Name: 脳血管内皮細胞での生体エネルギー機能の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: 学ぶ 脳血管内皮細胞でのミトコンドリア機能評価法。細胞外フラックスアナライザーを用いて生体エネルギー機能をリアルタイムに測定し、血液脳関門の健全性と神経疾患の治療法開発に貢献します。

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注：プロトコルのスキームは、手続きのタイムラインを含め、 図1に示されています。 CVE細胞の1文化とパッセージ<ol><li>完全増殖培地中で培養CVE細胞（のbEnd。3細胞）（高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地、DMEM）は、T75のcm 2の組織培養フラスコ中、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました。 5％CO 2インキュベーター内で37℃で成長します。 </li><li>取り外して、細胞培養培地を廃棄します。 0.25％トリプシン、0.03％EDTA溶液で細胞層を洗浄し、次いで1加算 - フラスコにトリプシンEDTA溶液2mLを3 37℃でフラスコを保つ - 5分。細胞層が分離されるまで、倒立顕微鏡下で細胞を観察します。完全増殖培地の10 mLを加え、穏やかにピペッティングすることにより細胞を吸引します。 </li><li>細胞破片を除去するために、5分間、700×gで15 mLの遠心管とスピンに流体および細胞をデカントします。 </l私&gt; <li>遠心管からの上清を捨てます。完全増殖培地の10 mLを加え、細胞ペレットを再懸濁します。 5分間、700×gで細胞をスピン。 </li><li>遠心管からの上清を捨てます。再懸濁（血球計を用いて計数することによって決定さ、トリパンブルー染色によって死細胞を除外）2.0×10 5細胞/ mlの濃度で完全増殖培地中で細胞ペレットを。 注：たて解凍した細胞は、実験のために少なくとも3継代のためのサブ培養されます。 </li></ol>細胞培養プレート上の細胞を2シードとトリート<ol><li> 96ウェルの細胞外フラックス細胞培養プレート上の種子細胞：80μL/ウェル。 5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞培養プレートを置きます。注：ウェル当たり16×10 3細胞が60に到達します- 24時間以内に80％の密集度に。 </li><li>細胞が化学物質にさらされている場合は、細胞がプレートの底に付着された後、治療を追加（8から24時間後の参照します鼎）。 注：トランスフェクション実験のために、完全増殖培地に抗生物質を追加しないでください。 </li></ol>バイオアナライザを使用したミトコンドリア機能の3.評価<ol><li>アッセイの開始に先立ち、プレートに細胞外フラックス較正溶液150μLを添加し、CO 2なしで37℃でO / Nをインキュベートすることによって較正を有する細胞外フラックスセンサカートリッジを水和。 </li><li>プレート洗浄ステーションを使用して、pH7.0の細胞外フラックスアッセイ培地中に、細胞培養培地を変えます。 60分- 30のためのCO 2なしで37℃で細胞をインキュベートします。 </li><li> 8μMのオリゴマイシン、4.5μMFCCP、10μMのロテノン、およびDMEM中で10μMのアンチマイシンAの作業溶液を調製します。カートリッジの注入口に原液の負荷25μL：ポートA、オリゴマイシン;ポートB、FCCP。ポートC、細胞外フラックスアッセイ培地とロテノンとアンチマイシンA。 表1に記載したように、アッセイプロトコルを実装。 </li><li>バイオアナライザに水和カートリッジをロードし、「スタート」ボタンをクリックしてキャリブレーションを行います。キャリブレーションが完了した後、カートリッジ底板を取り外し、「アンロードカートリッジ」プロンプトをクリックして、セルプレートをロードします。すべての測定が終了するまで試験を続けます。 </li><li>データファイルを開いて、バイオアナライザーからのレート値を取得します。スプレッドシートファイルにデータをエクスポートします。 </li></ol> 4.データ解析注：データ解析のための計算は、以下の処方されます。 OCRは、 図2に示すような値は、バイオアナライザー機器から得られます。 <ol><li>基底値から（測定3） - 基礎呼吸を計算するために、非ミトコンドリア呼吸（12測定10）を引きます。 注：基礎呼吸=基礎 - 非ミトコンドリア呼吸=レート③ - レート⑩〜⑫。 </li><li> ATP productiを計算するには基底値から（測定3） -で、ATP-リンク呼吸（6測定4）を引きます。 注：ATP産生=基礎 - ATP結合型呼吸=レート③ - レート④〜⑥。 </li><li>最大呼吸から（測定7から9） - 最大呼吸を計算するために、非ミトコンドリア呼吸（12測定10）を引きます。 注：最大呼吸=最大呼吸 - 非ミトコンドリア呼吸=レート⑦〜⑨ - レート⑩〜⑫。 </li><li> スペア容量を計算するには 、最大呼吸から基底値（測定3）（ - 9測定7）を引きます。 注：予備能力=最大呼吸 - 基礎=レート⑦〜⑨ - レート③。 </li><li> ATP-リンク呼吸（測定4）から- プロトンリークを計算するために、非ミトコンドリア呼吸（12計測10）を引きます。 注：プロトンリーク= ATP結合型呼吸 - 非ミトコンドリアリットルの呼吸=レート④ - レート⑩〜⑫。 </li></ol>

