高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

このプロトコルの全体的な目標は、単一の組み合わせリアルタイムアッセイを使用して、宿主細胞に対して無毒の細胞内細菌増殖の特定の小分子阻害剤を特定することです。この方法は、抗菌薬創薬分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。具体的には、どのような化合物が細胞内コンパートメントに侵入し、宿主細胞を傷つけずに病原体を死滅させることができるのでしょうか?

この技術の主な利点は、細菌増殖性哺乳類細胞の毒性が非破壊のリアルタイムアッセイを使用して同時に検出されることです。一般に、この方法に不慣れな個人は、この方法が提供するスケーラビリティに苦労します。セッションで1万を超える化合物を評価するには、まったく新しい一連の技術と機器が必要です。

Luciusに加えて、学術的な抗菌薬の発見とトランスレーショナル診断微生物学への共同の取り組みを示しているのは、ポスドク研究員のKP Smith氏、Yoon-Suk Kang氏、Jennifer Tsang氏、Thea Brennan-Krohn氏、学部生のKat Truelson氏です。宿主細胞を調製するために、J774Aを培養します。1 つのマクロファージが RPMI 1640 に懸濁液中で、9% の鉄がウシ血清を添加しています。

最初に組織培養フラスコで細胞を継代します。15ミリリットルの培地で75平方センチメートルの組織培養フラスコで細胞がコンフルエントになったら、同じ種類の培地で細胞を掻き取り、65ミリリットルに希釈して細胞を分割します。15ミリリットルを組織培養フラスコに戻し、50ミリリットルを250ミリリットルのバクテリアシェーカーフラスコに移します。

回転数を毎分約120回転に設定して曝気します。一貫した成長のためには、ちょうど5%の二酸化炭素と37°Cでインキュベートします。細胞がミリリットルあたり200万個から500万個の細胞/ミリリットルの範囲の密度に達したときに細胞を採取します。

死細胞は細胞毒性アッセイのバックグラウンドノイズを増加させるため、死細胞の割合が25%を超えないようにしてください。リキッドハンドラーで大量のマクロファージやバクテリアを分注する際には、細胞がリザーバーに沈殿するのを防ぐことが重要です。分注中は数分ごとにリザーバーを渦巻き、不均一性やアッセイプレートウェルを回避します。

処理された白組織培養で細胞をプレート化し、ウェルあたり30マイクロリットルの組織培養培地に50, 000個の細胞で384ウェルマイクロプレートを充填します。マイクロプレートを一晩インキュベートして、実験当日に90%のコンフルエントを達成します。新しいBCYEプレート上に生物を厚く広げ、1日インキュベートしてコンフルエント成長を得ることにより、実験用の細菌のパッチを準備します。

J774A.1細胞に使用したのと同じ組織培養培地に生物を再懸濁します。マクロファージ感染を行うには、スクリーニング化合物を含む目的の試験化合物、および真核細胞溶解における細菌増殖阻害のポジティブコントロールとネガティブコントロールを追加します。

ストック溶液は、車両を十分に希釈できるように、DMSOまたは水溶液に500倍以上で溶解する必要があります。組織培養培地中の発光細菌をミリレターあたり2ポイント500万CFUの目標に希釈します。次に、適切な非毒性膜不透過性核酸検出色素を、最終アッセイ濃度の5倍で2点添加します。

この混合物の20マイクロリットルを各培養ウェルに加えます。最終的なアッセイ容量は50マイクロリットルで、最終的な細菌濃度は、ルクスエプロンレポーターの場合は1ミリリットルあたり100万CFU、蛍光タンパク質レポーターの場合は1ミリリットルあたり400万CFUである必要があります。37°Cで1〜3日間、5%の二酸化炭素、100%の相対湿度でインキュベートし、蒸発エッジ効果を防ぎます。

アッセイ結果を読み取る際の温度に伴うエッジ効果を避けるために、発光読み取りの前にマイクロプレートを熱平衡化し、蓋を半開きにしてラボベンチに単層で約20分間置きます。細菌の増殖と真核細胞の毒性を、使用しているレポーターに応じて、マイクロプレートルミノメーターとフロロメーターで読み取ります。後の時点でのリアルタイムな読み出しが必要な場合は、マイクロプレートをインキュベーターに戻してください。

テキストプロトコルで説明されているようにデータを分析します。用量反応およびシナジー試験実験のために、以前と同様に細菌にマクロファージを調製します。マクロファージ感染または無菌インキュベーションの直前に、自動リキッドハンドリングシステムを使用して、メーカーのプロトコルに従って抗菌希釈液を直接自動添加することにより設定されたコンビナトリアルシナジー試験での単回投与反応を促進します。

実験で関心のある抗菌剤を連続倍増希釈シリーズに添加します。目標は、ハイエンドでは成長を完全に排除する濃度、ローエンドでは明らかな活動を示さない濃度にまたがることです。ここに示されているのは、細菌の発光および細胞毒性に関連する蛍光の経時的な代表的な結果です。

抗菌処理と真核細胞細胞の細胞毒性洗剤の対照的な効果に注意してください。同じスクリーニングウェルでのデュアルIC50およびCC50用量反応測定を使用して、抗生物質ドキシサイクリンの選択性を決定しました。細菌の複製は、中濃度の抗生物質によって阻害されました。

しかし、細胞毒性は、約100の選択性と一致する高濃度で観察されました。同じアッセイフォーマットを使用して、ミノサイクリンとアジスロマイシンの組み合わせの2次元用量反応をテストしました。アイソコンターは、細胞内増殖阻害が等しい点を接続します。

ここでは、凹面の等高線が2つの薬剤の強い相乗効果を示唆しています。アッセイセットアップ、リアルタイム読み出し、ハイスループットフォーマットのためのデジタルディスペンシングロボティクスにより、組み合わせトリプルシナジーテストが可能になりました。ここでは、はっきりとした凹面を観察すると、ミノサイクリン、アジスロマイシン、およびリファンピンの組み合わせがレジオネラ・フェウモフィラの細胞内増殖に対して高い相乗効果を発揮することが示唆されています。

このビデオを見れば、蛍光アッセイまたは発光アッセイの読み出しと、ハイスループットアッセイフォーマットでのリアルタイムの細胞毒性試験を組み合わせる方法について十分に理解できるはずです。この手順に続いて、共焦点顕微鏡のような他の方法を適用することができ、全細胞の生物学的事象に関する質問に答えることができます。レジオネラ菌の複製への影響については研究しましたが、ブルセラ菌などの他の細胞内病原体や微生物にも同じ手法を適用できます。

私たちが最初にこのプロトコルを考案したのは、非常にハイスループットなスクリーニングフォーマットで使用できるほどシンプルで信頼性の高いアッセイを見つけ出そうとしたときでした。細菌性病原体、細胞株、およびロボット機器の取り扱いにはいくつかの固有のリスクがあり、この手順を実行する際には適切な個人用保護具を使用するなど、適切な予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。