臨床的に関連のセフォペラゾン処理されたマウスモデル

本プロトコルの目的は、セフォペラゾン投与によるClostridium difficile感染マウスモデルの導入に向けたステップバイステップのガイドを提供することであり、特に感染後の臨床症状のモニタリング、細菌数の定量、毒素の細胞毒性、および組織病理学的変化に重点を置いています。この詳細なプロトコルは、研究者がClostridium difficile感染マウスモデルを正確に実施することを支援し、本菌の病原性の研究や新規治療法の評価に不可欠なものとなります。本マウスモデルを用いる主な利点は、1種類の抗生物質を5日間投与することで、マウスがC.difficileの定着しやすくなり、ヒトの疾患と並行して長期的な臨床経過をたどる感染症を再現できる点にあります。

まず、目的のC.difficileストック株を取り出し、ボルテックスします。ラミナーフローフード内で、スクリューキャップチューブを用いてストックを滅菌水で希釈し、25 µLあたり10⁵ sporesの濃度にします。この混合物を胞子接種液としてラベルし、チューブを65 °Cのウォーターバスに20分間置きます。

次に、層流クリーンベンチ内で、加熱した胞子接種液 50 µL を滅菌マイクロ遠心チューブにピペットで分注し、次回の使用まで嫌気チャンバー内に移動させます。残りの胞子接種液を、滅菌済みのバルブチップ付き胃管針を装着した 1 mL シリンジに充填します。層流クリーンベンチ内で、被験マウスの首と背中の緩い皮膚を優しく保持して動物を固定し、頭部を不動化します。

人差し指を使用し、動物が鳴いたり苦痛のサインを示したりしないように注意しながら、頭部をさらに固定して食道を伸展させます。マウスを直立した垂直状態で保持し、経口投与針を口の脇からゆっくりと挿入します。経口投与針を口蓋に沿わせて、食道内へとゆっくりと進めてください。

針が食道のほぼ半分まで到達したら、25 µLの胞子接種液を注入し、ゆっくりと針を抜きます。動物をケージに戻し、誤って気管内に投与されたことを示す咳や呼吸困難の兆候がないか観察します。次に、嫌気チャンバー内に保管しておいた胞子接種液の分注量と、残った経口投与用胞子接種液を用いて、180 µLの1x PBSで10倍段階希釈を1回から10回行います。

これらの希釈を4～5回行います。無菌操作を用いて、各段階希釈液 100 µLを個別のTCCFAプレートに分注します。毎回新しい滅菌済みL字型スペアダーを使用し、希釈接種液を各プレート上に均一に塗布します。

プレートを嫌気条件下、37°Cで24時間インキュベートします。最後に、各希釈プレート上のC.difficileコロニー数をカウントし、コロニー形成単位（CFU）を算出することで、マウスに投与した感染量を求めます。評価のためにマウスから糞便サンプルを採取するには、まず、動物にストレスを与えないよう注意しながら、首と背中の緩い皮膚を軽く、かつしっかりと保持してマウスを固定します。

小指を使って動物の尾をそっと持ち上げ、肛門を露出させます。重量を量っておいた滅菌済みのマイクロ遠心チューブを動物の肛門の直下に保持し、チューブがマウスに直接触れないようにします。動物が排便した際、糞便ペレットをチューブに回収します。

必要なサンプルがすべて収集されるまで、チューブを室温で保存します。糞便の入ったチューブを分析用天秤で量り、質量を小数点以下4桁まで記録します。チューブの重量を差し引いて、糞便ペレットの重量を算出します。

次に、内容物を10倍希釈して1x PBSで再懸濁します。ピペットのチップを用いて、糞便物を溶液中に緩やかに分散させます。サンプルを室温で30分間インキュベートし、内容物を沈殿させます。

溶液を嫌気的に保持しながら、1x PBSを用いて各サンプルの段階希釈を行います。各段階希釈液100 microlitersをTCCFAプレートに分注します。滅菌済みのL字型スプレッダーを使用し、培地全体に均一に塗り広げます。

プレートを嫌気条件下、37 °Cで24時間インキュベートします。最後に、C.difficileコロニー数を計数し、糞便内容物1グラムあたりのコロニー形成単位（CFU）を算出します。この図は、C.difficile R20291を接種した後のマウスの体重変化を示しています。

0日目のベースライン体重を100に設定した。その後14日間にわたり、マウスの平均体重を毎日測定した。チャレンジ後の2日から7日にかけて、チャレンジ群のマウスにおいて有意な体重減少が観察された。

この時点以降、マウスは回復し、体重が戻ったように見えました。ここでは、感染後の日数における糞便中のC.difficile負荷量を示します。感染後24時間において、すべてのマウスの糞便1gあたり10の7乗CFUの定着が認められました。

この菌量は7日目以降に減少しましたが、C.difficileは依然として検出されました。感染経過に伴うマウスの組織病理学的検査では、盲腸に最も顕著な病理学的変化が認められました。盲腸の総組織学的スコアは、0日目と、感染後2日目および4日目との間で有意な差がありました。

一般的に、このマウスモデルを初めて扱う方は、マウスへの感染に使用する胞子接種液の計算と調製、および糞便中のC.difficile菌量の算出に苦労することがあります。本プロトコルを実施する際は、マウスに投与するC.difficile胞子の用量や菌株を変更すると、モデルの結果が変わる可能性があることに留意することが重要です。