<ol><li>Quintero, M., Colombo, S. L., Godfrey, A., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+signaling+organelles+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Li, H., Bubolz, A. H., Zhang, D. X., Gutterman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cytoskeletal+elements+are+critical+for+flow-mediated+dilation+in+human+coronary+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng+Comput%22%5BJournal%5D)">Endothelial cytoskeletal elements are critical for flow-mediated dilation in human coronary arterioles.</a> Med Biol Eng Comput. 46, 469-478 (2008).</li>
<li>Al-Mehdi, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinuclear+mitochondrial+clustering+creates+an+oxidant-rich+nuclear+domain+required+for+hypoxia-induced+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Perinuclear mitochondrial clustering creates an oxidant-rich nuclear domain required for hypoxia-induced transcription.</a> Sci Signal. 5, ra47(2012).</li>
<li>Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BCa2%2B%5Di+signaling+between+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+in+neurons+is+regulated+by+microtubules.+From+mitochondrial+permeability+transition+pore+to+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">[Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Biol Chem. 280, 715-721 (2005).</li>
<li>Sutendra, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Nogo+and+the+mitochondria-endoplasmic+reticulum+unit+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">The role of Nogo and the mitochondria-endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension.</a> Sci Transl Med. 3, 88ra55(2011).</li>
<li>Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperfused+mitochondrial+state+achieved+at+G1-S+regulates+cyclin+E+buildup+and+entry+into+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11960-11965 (2009).</li>
<li>Doll, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+crisis+in+cerebrovascular+endothelial+cells+opens+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial crisis in cerebrovascular endothelial cells opens the blood-brain barrier.</a> Stroke. 46, 1681-1689 (2015).</li>
<li>Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+Blood-Brain+Barrier+Damage+in+Stroke%3A+Mitochondrial+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinfect+Dis%22%5BJournal%5D)">Deciphering the Blood-Brain Barrier Damage in Stroke: Mitochondrial Mechanism.</a> J Neuroinfect Dis. S2, e002(2015).</li>
<li>Pun, P. B., Lu, J., Moochhala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+ROS+in+BBB+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of ROS in BBB dysfunction.</a> Free Radic Res. 43, 348-364 (2009).</li>
<li>Sun, J., Hu, H., Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tert-butylhydroquinone+compromises+survival+in+murine+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Tert-butylhydroquinone compromises survival in murine experimental stroke.</a> Neurotoxicol Teratol. 54, 15-21 (2016).</li>
<li>Modis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bioenergetics+is+regulated+by+PARP1+under+resting+conditions+and+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cellular bioenergetics is regulated by PARP1 under resting conditions and during oxidative stress.</a> Biochem Pharmacol. 83, 633-643 (2012).</li>
<li>Brown, R. C., Morris, A. P., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+protein+expression+and+barrier+properties+of+immortalized+mouse+brain+microvessel+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Tight junction protein expression and barrier properties of immortalized mouse brain microvessel endothelial cells.</a> Brain Res. 1130, 17-30 (2007).</li>
<li>Bukeirat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34a+regulates+blood-brain+barrier+permeability+and+mitochondrial+function+by+targeting+cytochrome+c%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">MiR-34a regulates blood-brain barrier permeability and mitochondrial function by targeting cytochrome c.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36, 387-392 (2016).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Impairment+in+Cerebrovascular+Endothelial+Cells+is+Involved+in+the+Correlation+between+Body+Temperature+and+Stroke+Severity%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Impairment in Cerebrovascular Endothelial Cells is Involved in the Correlation between Body Temperature and Stroke Severity.</a> Aging Dis. 7, 14-27 (2016).</li>
<li>Oldendorf, W. H., Cornford, M. E., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+large+apparent+work+capability+of+the+blood-brain+barrier%3A+a+study+of+the+mitochondrial+content+of+capillary+endothelial+cells+in+brain+and+other+tissues+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">The large apparent work capability of the blood-brain barrier: a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat.</a> Ann Neurol. 1, 409-417 (1977).</li>
<li>Oldendorf, W. H., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greater+number+of+capillary+endothelial+cell+mitochondria+in+brain+than+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Greater number of capillary endothelial cell mitochondria in brain than in muscle.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 149, 736-738 (1975).</li>
<li>Kaczara, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+released+by+CORM-401+uncouples+mitochondrial+respiration+and+inhibits+glycolysis+in+endothelial+cells%3A+A+role+for+mitoBKCa+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide released by CORM-401 uncouples mitochondrial respiration and inhibits glycolysis in endothelial cells: A role for mitoBKCa channels.</a> Biochim Biophys Acta. 1847, 1297-1309 (2015).</li>
<li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> J Vis Exp. (96), e52350(2015).</li>
</ol>

