染色用(オレンジレッドまたは遠赤色蛍光細菌と併用)。最終濃度125 nMで使用してください。</td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-255-26</td><td>J774A.1細胞のインキュベーション用(感染前と感染後の両方)に、細菌のインキュベーションにも使用することも、代わりに標準雰囲気インキュベーターを使用することもできます)</td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-01010</td><td>感染前のJ774A.1細胞の振とうインキュベーション用、細胞培養インキュベーター内に収まる、シェーカーベース 7744-01000 とトレイ 7740-01010 (これらは別売り)</td></tr>シェー<tr><td>カーフラスコ (250 ml)シェーカーフラスコ (250 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-04</td><td>感染前のJ774A.1細胞の振とうインキュベーション用</td></tr> フラ<tr><td>スコ用シェーカークランプ (250 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16250</td><td>感染前のJ774A.1細胞の振</td></tr>とうインキュベーション用 <tr><td>シェーカーフラスコ (1,000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-07</td><td>感染前のJ774A.1細胞の振とうインキュベーション用</td></tr> フラ<tr><td>スコ用シェーカークランプ (1,000 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16100</td><td>感染前のJ774A.1細胞の振とうインキュベーション用</td></tr> フラ<tr><td>スコ用スポンジフォームキャップ (250 ml-1,000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-1490-038</td><td>感染前のJ774A.1細胞の振とうインキュベーション用、標準的な金属キャップと比較して汚染のリスクを低減</td></tr><tr><td>MultiDrop Combi プログラマブルマルチチャンネル蠕動ポンプ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>5840300</td><td>J774A.1細胞、培地、および蛍光色素を含む細菌懸濁液を多数の384ウェルディッシュに分注</td></tr>するため <tr><td>コンビ標準ボアマニホールド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>24072670</td><td>デフォルトのプリディスペンス量は20&#956です。l はセトリング &mdash を補償するには不十分です。80 &#956に増加します。l</td></tr><tr><td>ホワイト 384 ウェルディッシュ 組織培養用に処理</td><td>コーニング</td><td>3570</td><td>発光および蛍光を読み取るため。Greinerカタログ#781080は、</td></tr><tr><td>DMSO(組織培養グレード、密封されたアンプル)も正常にテストしましたDMSO(組織培養グレード、密封されたアンプル)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>ポジティブコントロールおよびテスト化合物を溶解するための</td></tr><tr><td>アジスロマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1088</td><td>抗生物質ポジティブコントロール</td></tr><tr><td>サポニン(Quillaja樹皮から)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4521</td><td>Cytoxicityポジティブコントロール</td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペットー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td>フィン<td>ピペット</td><td>定量のポジティブコントロール化合物の移送用; ピペットは、反復固定容量分注を可能にするために、ディテント付きデジタル分注が必要です</td></tr><tr><td>エプソンピン転送ロボット</td><td>エプソン/ICCB-L</td><td>(カスタム機器)</td><td>ライブラリアレイから一定量の試験化合物を移送するため</td></tr><tr><td>D300 デジタル分注システム</td><td>ヒューレットパッカード Tecan</td><td>D300</td> <td>経由11ピコリットルから10マイクロまでの範囲の試験化合物の可変量の移送用;l</td></tr><tr><td>D300デジタルディスペンシングシステム用T8+カートリッジ</td><td>Hewlett-Packard via Tecan</td><td>T8+</td><td>ディスペンシングテスト化合物</td></tr><tr><td>コンピュータ接続デジタルカメラ付き落射蛍光顕微鏡</td> ニ<td>コン</td><td>Ti</td><td>生細胞イメージング用。標準的な蛍光顕微鏡は、位相差またはDIC光学系で、緑(フルオレセイン)、オレンジレッドからレッド(テキサスレッド)、遠赤色(Cy5)の蛍光を100倍オイルでイメージングすることができます最高解像度の対物レンズ</td></tr><tr><td>ガラス底組織培養皿</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>生細胞イメージング用。MatTekなどのディッシュは、逆脱射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、600倍または1,000倍の倍率で顕微鏡で視覚化できます。&nbsp;これらの特定の皿は、公称直径3.5cm、内径3.3cmで、底部に直径20mmの#1.5厚さのカバースリップが挿入されています。</td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td>、<td>Adobe</td><td></td><td>Photoshop、または同様のプログラムを使用して、光、顕微鏡、蛍光の画像を疑似カラー化およびマージできます。</td></tr><tr><td>Mathematica 10</td><td>Wolfam</td><td></td><td>2次元等高線アイソボログラムと3次元表面アイソボログラムの生成用。</td></tr></tbody></table>

