Name: 臨床的に関連のセフォペラゾン処理されたマウスモデルクロストリジウム・ディフィシルひずみR20291 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 学ぶセフォペラゾンマウスモデルによるClostridioides difficile感染症の病態解析。R20291株を用いて臨床症状モニタリング、細菌計数、毒素活性測定、組織病理学的変化を評価し、新規治療法開発の基盤となる知見を提供する。

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著者は、この原稿で利用されているVero細胞について、ウェルカムトラストサンガー研究所のTrevor Lawley氏とノースカロライナ州立大学獣医学部のJames S. Guy氏に感謝します。動物組織病理学は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校のLCCC動物組織病理学コア施設で、Traci Raley氏とAmanda Brown氏の特別支援を受けて実施されました。LCCC Animal Histopathology Coreは、UNC Lineberger Comprehensive Cancer CenterへのNCI Center Core Support Grant(2P30CA016086-40)によって部分的にサポートされています。また、Vero細胞毒性アッセイプロトコルに関する有益な議論をしていただいたVincent Young氏、Anna Seekatz氏、Jhansi Leslie氏、Cassie Schumacher氏にも感謝します。JAWは、NIHがT32OD011130したRuth L. Kirschstein National Research Service Award Research Training助成金によって資金提供されています。CMTは、NIHのNIGMSがK01GM109236したメタボロミクス助成金のキャリア開発賞によって資金提供されています。

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著者らは現時点では開示するものは何もない。

このプロトコルは、 C. difficile R20291胞子に挑戦された抗生物質治療マウスの体重減少、細菌のコロニー形成、毒素細胞毒性、および消化管の組織病理学的変化を含む臨床経過を特徴付けます。プロトコル内には、細部への注意が不可欠な重要なステップがいくつかあります。 C.ディフィシル 胞子接種物の正確な計算は重要です。この計算は、元の C.ディフィシル 胞子ストックの列挙に基づいており、このプロトコルを開始する前に、複数の胞子の列挙で一貫している必要があります。接種量の計算が間違っていると、マウスの接種量が不正確になります。同様に、これらの計算に基づく C.ディフィシル 胞子の調製と希釈は注意して調製する必要があります。希釈エラーがあると、開始胞子接種物が不正確になります。最後に、抗生物質で処理された対照マウス( C.ディフィシル 胞子を接種していない)の汚染を避けるための予防措置を講じる必要があります。セフェラゾンで処理されたマウスは、 C.ディフィシル のコロニー形成に非常に敏感であるため、 C.ディフィシル</...