著者は、この記事の研究、著者、および/または出版に関して潜在的な利益相反を宣言しません。この記事のオープンアクセス料金は、Agilent Technologies によって提供されました。

このプロトコルは、脳血管内皮細胞に生体エネルギーの表現型を評価するための方法を表しています。これは、内皮細胞ミトコンドリアの評価のための基本的なアッセイとして働き、それはCVE細胞におけるミトコンドリアシグナル伝達経路に影響を与えることができる刺激のメカニズムを研究するために設計された実験のために最適です。それはまた、BBB-破壊関連疾患のための潜在的治療薬を試験するための方法を提供します。 プロトコル内の重要なステップ細胞外フラックスbioanalyzersはリアルタイムにOCRを測定する能力を持っています。このアッセイでは、適切な細胞密度を特定することが重要です。細胞密度はウェル当たり8×10 3細胞未満であると、基底OCR（ 図2及び図3）分析されるには低すぎます。細胞密度はウェル当たり32×10 3個の細胞を超えている場合、細胞は、オリゴマイシンに応答又はFCCPの下水処理しませんNTS（ 図2及び図3）。我々の実験モデルでは、この細胞株に対する最適な細胞密度は7と治療法10,14を刺激するために複製可能な結果と感度を示しているだけでなく、あたり16×10 3細胞です。 24ウェルバイオアナライザーを使用する場合は、細胞密度の新しい滴定アッセイのために必要とされるであろう。 CVEは、他の内皮細胞または組織型15,16に比べて、ミトコンドリアの大容量を有することには大きなエネルギー生産と生体エネルギー代謝を測定するための少数の細胞の必要性を示唆し、文書化されています。当社は、プライマリとして脳内皮細胞のいくつかのタイプを、テストし、7マウス脳血管内皮細胞を不死化し、人間の脳血管内皮細胞（未発表データ）を不死化しています。 160ピコモル/分 - これらの細胞は、40内の許容可能なOCR（基礎呼吸OCRに到達するために同様の細胞密度を必要と96ウェルプレート、50 - 24ウェルプレート、400ピコモル/分）生体エネルギー分析を行いました。 Kaczara らは、より高い細胞密度17を使用したヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）において、生体エネルギー代謝を測定することを報告しました。 当社グループは、他の組織または器官からの血管細胞を評価しませんでした。理論的には、バイオアナライザーは、潜在的に任意の細胞型に使用することができるが、それは（いくつかの特定の細胞がよく成長するコーティングされたプレートを必要とするかもしれない）、細胞密度、細胞培養培地、および培養条件についてのアッセイの最適化が必要です。なお、実験は、OCRの速度が許容範囲内であることを確認するために完了していることが要求されます。他の臓器の内皮細胞におけるOCRは、細胞密度を増加させる、脳からのCVEよりも低い場合に許容可能なOCRの範囲内で取得することができます。細胞はエネルギーの彼らの主な情報源として酸化的リン酸化を使用していない場合あるいは、バイオアナライザーは最適解ではないでしょうLアッセイ。 バイオアナライザーは、試薬が適用される順序に基づいて、電子伝達鎖の連続的破壊を可能にします。まず、オリゴマイシンは、ミトコンドリア複合体V（ATP合成酵素）を阻害する、適用されます。第二に、FCCP、電子脱共役剤は、プロトン勾配の破壊につながる、適用されます。最後に、ミトコンドリア複合体IおよびIIIを阻害ロテノン及びアンチマイシンAは、それぞれ、電子流の合計阻害をもたらすために適用されます。薬物が特定の電子伝達連鎖反応を遮断、逐次変化はミトコンドリアの機能を反映するように測定することができるので、薬物曝露の順序は必須です。 