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

細胞内の抗菌活性および真核細胞の細胞毒性の伝統的な対策は、エンドポイントアッセイに依存しています。このようなエンドポイントアッセイは、細胞溶解、コロニー形成単位の決意、または試薬の添加等の読み出しに先立って、いくつかの追加の実験工程を必要とします。アッセイの数千を行う場合、例えば、ハイスループットスクリーニング中に、アッセイのこれらのタイプのために必要な下流の労力が大きいです。したがって、ハイスループット抗菌発見を容易にするために、我々は、同時に細胞内の細菌増殖の阻害剤を同定し、真核細胞の細胞毒性を評価するためのリアルタイムアッセイを開発しました。具体的には、リアルタイム細胞内細菌増殖の検出は、細菌ルクスオペロン（ 第 1 世代アッセイ）または蛍光タンパク質レポーター（ 第 2 世代 、直交アッセイ）のいずれかで、細菌のスクリーニング株をマークすることで有効になっていました。非毒性、細胞膜非透過性、核酸結合色素また、マクロファージの初期感染時に追加されました。これらの色素は、生細胞から除外されます。しかし、非生存宿主細胞は、エントリと核DNA（デオキシリボ核酸）の蛍光標識を可能にする膜の完全性を失います。注目すべきことに、DNA結合は、宿主細胞死の溶液ベースの読み出しを提供する蛍光量子収率の大幅な増加と関連しています。我々は、マイクロプレート形式でハイスループットスクリーニングを実行するために、そして顕微鏡により細胞内増殖および細胞毒性を評価するために、この組み合わせアッセイを使用しています。注目すべきことに、抗菌剤は、一緒に適用二つ以上の抗菌剤の相乗効果は、別々に適用した場合よりも大きくなっている相乗効果を発揮することができます。異なる濃度の抗生物質の組み合わせの順列が評価されなければならないような細胞内病原体に対するin vitroでの相乗効果のためにテストすることは、通常、驚異的な作業です。しかし、私たちは、リアルタイムアッセイは自動化され、デジタルディスペンシング技術pで組み合わせることがわかりました容易な相乗効果のテストをermitted。これらのアプローチを使用して、我々は体系的に細胞内病原体、 レジオネラ・ニューモフィラに対してだけでは抗菌剤の多数のアクションと組み合わせてを調査することができました。

マイクロプレートの細胞内増殖アッセイ 図1は、アッセイ工程をダイアグラム。示さ自動化の手順を手動で実行することができます。しかし、スループットが大幅に液体ハンドリングシステムを使用して促進されます。 図2は、384ウェルマイクロプレート、デュアル読み出し、リアルタイム細胞内増殖および（LP02）はどちらかルクスオペロン（ 図2A、2B）またはmNeptune2蛍光タンパク質でマークされたレジオネラ株を（使用して、真核細胞の細胞毒性アッセイからの代表的な結果を示しています図2C、2D）レポーター。正および負の対照化...