クロストリジウム・ディフィシルは、生命を脅かす下痢1の原因となる嫌気性、グラム陽性、芽胞形成桿菌です。 クロストリジウム・ディフィシル感染症（CDI）が増加し、ヒトの罹患率および死亡率と年間1-4あたりの医療費のオーバー$ 4.8十億の結果と関連しています。 2013年には、疾病管理予防センター（CDC）は、それが公衆衛生1に緊急の脅威をもたらすことを示す、緊急の抗生物質耐性のリスクとしてクロストリジウム・ディフィシルを分類しました。現在、抗生物質バンコマイシンによる治療およびメトロニダゾールはCDI 5のためのケアの標準と考えられています。患者2,5-7の30％ -残念ながら、抗生物質による治療成功後のCDIの再発は20で発生した、高いです。したがって、この腸管病原体に対する新規治療法の発見が必要です。 ディフィシル 、交流で人間の病気を近似するモデル動物に対する治療薬を評価するために、linically関連株が必要とされています。 最初は、コッホの仮説は、クリンダマイシン処理したシリアンハムスターモデル8を使用して、1977年にC.ディフィシルのために設立されました。このモデルは、まだ病因9,10上のC.ディフィシル毒素の効果を調査するために、今日利用されています。しかし、CDIは、ハムスターモデルで高い死亡率をもたらし、CDI 10,11を有するヒトで見られる慢性潜行性の疾患の症状を近似しません。研究におけるマウスのプラットフォームのアクセシビリティと試薬可用性に基づいて、CDIのマウスモデルは関連しています。 2008年には、CDIの堅牢なマウスモデルは、クリンダマイシン12の腹腔内注射した3日間飲料水中の抗生物質カクテル（カナマイシン、ゲンタマイシン、コリスチン、メトロニダゾール、及びバンコマイシン）でマウスを処理することによって設立されました。これは、CDIと重度の大腸炎の影響を受けやすいマウスをレンダリング。左右される投与接種用量にる、臨床徴候および死亡率の範囲は、このモデルを用いて観察することができます。この時以来、様々な抗生物質療法は、 クロストリジウム・ディフィシルが消化管コロニー形成することができる点に植民地抵抗を低減、マウスの腸内細菌叢を変化させることが検討されている（ベストらに検討を。そしてローリー＆ヤング）13,14。 最近になって、5または10日間、飲料水中に与えられた広域スペクトルセファロスポリン、セフォペラゾンは、再現CDI 15感受性マウスをレンダリングします。第三世代セファロスポリンの投与は、ヒトにおけるCDIのリスク増加と関連しているので、セフォペラゾンモデルの使用は、より正確に天然に存在する病気16を反映しています。 クロストリジウム・ディフィシルの影響を受けやすいセフォペラゾン処置したマウスは、 クロストリジウム・ディフィシル胞子および臨床に至るまでの株の様々な栄養細胞の両方でチャレンジされています関連性と毒性17。感染性形態としてクロストリジウム・ディフィシレ栄養細胞を利用し、元の研究のいくつかにもかかわらず、 クロストリジウム・ディフィシルの胞子は変速機18の主要なモードと考えられています。 過去十年間では、C。ディフィシル R20291、NAP1 / BI / 027株は、CDI 19,20の流行を引き起こし、浮上しています。私たちは、セフォペラゾン処置したマウスは、R20291、臨床的に関連すると遺伝的に扱いやすいC.ディフィシル株で攻撃したとき、疾患の臨床経過を決定しようとしました。このプロトコルは、体重減少、細菌コロニー形成、毒素の細胞毒性、およびC.ディフィシル R20291の胞子でチャレンジしたマウスの胃腸管における組織病理学的変化を含め、臨床経過を詳しく説明します。全体として、このマウスモデルは、CDIは、ヒトの疾患を近似するための貴重な実験プラットフォームであることが分かります。この特徴づけマウスモデルは、このような効果を評価するために利用することができます臨床疾患の改善にとC.ディフィシルに対する植民地抵抗の回復に対する新規治療薬の。

