脳血管内皮細胞での生体エネルギー機能の評価

この手順の全体的な目標は、ミトコンドリア機能の変化が神経障害の発症にどのように影響するかを評価し、血液脳関門の開口部に直接影響を与える治療法を設計することです。この方法は、脳卒中後の神経細胞死をどのように最小限に抑えることができるかなど、神経疾患の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、無傷の細胞全体のミトコンドリア機能をリアルタイムで評価できることです。

完全な培地で脳血管内皮細胞を増殖させた後、摂氏37度、二酸化炭素5%、80%の密度で、T75センチメートル四方の組織培養フラスコで、細胞培養培地を廃棄し、細胞をトリプシンEDTAですすいでください。次に、フラスコに1〜2ミリリットルの新鮮なトリプシンEDTAを加え、細胞を摂氏37度で3〜5分間分離します。倒立顕微鏡で細胞が浮き上がったことを確認した後、10ミリリットルの新鮮な完全細胞培地を穏やかに添加して反応を停止し、細胞を15ミリリットルの円錐管に移して遠心分離します。

上清を捨て、ペレットを10ミリリットルの新鮮な完全増殖培地で洗浄して、別の遠心分離を行います。次いで、ペレットを完全増殖培地中に、1ミリリットルあたり5番目の細胞濃度の2倍で再懸濁し、継代培養する。適切な数の継代培養を行った後、ウェルあたり80マイクロリットルの完全な培地で1.6倍10から4番目の細胞に播種し、96ウェルの細胞外フラックス細胞培養プレートに播種し、プレートを5%の二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターに置きます。

細胞がプレートに付着したら、目的の処理を適切なウェルに追加し、細胞をインキュベーターに戻します。ミトコンドリア機能評価アッセイの前日に、細胞外フラックスセンサーカートリッジに150マイクロリットルの細胞外フラックスキャリブラント溶液を水和させ、プレートを二酸化炭素なしで摂氏37度で一晩インキュベートします。翌朝、プレートウォッシャーステーションを使用して、細胞培養培地をpH 7.0の細胞外フラックスアッセイ培地に交換します。

次に、細胞を摂氏37度で、二酸化炭素なしで30〜60分間インキュベートします。細胞が平衡化したら、水和したカートリッジをBioanalyzerにロードし、Startボタンをクリックしてキャリブレーションを開始します。キャリブレーションの最後に、「Unlock Cartridge」プロンプトをクリックして、カートリッジの底板を取り外し、セルプレートをロードします。

次に、データファイルを開いて、Bioanalyzerからレート値を取得し、スプレッドシートファイルにエクスポートします。応答の速度論および相対強度が、異なる脳血管内皮細胞タイプ間で異なることを考えると、これらの実験では、一連の濃度のbBend。3細胞を使用して、代謝プロファイリングアッセイで酸素消費率レベルを測定するための最適な細胞数を特定しました。

観察されたように、基礎呼吸と最大呼吸、および予備呼吸能力は、細胞密度に比例した応答を示します。しかし、ウェルあたりの細胞濃度が最も高い場合、ATP産生は減少するため、過度にコンフルエントな細胞培養は実験に適していないことが示唆されています。最適な細胞密度は、ウェルあたりの細胞数の中央範囲で発生するようです。

したがって、この代表的な実験では、中程度の細胞濃度を使用して予想される酸素消費率レベルを評価し、非コード前駆体mRNA分子が脳血管内皮細胞のミトコンドリア機能を低下させることを示しました。これらの実験はまた、トランスフェクション後24時間でこれらの分子が脳血管内皮細胞で過剰発現することにより、基礎呼吸、ATP産生、およびプロトン漏出に大きな変化が見られないにもかかわらず、最大呼吸と予備容量が大幅に減少することを示しています。一度習得すれば、このテクニックは2日で完了することができます。

細胞のプレーティングからミトコンドリア機能へのアクセスまで、それが適切に実行されている場合。この手順を試みる際には、他の手順を開始する前に、最適な細胞密度を決定することが非常に重要であることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、細胞生存率の低下や他の代謝経路の変化によりミトコンドリア機能に生じる変化について、細胞生存率や解糖アッセイなどの他の方法を実行することができます。

この技術の開発後、この技術は、単離されたミトコンドリアの内部や、神経疾患、癌、代謝障害などのさまざまな疾患に無傷の細胞を使用するミトコンドリア機能分野の研究者への道を開きました。このビデオを見れば、脳血管内皮細胞のミトコンドリア機能にアクセスする方法についてよく理解できるはずです。