(1)細胞内細菌性病原体を標的とする真核生物の細胞浸透性抗菌薬を同時に同定し、(2)真核生物の細胞毒性を評価するために、ハイスループットのリアルタイムアッセイが開発されました。その後、同じ技術のバリエーションをデジタル分注技術と組み合わせて、簡便で高解像度の用量反応、および 2 次元および 3 次元の相乗効果研究を可能にしました。

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

本プロトコルの目的は、単一の複合リアルタイムアッセイを用いて、宿主細胞に毒性を示さず、細胞内細菌の増殖を特異的に抑制する低分子阻害剤を同定することです。この手法は、抗微生物薬探索分野における重要な課題、具体的には、どのような種類の化合物が宿主細胞に害を与えることなく細胞内コンパートメントに浸透し、病原体を死滅させることができるかという疑問への回答に寄与します。本手法の主な利点は、非破壊的なリアルタイムアッセイを用いて、細菌の増殖と哺乳類細胞への毒性を同時に検出できることです。一般的に、この手法を初めて用いる方は、本手法が可能にするスケーラビリティへの対応に苦慮することになります。1回のセッションで1万個以上の化合物をアッセイするには、全く別の技術と設備が必要となります。Luciusに加え、学術的な抗菌剤探索およびトランスレーショナル診断微生物学への共同的な取り組みを実証しているのは、ポストドクター研究員のKP Smith、Yoon-Suk Kang、Jennifer Tsang、Thea Brennan-Krohn、および学部生のKat Truelsonである。ホスト細胞を準備するため、J774A. 1マクロファージを、9%鉄添加ウシ胎児血清を含むRPMI 1640で浮遊培養する。最初は、組織培養フラスコ内で細胞を継代します。75 cm²の組織培養フラスコにおいて、15 mLの培地で細胞がコンフルエントになった後、スクレイピングによって細胞を剥離させ、同種類の培地を用いて65 mLに希釈して分割します。そのうち15 mLを組織培養フラスコに戻し、50 mLを250 mLの細菌用シェーカーフラスコに移します。回転数を約120 rpmに設定して通気させます。安定した増殖を得るため、5%の二酸化炭素および37 °Cで培養します。細胞密度が2.5 × 10⁶ cells/mLから5 × 10⁶ cells/mLの範囲に達した時に、細胞を回収します。死細胞の割合が25%を超えないようにしてください。死細胞は細胞毒性アッセイにおいてバックグラウンドノイズを増大させます。リキッドハンドラーを用いてマクロファージや細菌を大量に分注する際は、リザーバー内での細胞の沈降を防ぐことが極めて重要です。分注中は数分ごとにリザーバーを撹拌し、不均一性やアッセイプレートのウェルへの影響を回避してください。白色の組織培養処理済み384ウェルマイクロプレートに、1ウェルあたり30 µLの組織培養培地を用いて50,000個の細胞を播種します。実験当日にコンフルエンスが90%に達するように、マイクロプレートを一晩インキュベートします。新しいBCYEプレートに菌体を厚く塗布し、1日間インキュベートしてコンフルエントな増殖を得ることで、実験用の細菌パッチを準備します。J774A.1細胞に使用したもの

high-throughput-real-time-dual-readout-testing-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、腫瘍標的細胞とインキュベートした場合、T細胞の細胞傷害活性を測定するための単一セルハイスループットアッセイが記載されている。この方法では、空間的に定義された比率で、T細胞と標的細胞を閉じ込めるために、サブナノリットルウェル（〜100,000ウェル/配列）の高密度、エラストマー配列を採用しており、エフェクター -...

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マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性<em&gt;結核菌</em

多くの場合、培養細胞上の化合物のセットの潜在的な細胞毒性を評価する必要があります。ここでは、96ウェル形式で有毒化合物を確実にスクリーニングする戦略について説明する。...

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マイトカン細胞毒性の正確な決定のための自動差動核染色アッセイ

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潜在的な抗結核候補の同定:哺乳類細胞における合成、MIC決定、細胞傷害評価のステップバイステップガイド

学ぶ高スループットリアルタイムアッセイで細胞内細菌増殖阻害剤を同時に宿主細胞毒性と評価する方法。非破壊的検出により抗菌薬スクリーニングの効率化とスケーラビリティ向上に貢献します。

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

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