<table><tbody><tr><td>#62 ペリセプト 散形除菌クリーナー&nbsp;</td><td>SSS Navigator</td><td>48027</td><td>この製品は、メーカーが推奨する</td></tr>希釈が必要です <tr><td>0.22 &mu;mフィルター</td><td>フィッシャーブランド</td><td>09-720-3</td><td>ベロセルアッセイで試験された個々のサンプル用のフィルタープレートの代替品</td></tr><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>37°Cで水浴中で加熱する必要があります。C 使用前に</td></tr><tr><td>0.4% トリパン ブルー</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>1% ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>10% 熱不活性化 FBS</td><td>Gibco</td><td>16140-071</td><td>37°Cでウォーターバスで加熱する必要があります。C:</td></tr><tr><td>1mlのプラスチックシリンジを使用する前のC&nbsp;</td><td>BD医療用品</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>2 ml マイクロ遠心分離機スクリューキャップ</td><td>コーニング</td><td>430917</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル細胞培養フラットボトムプレート</td><td>Costar コーニング</td><td>CL3595</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルフィルタープレート</td><td>ミリポア</td><td>MSGVS2210</td><td></td></tr><tr><td>接着シール</td><td>ThermoScientific</td><td>AB-0558</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td>TCCFAプレートの一部(下記参照)</td></tr><tr><td>Bacto Proteose Peptone</td><td>Becton Dickinson</td><td>211684</td><td>TCCFAプレートの一部(下記参照)</td></tr><tr><td>セフォペラゾン</td><td>MP Bioworks</td><td>199695</td><td></td></tr><tr><td>Cefoxitine</td><td>Sigma</td><td>C47856</td><td>TCCFAプレートの一部(下記参照)</td></tr><tr><td>Clostridium difficile Antitoxin Kit</td><td>Tech Labs</td><td>T5000</td><td>Vero Cell Assay</td></tr><tr><td>Clostridium difficile Toxin A</td><td>List Biological Labs</td><td>152C</td><td>Positive control for Vero Cell Assay</td></tr><tr><td>D-cycloserine</td><td>Sigma</td><td>C6880</td><td>TCCFAプレートの一部(下記参照)</td></tr><tr><td>蒸留水</td><td>Gibco</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1x Media</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>37°Cで水浴中で加熱する必要があります。C フル</td></tr><tr><td>クトース</td>フィ<td>ッシャーL95500</td><td>TCCFAプレートの一部(下記参照)</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Bright-Line, Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P285-500</td><td>TCCFAプレートの一部(下記参照)</td></tr><tr><td>MgSO4(無水)</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>TCCFAプレートの一部(下記参照)</td></tr><tr><td>Millex-GS 0.22 &mu;mフィルター</td><td>Millex-GS</td><td>SLGS033SS</td><td>TCCFAプレート用フィルター&nbsp;</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td>TCCFAプレートの一部(下記参照)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S640-3</td><td>TCCFAプレートの一部(下記参照)</td></tr><tr><td>Number 10 使い捨てメス刃</td><td>Miltex, Inc</td><td>4-410</td><td></td></tr><tr><td>PCRプレート</td><td>フィッシャーブランド</td><td>14230244</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックペトリ皿</td><td>Kord-Valmark Brand</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>滅菌プラスチックL字型細胞散布機</td><td>フィッシャーブランド</td><td>14-665-230</td><td></td></tr><tr><td>シリンジステッパー</td><td>ダイマックスコーポレーション</td><td>T15469</td><td></td></tr><tr><td>タウロコール酸</td><td>シグマ</td><td>T4009</td><td>TCCFAプレートの一部(下記参照)</td></tr><tr><td>超純水</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>664</td><td>マウスは生後5〜8週齢である必要があります</td></tr><tr><td>オリンパスBX43F光学顕微鏡</td><td>オリンパスライフサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DP27カメラ</td><td>オリンパスライフサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cellSens Dimensionソフトウェア&nbsp;</td><td>オリンパスライフサイエンス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

臨床的に関連のセフォペラゾン処理されたマウスモデル<em&gt;クロストリジウム・ディフィシル</em&gt;ひずみr20291

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

クロストリジウム・ディフィシルは、嫌気性、グラム陽性、胞子形成性の腸内病原体であり、罹患率と死亡率の増加と関連しており、その結果、公衆衛生に緊急の脅威をもたらします。抗生物質による治療が成功した後のC.ディフィシル感染症(CDI)の再発率は高く、患者の20〜30%に発生しているため、この病原体に対する新しい治療法の発見が必要です。現在のCDIの動物モデルは死亡率が高いため、CDIのヒトに見られる慢性の潜行性疾患の発現には近似していません。C. difficileに対する治療薬を評価するには、臨床的に関連性のある株を利用したヒト疾患に近似するマウスモデルが必要です。このプロトコルは、臨床的に関連性があり、遺伝的に扱いやすい株であるR20291を使用したCDIのセフォペラゾンマウスモデルの概要を示しています。臨床疾患モニタリングの技術、C.ディフィシル細菌の計数、毒素の細胞毒性、およびマウスモデルにおけるCDI全体の組織病理学的変化は、プロトコルで詳しく説明されています。 CDIの他のマウスモデルと比較して、このモデルは投与された用量で一様に致死的ではなく、ヒトの疾患と一致する感染の長期にわたる臨床経過の観察を可能にします。したがって、このCDIのセフォペラゾンマウスモデルは、新規治療薬が臨床疾患の改善およびC.ディフィシルに対するコロニー形成抵抗性の回復に及ぼす影響を評価するための貴重な実験プラットフォームであることを証明しています。