修正およびトラブルシューティング CVE細胞における刺激に対するミトコンドリアの応答を評価するために、細胞を細胞培養プレートの底に付着させた後の刺激を細胞に適用されることをお勧めします（タイムラインを参照してください。図1に示されています。それは、通常、少なくとも6時間）を要します。処理により複製可能な結果を​​得るためには、一貫性のある細胞密度を維持するために極めて重要です。前処理は、細胞播種の前に設計されている場合、それぞれの前処理のための細胞密度は、慎重に播種するための死細胞を除外し、測定されるべきです。トランスフェクションは、実験計画に含まれている場合は、製造元のトランスフェクションプロトコールを参照してください。 図4に示されるデータで実証、のmiR-34Aは、miR-34aの過剰発現と代謝機能の変化を評価するために、抗生物質を含まない細胞培養培地およびミトストレステストを必要とリポフェクタミンのトランスフェクションキットを使用して、CVE細胞にトランスフェクトしました。プラスミドの用量はまた、以前に公表13のように、最適化することができます。プロトコルに対して行うことができるもう一つの変化は、試薬の濃度を変えています。オリゴマイシン、FCCP、および/またはロテノンとアンチマイシンAの滴定曲線はcompleすることができますテッド。 このアッセイは、ハイスループットの様々な薬剤の分析のために使用されている場合に加えて、我々の以前の刊行物7,13に記載された細胞生存率および細胞増殖を測定するための平行分析を含むことが示唆されています。 OCR値は有意に細胞数（ 図2及び3）の影響を受け、そして細胞増殖および生存率アッセイは、データの標準化の利益しています。しかし、これらのアッセイの完了は、個々の研究室の裁量です。 テクニックの制限事項このプロトコルの主な制限は、我々は唯一の研究ではin vitro細胞培養モデルを使用したことです。現在、内皮細胞のミトコンドリア機能に対処することができる利用可能なエクスビボモデルまたは動物モデルは存在しません。新しいモデルは、インビボで生体エネルギー機能の評価のために開発されることが期待されていると<eメートル&gt; ex vivoでの今後の研究インチ別の制限は、生体エネルギー対策以下のバリア性評価を拡張したものです。まず、生体エネルギーの測定が完了した後、細胞生存率は、電子伝達鎖の完全な破壊後減少する、ための実験を行うことができません。第二に、特定の細胞培養プレートおよびインサートは生体エネルギー値を検出するために必要なバリア性評価のための挿入に適合しません。したがって、生体エネルギーのアッセイ後に完了することができ、多くの機能アッセイは存在しません。しかしながら、特殊な装置が生体エネルギーアッセイの前に、機能的アッセイを行うために開発されることが期待されます。 既存の/代替方法に関して技術の意義ミトコンドリアの機能を評価するための従来の技術は、セル18からミトコンドリアの単離を必要としました。このNEバイオアナライザーを使用してワット技術は、単離されたミトコンドリアを評価するよりも細胞環境のより多くを保持する無傷の細胞におけるミトコンドリア活性の測定を可能にします。 このテクニックをマスターした後、将来のアプリケーションや行き方このプロトコルは、設計とのbEnd。3セルライン用に開発されたが、それはまた、主要な脳血管内皮（pCVE）セル7または他の内皮と互換性があり、我々はpCVEセル7を使用して、我々の以前の出版物でこれを実証しているされています。内皮細胞の他のタイプが使用される場合、培養プレートのコーティングおよび成長因子の使用が必要とされ得ます。ただし、滴定アッセイは、同様に他の細胞型のために推奨されます。このプロトコルは、CVE細胞の生体エネルギーの評価に採用される一般的な方法を提供し、それはさらに、このようにメカニズムの研究や治療応答に適用することができます。

