脳血管内皮細胞での生体エネルギー機能の評価
November 19th, 2016
内皮細胞のミトコンドリアは、血液脳関門の完全性を維持するために重要です。私たちは、脳血管内皮細胞に生体エネルギー機能を測定するためのプロトコルを紹介します。
この手順の全体的な目標は、ミトコンドリア機能の変化が神経障害の発症にどのように影響するかを評価し、血液脳関門の開口部に直接影響を与える治療法を設計することです。この方法は、脳卒中後の神経細胞死をどのように最小限に抑えることができるかなど、神経疾患の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、無傷の細胞全体のミトコンドリア機能をリアルタイムで評価できることです。
完全な培地で脳血管内皮細胞を増殖させた後、摂氏37度、二酸化炭素5%、80%の密度で、T75センチメートル四方の組織培養フラスコで、細胞培養培地を廃棄し、細胞をトリプシンEDTAですすいでください。次に、フラスコに1〜2ミリリットルの新鮮なトリプシンEDTAを加え、細胞を摂氏37度で3〜5分間分離します。倒立顕微鏡で細胞が浮き上がったことを確認した後、10ミリリットルの新鮮な完全細胞培地を穏やかに添加して反応を停止し、細胞を15ミリリットルの円錐管に移して遠心分離します。
上清を捨て、ペレットを10ミリリットルの新鮮な完全増殖培地で洗浄して、別の遠心分離を行います。次いで、ペレットを完全増殖培地中に、1ミリリットルあたり5番目の細胞濃度の2倍で再懸濁し、継代培養する。適切な数の継代培養を行った後、ウェルあたり80マイクロリットルの完全な培地で1.6倍10から4番目の細胞に播種し、96ウェルの細胞外フラックス細胞培養プレートに播種し、プレートを5%の二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターに置きます。
細胞がプレートに付着したら、目的の処理を適切なウェルに追加し、細胞をインキュベーターに戻します。ミトコンドリア機能評価アッセイの前日に、細胞外フラックスセンサーカートリッジに150マイクロリットルの細胞外フラックスキャリブラント溶液を水和させ、プレートを二酸化炭素なしで摂氏37度で一晩インキュベートします。翌朝、プレートウォッシャーステーションを使用して、細胞培養培地をpH 7.0の細胞外フラックスアッセイ培地に交換します。
次に、細胞を摂氏37度で、二酸化炭素なしで30〜60分間インキュベートします。細胞が平衡化したら、水和したカートリッジをBioanalyzerにロードし、Startボタンをクリックしてキャリブレーションを開始します。キャリブレーションの最後に、「Unlock Cartridge」プロンプトをクリックして、カートリッジの底板を取り外し、セルプレートをロードします。
次に、データファイルを開いて、Bioanalyzerからレート値を取得し、スプレッドシートファイルにエクスポートします。応答の速度論および相対強度が、異なる脳血管内皮細胞タイプ間で異なることを考えると、これらの実験では、一連の濃度のbBend。3細胞を使用して、代謝プロファイリングアッセイで酸素消費率レベルを測定するための最適な細胞数を特定しました。
観察されたように、基礎呼吸と最大呼吸、および予備呼吸能力は、細胞密度に比例した応答を示します。しかし、ウェルあたりの細胞濃度が最も高い場合、ATP産生は減少するため、過度にコンフルエントな細胞培養は実験に適していないことが示唆されています。最適な細胞密度は、ウェルあたりの細胞数の中央範囲で発生するようです。
したがって、この代表的な実験では、中程度の細胞濃度を使用して予想される酸素消費率レベルを評価し、非コード前駆体mRNA分子が脳血管内皮細胞のミトコンドリア機能を低下させることを示しました。これらの実験はまた、トランスフェクション後24時間でこれらの分子が脳血管内皮細胞で過剰発現することにより、基礎呼吸、ATP産生、およびプロトン漏出に大きな変化が見られないにもかかわらず、最大呼吸と予備容量が大幅に減少することを示しています。一度習得すれば、このテクニックは2日で完了することができます。
細胞のプレーティングからミトコンドリア機能へのアクセスまで、それが適切に実行されている場合。この手順を試みる際には、他の手順を開始する前に、最適な細胞密度を決定することが非常に重要であることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、細胞生存率の低下や他の代謝経路の変化によりミトコンドリア機能に生じる変化について、細胞生存率や解糖アッセイなどの他の方法を実行することができます。
この技術の開発後、この技術は、単離されたミトコンドリアの内部や、神経疾患、癌、代謝障害などのさまざまな疾患に無傷の細胞を使用するミトコンドリア機能分野の研究者への道を開きました。このビデオを見れば、脳血管内皮細胞のミトコンドリア機能にアクセスする方法についてよく理解できるはずです。
概要
この記事は、血液脳関門の完全性を維持するために重要な脳血管内皮細胞のミトコンドリア機能を評価するためのプロトコルを提示します。この方法は、ミトコンドリアの変化が神経学的障害にどのように寄与するかを理解することを目的としています。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 生体エネルギー学
背景
- ミトコンドリア機能は内皮細胞の健康にとって重要です。
- ミトコンドリア活動の変化は神経学的障害につながる可能性があります。
- これらのメカニズムを理解することで治療戦略に役立ちます。
- 正確な測定にはリアルタイム評価技術が不可欠です。
研究の目的
- ミトコンドリア機能が血液脳関門の完全性にどのように影響するかを評価すること。
- ミトコンドリア機能を標的とする治療薬を開発すること。
- 脳卒中などの神経学的事象後の神経細胞死を最小限に抑えること。
使用された方法
- 完全培地で脳血管内皮細胞を培養します。
- 細胞剥離と遠心分離のためにトリプシンEDTAを使用します。
- 細胞外フラックスアナライザーを使用してミトコンドリア機能を評価します。
- 正確な酸素消費速度測定のための最適な細胞密度を決定します。
主な結果
- 最適な細胞密度で信頼性の高いミトコンドリア機能評価が得られます。
- 非コーディング前駆体mRNA分子がミトコンドリア機能に悪影響を与えます。
- 特定の分子の過剰発現により、最大呼吸数と予備能力が低下します。
- 特定の条件下では、基礎呼吸とATP生産は安定を保ちます。
結論
- この技術により、完全な細胞でのミトコンドリア機能の研究が可能になります。
- 神経学的障害を含む様々な疾患に適用できます。