代表的な研究の間、5週齢のC57BL / 6 WTマウスは、5日間、飲料水（0.5 mg / mlで）でセフォペラゾンで前処理し、2日間は、通常の飲料水で洗い流すせました。マウスを、0日目に強制経口投与を介して、 クロストリジウム・ディフィシル R20291の10 5胞子（ 図1A）で攻撃しました。マウスは、14日間のCDIの体重減少および臨床的徴候（嗜眠、食欲不振、下痢、および猫背の姿勢）をモニターしました。 C.ディフィシル R20291胞子とC57BL / 6 WTマウスの課題は、24時間および48時間後にチャレンジ（ 図1B）内に有意な体重減少の中に下痢になりました。この実験では観察されなかったが、C。ディフィシル R20291の高用量でチャレンジしたマウスは、重症になったり、48で20％以上の体重減少を持つことができます- 72時間チャレンジ後、このように人道的な安楽死を必要とします。したがって、マウスは1日2回の最小値...

このプロトコルは、臨床的に関連すると遺伝的に扱いやすい歪み、R20291を使用して、 クロストリジウム・ディフィシル感染症（CDI）のセフォペラゾンマウスモデルの概要を説明します。臨床疾患のモニタリング、 ディフィシル細菌列挙、毒素の細胞毒性、およびマウスモデルにおいてCDIを通じて組織病理学的変化を重視したプロトコルで詳述されています。

臨床的に関連のセフォペラゾン処理されたマウスモデル<em&gt;クロストリジウム・ディフィシル</em&gt;ひずみR20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