広く、脳血管内皮（CVE）細胞によって形成され、血液脳関門（BBB）は、血管生物学の最も重要非常に異なるユニークな機能を有することが認識されます。これらの内皮細胞は、化学エネルギー源としてアデノシン三リン酸（ATP）の細胞供給の大部分を生成するために、ミトコンドリアを使用しています。 CVE細胞についてATPを提供することに加えて、ミトコンドリア1-4シグナリングセルラなどの血管内皮細胞における種々の細胞プロセス、アポトーシス5、および細胞周期の制御、細胞増殖6。CVE細胞におけるミトコンドリアの生体エネルギー機能の調節不全を調節します損なわれた血管内皮の活動につながる、ミトコンドリア生合成に影響を与え、脳血管疾患および神経変性疾患、 例えば 、脳卒中7,8およびアルツハイマー病（AD）9を悪化させる可能性があります 。私たちは、CVE細胞への傷害がlipopolysacへの暴露を、以下のことが実証されています糖類（LPS）は、ストロークが7成果CVE細胞中のミトコンドリア機能を損なうと悪化します。 t-ブチルヒドロキノン（TBHQ）はCVEセル10における酸化的リン酸化を妨害することによって、脳卒中死亡率を増加させます。したがって、CVE細胞だけでなく、パイロットの中枢神経系のメカニズムに関連した一連の研究（CNS）疾患における生体エネルギー機能の定量的なモデルは、だけでなく、血管生物学にミトコンドリアの機能を標的と治療薬の薬剤スクリーニングにおける画期的な製品を提供します。 単離されたミトコンドリアは、生体エネルギー関数を測定するために使用されてきました。私たちは7、その他11は、細胞外フラックスバイオアナライザーを使用して、無傷のCVE細胞における細胞生体エネルギーの評価を報告しています。アナライザは、内因性細胞生体エネルギー評価の利点を提供します。この感受性と一致するアッセイは、CVE細胞のミトコンドリア代謝を測定し、STIによって生体エネルギー障害を評価するために使用することができますMULIは、CVE細胞内のミトコンドリアの機能に影響を与えるミトコンドリアのシグナル伝達経路のメカニズム、および画面の薬や治療法を調査します。このプロトコルでは、ロテノン、及びアンチマイシンAのオリゴマイシン、カルボニルシアニド-4-（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（FCCP）：酸素消費速度（OCRは）は、4つのミトコンドリア攪乱の使用を組み合わせることにより、薬理学的プロファイリングのアプローチを用いてバイオアナライザーによって記録されます我々は、詳細単一のアッセイで、測定および基底ミトコンドリア呼吸、ATP産生、プロトンリーク、最大呼吸、および予備呼吸容量を含むCVE細胞におけるミトコンドリア機能パラメータの計算を可能に最適化されたアプローチを。

<table><tbody><tr><td>bEnd.3細胞株</td><td></td><td>ATCC CRL-2299</td><td>25 - 30継代</td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグルス培地 (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>アトランタバイオロジカルズ</td><td>S12450</td><td>10% 最終濃度</td></tr><tr><td>ペニシリン/ステプトマイシン</td><td>ハイクロン</td><td>SV30010</td><td>1&times;100ストッキング</td></tr><tr><td>0.25%トリプシン、0.03%EDTA溶液</td><td>コーニング</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>コーニング</td><td>25-000-CI</td><td>1.0&マイクロ;M 最終濃度</td></tr><tr><td>グルコース Σ</td><td></td><td>CAS 50-99-7</td><td>25 mM 最終濃度</td></tr><tr><td>オリゴマイシン</td><td>Σ</td><td>O4876</td><td>1.0 & micro;M 最終濃度</td></tr><tr><td>カルボニルシアン化物 4-(トリフルオロメトキシ) フェニルヒドラゾン (FCCP)</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>0.5 & micro;M最終濃度</td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>シグマ</td><td>R8875</td><td>1.0 & マイクロ;M最終濃度</td></tr><tr><td>アンチマイシンA</td><td>シグマ</td><td>CAS 1397-94-0</td><td>1.0 &micro;M 最終濃度</td></tr><tr><td>プレート洗浄ステーション</td><td>タツノオトシゴバイオサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞外フラックスバイオアナライザー&nbsp;&nbsp;</td><td>タツノオトシ</td>ゴバイオサイエンス<td>XFe96</td><td></td></tr>細胞<tr><td>外フラックス細胞培養プレート</td><td>タツノオトシゴバイオサイエンス</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>細胞外フラックスセンサーカートリッジ</td><td>タツノオトシゴバイオサイエンス</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>細胞外フラックスキャリブラント溶液</td><td>タツノオトシゴバイオサイエンス</td><td>100840-000</td><td></td></tr>細胞<tr><td>外フラックスアッセイ培地</td>タ<td>ツノオ</td>トシゴバイオサイエンス<td>102365-100</td><td>PH アッセイ前にバッファーを添加</td></tr></tbody></table>