- 将来の研究では、ミトコンドリア機能と細胞生存率の関係を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of mitochondrial function in cerebral vascular endothelial cells enables early de-risking of blood-brain barrier (BBB) integrity mechanisms in neurological disease models. Real-time bioenergetic profiling supports predictive confidence in target validation and informs therapeutic strategies aimed at modulating BBB permeability. This capability is critical for portfolio decisions in neurovascular and CNS drug discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial contributions to BBB stability and neurological disease mechanisms.
- Supports functional target validation by quantifying ATP production, maximal respiration, and spare capacity in intact cells.
- Facilitates mechanistic de-risking of candidate targets affecting endothelial bioenergetics.
- Provides predictive confidence for advancing BBB-modulating therapeutics.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible mitochondrial stress assays for compound screening in CVE cells.
- Optimizes cell density and assay conditions to ensure quantitative, scalable outputs.
- Enables detection of direct mitochondrial effects from novel therapeutics or genetic perturbations.
- Prepares validated biological systems for downstream screening and lead identification workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro mitochondrial function data with disease-relevant BBB models for translational continuity.
- Supports preclinical evaluation of BBB-targeted interventions by quantifying bioenergetic endpoints.
- Facilitates risk-adjusted advancement of candidates with demonstrated impact on endothelial metabolism.
- Enables mechanistic linkage between molecular perturbations and functional BBB outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This mitochondrial function assay positions within early discovery through preclinical validation, bridging target validation, screening, and translational research for neurovascular programs.
- Discovery Biology: Quantifies mitochondrial parameters to clarify BBB-related hypotheses and de-risk biological mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for compound and genetic perturbation effects on CVE cell bioenergetics.
- Analytics: Outputs oxygen consumption rates and ATP production metrics for robust condition comparison.
- Translational Research: Connects in vitro mitochondrial data to preclinical BBB integrity and disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating mitochondrial function across multiple neurovascular and metabolic disease programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in BBB-targeted discovery and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes mitochondrial assays for reproducibility and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by prioritizing validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurovascular therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, mitochondrial bioenergetics, and assay optimization.
- Needs access to extracellular flux analyzers and compatible analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell density and assay conditions for reproducibility.
- Adaptable to both immortalized and primary CVE cell models with protocol optimization.
- Assay sensitivity and cell viability must be validated for each new cell type or perturbation.