本プロトコルの目的は、セフォペラゾン投与によるClostridium difficile感染マウスモデルの導入に向けたステップバイステップのガイドを提供することであり、特に感染後の臨床症状のモニタリング、細菌数の定量、毒素の細胞毒性、および組織病理学的変化に重点を置いています。この詳細なプロトコルは、研究者がClostridium difficile感染マウスモデルを正確に実施することを支援し、本菌の病原性の研究や新規治療法の評価に不可欠なものとなります。本マウスモデルを用いる主な利点は、1種類の抗生物質を5日間投与することで、マウスがC.difficileの定着しやすくなり、ヒトの疾患と並行して長期的な臨床経過をたどる感染症を再現できる点にあります。まず、目的のC.difficileストック株を取り出し、ボルテックスします。ラミナーフローフード内で、スクリューキャップチューブを用いてストックを滅菌水で希釈し、25 µLあたり10⁵ sporesの濃度にします。この混合物を胞子接種液としてラベルし、チューブを65 °Cのウォーターバスに20分間置きます。次に、層流クリーンベンチ内で、加熱した胞子接種液 50 µL を滅菌マイクロ遠心チューブにピペットで分注し、次回の使用まで嫌気チャンバー内に移動させます。残りの胞子接種液を、滅菌済みのバルブチップ付き胃管針を装着した 1 mL シリンジに充填します。層流クリーンベンチ内で、被験マウスの首と背中の緩い皮膚を優しく保持して動物を固定し、頭部を不動化します。人差し指を使用し、動物が鳴いたり苦痛のサインを示したりしないように注意しながら、頭部をさらに固定して食道を伸展させます。マウスを直立した垂直状態で保持し、経口投与針を口の脇からゆっくりと挿入します。経口投与針を口蓋に沿わせて、食道内へとゆっくりと進めてください。針が食道のほぼ半分まで到達したら、25 µLの胞子接種液を注入し、ゆっくりと針を抜きます。動物をケージに戻し、誤って気管内に投与されたことを示す咳や呼吸困難の兆候がないか観察します。次に、嫌気チャンバー内に保管しておいた胞子接種液の分注量と、残った経口投与用胞子接種液を用いて、180 µLの1x PBSで10倍段階希釈を1回から10回行います。これらの希釈を4～5回行います。無菌操作を用いて、各段階希釈液 100 µLを個別のTCCFAプレートに分注します。毎回新しい滅菌済みL字型スペアダーを使用し、希釈接種液を各プレート上に均一に塗布します。プレートを嫌気条件下、37°Cで24時間インキュベートします。最後に、各希釈プレート上のC.difficileコロニー数をカウントし、コロニー形成単位（CFU）を算出することで、マウスに投与した感染量を求めます。評価のためにマウスから糞便サンプルを採取するには、まず、動物にストレスを与えないよう注意しながら、首と背中の緩い皮膚を軽く、かつしっかりと保持してマウスを固定します。小指を使って動物の尾をそっと持ち上げ、肛門を露出させます。重量を量っておいた滅菌済みのマイクロ遠心チューブを動物の肛門の直下に保持し、チューブがマウスに直接触れないようにします。動物が排便した際、糞便ペレットをチューブに回収します。必要なサンプルがすべて収集されるまで、チューブを室温で保存します。糞便の入ったチューブを分析用天秤で量り、質量を小数点以下4桁まで記録します。チューブの重量を差し引いて、糞便ペレットの重量を算出します。次に、内容物を10倍希釈して1x PBSで再懸濁します。ピペットのチップを用いて、糞便物を溶液中に緩やかに分散させます。サンプルを室温で30分間インキュベートし、内容物を沈殿させます。溶液を嫌気的に保持しながら、1x PBSを用いて各サンプルの段階希釈を行います。各段階希釈液100 microlitersをTCCFAプレートに分注します。滅菌済みのL字型スプレッダーを使用し、培地全体に均一に塗り広げます。プレートを嫌気条件下、37 °Cで24時間インキュベートします。最後に、C.difficileコロニー数を計数し、糞便内容物1グラムあたりのコロニー形成単位（CFU）を算出します。この図は、C.difficile R20291を接種した後のマウスの体重変化を示しています。0日目のベースライン体重を100に設定した。その後14日間にわたり、マウスの平均体重を毎日測定した。チャレンジ後の2日から7日にかけて、チャレンジ群のマウスにおいて有意な体重減少が観察された。この時点以降、マウスは回復し、体重が戻ったように見えました。ここでは、感染後の日数における糞便中のC.difficile負荷量を示します。感染後24時間において、すべてのマウスの糞便1gあたり10の7乗CFUの定着が認められました。この菌量は7日目以降に減少しましたが、C.difficileは依然として検出されました。感染経過に伴うマウスの組織病理学的検査では、盲腸に最も顕著な病理学的変化が認められました。盲腸の総組織学的スコアは、0日目と、感染後2日目および4日目との間で有意な差がありました。一般的に、このマウスモデルを初めて扱う方は、マウスへの感染に使用する胞子接種液の計算と調製、および糞便中のC.difficile菌量の算出に苦労することがあります。本プロトコルを実施する際は、マウスに投与するC.difficile胞子の用量や菌株を変更すると、モデルの結果が変わる可能性があることに留意することが重要です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Winston, J. A. ほか 臨床的に関連性のある クロストリジウム・ディフィシル 株のセフペラゾン処理マウスモデルR20291。 J. Vis. Exp. (2016年)このビデオは、抗生物質前処理マウスに クロストリジウム・ディフィシル...