脳血管内皮細胞での生体エネルギー機能の評価

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

血液脳関門（BBB）の完全性は、脳損傷を防ぐために重要です。脳血管内皮（CVE）細胞がBBBを構成する細胞の種類の一つです。これらの細胞は、最適なミトコンドリア機能を必要とする非常に高いエネルギー需要を有します。疾患または損傷の場合には、これらの細胞におけるミトコンドリア機能は、疾患またはBBBの開口部に生じる、変更することができます。本稿では、我々は全体の、無傷の細胞およびバイオアナライザーを使用して、CVE細胞内のミトコンドリア機能を測定する方法をご紹介します。ミトストレスアッセイは、物理的または化学的に、摂動された細胞をチャレンジし、それらの生体エネルギー機能を評価するために使用されます。さらに、この方法はまた、ミトコンドリア機能に直接影響を持っている新しい治療薬をスクリーニングする便利な方法を提供します。我々は、ミトコンドリアパラ様々な計算を可能にする酸素消費速度を得るために必要な細胞密度を最適化しましたATP産生、最大呼吸、および余力を含めメートル、。また、マイクロRNA、のmiR-34aの導入は、ミトコンドリア活性の顕著なおよび検出可能な減少をもたらすことを実証することによって、アッセイの感度を示しています。本論文で示したデータはのbEnd。3細胞株のために最適化されているが、我々はまた、前臨床および臨床モデルでの有用性を示唆し、一次CVE細胞のためのプロトコルを最適化しました。

酸化ストレスに応答して、CVE細胞の生体エネルギー機能を評価するために、我々は、原発性脳腫瘍の微小血管内皮細胞12と同じ比較バリア特性が表示され、マウスの脳微小血管内皮細胞株のbEnd。3を選択しました。応答の動態および相対強度は、種々の細胞型の間で変化させることは、最初の一連の実験を示す、代謝プロファイリングするためのアッセイで使用するのbEnd。3細胞の最適な数を特定することによって測定OCRレベルを得るように設計された、指定されました評価に続いて、図2は 、データを図3に定量化し、提示されている。基礎呼吸、最大呼吸、および予備の呼吸容量は細胞密度と比例応答を示しました。しかし、ATP産生が過剰コンフルエント細胞培養があることを示唆し、ウェル当たり64×10 3細胞を選択したときに減少しましたこの実験には適していません。ミトコンドリア攪乱に対する応答に基づいて、ウェル当たり32×10 3細胞、 -最適な細胞密度は8の間に発生します。 その後の実験のために、ウェル当たり16×10 3細胞の播種密度は、OCRの変化の最適な検出を可能にするために使用されました。ウェル当たり16×10 3細胞を使用して、我々は、OCRで予想される応答を観察し、マイクロRNAのmiR-34aはCVE細胞（ 図4）にミトコンドリアの機能を低下させることを実証しました。我々は以前のmiR-34aが、これらのセル13において酸化的リン酸化を減少させたことを報告しています。繰り返し実験はまた、最大の呼吸や予備容量を大幅に有意な変化を持っていなくても、基礎呼吸、ATP産生、およびプロトンリークかかわらず、トランスフェクションの24時間後でのCVEにおけるmiR-34aの過剰発現により減少したことを示した（ 図4） 。これらのデータCVEにおけるミトコンドリア機能の変化を検出するバイオアナライザーの感度を示します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig1.jpg" /> 実験図1.戦略計画。セル、プレート、およびカートリッジの準備のためのタイムラインは示されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig2.jpg" /> 種々の細胞密度でCVE細胞における図形生体エネルギー関数の2代表的な生データを酸素消費速度は、異なる細胞密度でCVE細胞で測定しました。データは、平均±SDを表す（N = 5）。 OCR：酸素消費速度; FCCP：シアン化カルボニル-4-（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン;<html>腐/アンチA：ロテノンとアンチマイシンAに①、②、③と基礎呼吸を示しています。 ④、⑤、⑥とATPが呼吸をリンクされている示しています。 ⑦、⑧、および⑨最大呼吸を示しています。 ⑩、⑪、および⑫非ミトコンドリア呼吸を示している。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig3.jpg" /> 様々な細胞密度を持つCVE細胞における生体エネルギー機能図3.代表的な結果。基礎呼吸、ATP産生、最大の呼吸、及び予備容量が第4節に示されている式を用いて、図2に生体エネルギー機能アッセイによって生成された生データから計算されています。データは平均±SD（n = 5）を表します。 OCR：酸素消費速度。<html> F = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig4.jpg" /> 図4：のmiR-34aの減少生体エネルギー機能の代表的な結果 （A）の24時間後、トランスフェクションでのmiR-34aの過剰発現は、以下のミトコンドリア機能の生データ。 （B）基礎呼吸、ATP生産、最大呼吸、及び空き容量を図4Aの生体エネルギー機能アッセイによって生成された生データから計算されます。パラメータは、のmiR-34aの第4節過剰発現に示した式で計算される24時間トランスフェクション後にCVE細胞でミトコンドリアの機能を低下させます。データは、平均±SDを表す（N = 5）。 OCR：酸素消費速度。 ****、P &lt;0.0001。ファイル/ ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/54847/54847table1.jpg" /> 表1.インストゥルメントを実行しますプロトコル。

内皮細胞のミトコンドリアは、血液脳関門の完全性を維持するために重要です。私たちは、脳血管内皮細胞に生体エネルギー機能を測定するためのプロトコルを紹介します。

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

本手順の全体的な目的は、ミトコンドリア機能の変化が神経疾患の発症にどのように影響するかを評価し、血液脳関門の開口に直接作用する治療薬を設計することです。この手法は、脳卒中後の神経細胞死をどのように最小限に抑えられるかなど、神経疾患分野における重要な疑問への回答に寄与します。本技術の主な利点は、完全な状態の細胞全体において、ミトコンドリア機能のリアルタイム評価が可能であることです。完全培地を用いて、T75 cm²の組織培養フラスコ内で、37 °C、5% CO2の条件下で脳血管内皮細胞をコンフルエンスが80%に達するまで培養した後、細胞培養培地を除去し、trypsin EDTAで細胞を洗浄します。次に、1〜2 mLの新鮮なtrypsin EDTAをフラスコに加え、37 °Cで3〜5分間かけて細胞を剥離させます。倒立顕微鏡下で細胞が剥離したことを確認した後、10 mLの新鮮な完全細胞培地を静かに加えて反応を停止させ、細胞を15 mLコニカルチューブに移して遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを10 mLの新鮮な完全増殖培地で洗浄し、再度遠心分離を行います。その後、継代用にペレットを2 × 10⁵ cells/mLの濃度で完全増殖培地に再懸濁します。適切な回数の継代後、96ウェル細胞外フラックス細胞培養プレートの各ウェルに、完全培地80 µL中に1.6 × 10⁴ cellsを播種し、プレートを5% CO₂の37 °Cインキュベーター内に置きます。細胞がプレートに接着した後、目的の処理剤を適切なウェルに添加し、細胞をインキュベーターに戻します。ミトコンドリア機能評価アッセイの前日に、extracellular flux censorカートリッジに150 µLのextracellular flux calibrant solutionを加えて水和させ、二酸化炭素なしの37 °Cでプレートを一晩インキュベートします。翌朝、プレートウォッシャーを用いて、細胞培養培地をpH 7.0のextracellular flux assay mediumに置換します。次に、二酸化炭素を除いた37°Cで細胞を30〜60分間インキュベートします。細胞が平衡状態に達したら、水和させたカートリッジをBioanalyzerに装着し、Startボタンをクリックしてキャリブレーションを開始します。キャリブレーションが終了したら、Unlock Cartridgeのプロンプトをクリックしてカートリッジのボトムプレートを取り外し、セルプレートを装着します。次に、データファイルを開き、スプレッドシートファイルにエクスポートするためのBioanalyzerからの速度値を取得します。脳血管内皮細胞の異なる細胞型間で反応のキネティクスおよび相対強度が異なるため、これらの実験では、代謝プロファイリングアッセイにおける酸素消費速度レベルを測定するための最適な細胞数を特定するために、一連の濃度のbEnd. 3細胞を使用しました。観察された通り、基礎呼吸、最大呼吸、および予備呼吸能は、細胞密度に比例した応答を示します。しかし、1ウェルあたりの細胞濃度が最高になるとATP産生量は低下し、過剰にコンフルエントな細胞培養は本実験に適していないことが示唆されます。したがって、最適な細胞密度は、1ウェルあたりの細胞数の中間範囲にあると考えられます。したがって、この代表的な実験において中程度の細胞濃度を用いて予想される酸素消費速度レベルを評価し、非コード前駆体mRNA分子が脳血管内皮細胞のミトコンドリア機能を低下させることを実証しました。また、これらの実験により、転写導入後24時間の脳血管内皮細胞において、これらの分子を過剰発現させると、基底呼吸、ATP産生、およびプロトンリークには有意な変化が見られないものの、最大呼吸と予備能が有意に低下することが示されました。この手法を習得すれば、2日間で完了させることができます。適切に実施すれば、細胞の播種からミトコンドリア機能の解析までを行うことができます。この手順を行う際は、他のあらゆる操作を開始する前に、最適な細胞密度を決定することが極めて重要であるという点に留意してください。本手順に続き、細胞生存率や糖新生アッセイなどの他の手法を実施することで、細胞生存率の低下や他の代謝経路の変化に伴うミトコンドリア機能の変化について、さらなる疑問を解消することができます。この手法の開発により、ミトコンドリア機能の研究者は、単離ミトコンドリアだけでなく、無傷の細胞内におけるミトコンドリアの利用が可能となり、神経疾患、癌、代謝疾患を含むさまざまな疾患への応用への道が開かれました。このビデオを視聴することで、脳血管内皮細胞におけるミトコンドリア機能の解析方法について深く理解することができます。