クロストリジウム・ディフィシル感染のマウスモデルの確立

出典: Winston, J. A. ほか 臨床的に関連性のある クロストリジウム・ディフィシル 株のセフペラゾン処理マウスモデルR20291。 J. Vis. Exp. (2016年)このビデオは、感染マウスモデルの糞便サンプルから選択培養技術を用いてクロス トリジウム・ディフィシル...

感染マウスモデルの糞便サンプルにおける クロストリジウム・ディフィシル の定量化

シトロrodentium感染は腸内細菌感染症を勉強するだけでなく、マウスでは免疫応答や大腸炎をホストするための貴重なモデルを提供します。このプロトコルは、障壁の完全性、病原体負荷と病原体と宿主マウス感染性大腸炎への貢献を徹底特性評価を可能にする組織学的損傷の測定の概要を説明します。...

ザ<em&gt;シトロrodentium</em&gt;マウスモデル：感染性大腸炎に勉強病原体とホスト貢献

マルチモダリティイメージングは​​、小さな動物モデルで細菌のコロニー形成を研究するための貴重なアプローチである。このプロトコルは、生物発光とマウスの感染症を概説...

の4Dのマルチモダリティイメージング<em&gt;シトロバクターrodentium</emマウスにおける&gt;感染症

細菌の病因を理解し、新しい治療法の開発を生み出すためには、尿路感染症(UTI)をモデル化する能力が重要です。この研究の目標は、ヒトで見られる所見を再現および予測する実験的UTIおよびカテーテル関連UTIのマウスモデルを実証することです。...

マウスモデルにおけるUTIとCAUTIの樹立とその性状

抗生物質の有効性は、最も一般的には殺傷速度論研究を実施し、コロニー形成単位(CFU)を測定することによって決定されます。走査型電子顕微鏡(SEM)をこれらの標準的な方法に統合することで、異なる抗生物質間で治療の薬理学的効果を区別することができます。...

形態変化を特徴付けるプロトコル<em&gt;クロストリジウム・ディフィシル</em&gt;抗生物質治療に対する反応

ここで提示された、ゼブラフィッシュ幼虫を蛍光標識された嫌気性C.ディフィシルでマイクロインジェクションおよび非侵襲的なマイクロガベージによって感染させる安全で効果的な方法です。...

クロストリジオイド・ディフィシルの幼虫ゼブラフィッシュ感染モデルの開発

尿路病原性 大腸菌 (UPEC)経尿道接種のマウスモデルにより、潜伏細胞内膀胱リザーバを確立し、その後の再発性UPEC UTIを誘導するための G.膣への膀胱 曝露が実証される。また、細菌の列挙、尿細胞診、および走査型電子顕微鏡のためのin...

マウスにおけるガードネレラ膣膀胱曝露によって引き起こされる再発性大腸菌尿路感染症

ここでは、抗生物質誘発性疑似細菌フリーデキストラン硫酸ナトリウム誘発性大腸炎マウスモデルを確立するためのプロトコルを提示し、腸内細菌叢の役割を調査します 大腸炎に対するセ レウス菌 のプラスの効果を調節する。...

腸内細菌叢の調節による大腸炎に対する セレウス菌 投与の緩和効果の調査

マウスにおける上行性膣感染症、早産、および新生児罹患率のモデル化

本プロトコルは、非炎症条件下で pks+大腸菌 をマウスに定着させるために必要な手順と、便中での pks+大腸菌 の拡大の定着と評価のための非侵襲的手法を説明しています。...

非炎症条件下でのマウス pks+大腸菌 の定殖

学ぶセフォペラゾンマウスモデルによるClostridioides difficile感染症の病態解析。R20291株を用いて臨床症状モニタリング、細菌計数、毒素活性測定、組織病理学的変化を評価し、新規治療法開発の基盤となる知見を提供する。

臨床的に関連のセフォペラゾン処理されたマウスモデル

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