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この方法では、マウスの脳から微小血管内皮細胞を分離し不死化する方法について説明します。我々は、脳組織、消化手順、播種し、細胞の不死化の均質化から始まるステップ·バイ·ステップのプロトコルを記述します。通常、それは均質、不死化血管内皮細胞株を得るために約5週間かかります。...

として不死化マウス脳微小血管内皮細胞株の生成<em&gt; in vitroで</em&gt;血液脳関門モデル

このビデオは、細胞外フラックスアッセイを使用して、脳血管内皮(CVE)細胞のミトコンドリア機能の評価を示しています。CVE細胞は、細胞外フラックス細胞培養プレートに播種されます。細胞外フラックスセンサーは、バイオアナライザーにロードしてキャリブレーションする前に水和されます。次に、セルを含むプレートを解析のためにロードします。...

脳血管内皮細胞におけるミトコンドリア機能の評価

内皮機能不全は、多くの疾患状態に関連した、ヒトでの有害心血管イベントの予測です。血流依存性血管拡張（FMD）は、内皮機能を評価する非侵襲的な超音波法である。方法論的な選択とオペレータの経験が結果に影響を与える場合があります。ヒト試験における口蹄疫への体系的なアプローチは、ここで議論されている。...

臨床研究における上腕動脈の内皮依存血流依存性血管拡張の超音波評価

脳微小血管内皮細胞(BMEC)は、血液と中枢神経系(CNS)を分離する高度に制御された障壁を形成する特定の接合タンパク質によって相互接続されています。このプロトコルで述べられているように、初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離により、BBBの詳細なin...

初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離

この記事では、アテローム性動脈硬化症のさまざまな段階を評価するために医学研究で一般的に使用される、血管機能と形態のいくつかの非侵襲的評価のための方法論的考察について説明します。...

血管機能と形態の非侵襲的なアセスメントに方法論的アプローチ

我々は、検出し定量化およびリガンドの血管内皮増殖因子ファミリーのメンバーの活性を監視するための単純な細胞ベースのバイオアッセイを説明します。アッセイは、リガンドによる受容体結合および架橋の半定量的または定量的評価を提供するために、因子依存性細胞株において発現されたキメラ受容体を使用します。...

血管内皮増殖因子の評価のための簡易バイオアッセイ

ここで説明は、(1) たてそのまま脳血管内皮「チューブ」と内皮細胞のカルシウムと膜内皮由来過分極電位 (2) 同時計測を隔離するためのプロトコルです。さらに、これらのメソッド内皮細胞カルシウムと個々...

細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測

我々は、3つの単純なインビトロアッセイ-長距離移動アッセイ、共培養移行アッセイ、および化学誘引アッセイ-それは、ヒト幹細胞由来の心室内皮細胞とその機能を一括して評価するGABAergic インターニューロンとの相互作用.

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

脳実質細動脈からの無傷のマウス脳内皮「チューブ」の集中的な調製は、脳血流調節を研究するために例示される。さらに、我々は、細胞内[Ca2+]および膜電位の変化を含む重要な細胞シグナル伝達経路の蛍光イメージングおよび電気生理学的測定のためのこの内皮研究モデルの実験的強みを実証する。...

マウス脳実質の動脈内皮の単離と機能解析

このプロトコルは脳の血液関門の信頼できる、有効な 生体外...

経内皮電気抵抗検出 による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

ここでは、インピーダンスベースのバイオセンサーであるECISとcellZscopeを使用して、脳内皮バリア強度を測定する手法を示します。脳内皮の in vitro...

がん細胞とサイトカインに応答した2つのインピーダンスベースバイオセンサーによる脳内皮バリア完全性の変化の測定

学ぶ 脳血管内皮細胞でのミトコンドリア機能評価法。細胞外フラックスアナライザーを用いて生体エネルギー機能をリアルタイムに測定し、血液脳関門の健全性と神経疾患の治療法開発に貢献します。

脳血管内皮細胞での生体エネルギー機能の評価

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