臨床的に関連のセフォペラゾン処理されたマウスモデルクロストリジウム・ディフィシルひずみR20291
2016年12月10日
このプロトコルは、臨床的に関連すると遺伝的に扱いやすい歪み、R20291を使用して、 クロストリジウム・ディフィシル感染症（CDI）のセフォペラゾンマウスモデルの概要を説明します。臨床疾患のモニタリング、 ディフィシル細菌列挙、毒素の細胞毒性、およびマウスモデルにおいてCDIを通じて組織病理学的変化を重視したプロトコルで詳述されています。
このプロトコルの全体的な目標は、臨床疾患モニタリング、細菌計数、毒素細胞毒性、およびチャレンジ後の組織病理学的変化に特に重点を置いて、クロストリジウム・ディフィシル感染症のセフォペラゾンマウスモデルを実施するためのステップバイステップのガイドを提供することです。この詳細なプロトコルは、研究者がクロストリジウム・ディフィシル感染症のマウスモデルを正確に実行するのに役立ちます。これは、この細菌の病因を研究し、新しい治療法にアクセスするために不可欠です。このマウスモデルを使用する主な利点は、1つの抗生物質に5日間曝露すると、マウスはC.ディフィシルのコロニー形成にかかりやすくなり、ヒトの疾患と同時に感染の臨床経過が長期
化することです。まず、C.difficile株の関心とボルテックスを取ります。層流フードで、スクリューキャップチューブ内の滅菌水でストックを25マイクロリットルあたり10〜5番目の胞子の濃度に希釈します。混合物を胞子接種物としてラベル付けし、チューブを摂氏65度の水浴に20分間入れます。
次に、層流フードで、加熱した胞子接種物の50マイクロリットルを滅菌マイクロ遠心チューブにピペットで移し、さらに使用するまで嫌気性チャンバーに通します。残りの胞子接種物を、滅菌球根先端胃強制針に取り付けられた1ミリリットルの注射器に入れます。層流フードで、対象のマウスを取り、首と背中の緩い皮膚で動物を優しく拘束することにより、頭を固定します。
人差し指を使用し、動物が声を出したり苦痛の兆候を示さないようにすることで、動物の頭をさらに固定し、食道を伸ばします。マウスを直立させて垂直に置き、強制針を口の側面にそっと通します。強制針を口蓋に沿って向け、ゆっくりと食道に進めます。
針が食道の約半分まで来たら、25マイクロリットルの胞子接種液を注入し、針を静かに引き抜きます。動物をケージに戻し、不注意による気管投与を示す可能性のある咳や呼吸困難の兆候がないか観察します。.次に、嫌気性チャンバーに以前に保存された胞子接種アリコートと、残りの強制巣胞子接種物を取り、1x PBSの180マイクロリットルで1〜10回の段階希釈を行います。
これらの希釈のうち4〜5回を実行します。無菌技術を使用して、各段階希釈液の100マイクロリットルを個々のTCCFAプレートに移します。毎回新しい滅菌L字型スプレッダーを取り、希釈接種液を各プレートに均等に分配します。
プレートを嫌気性条件下で摂氏37度で24時間インキュベートします。最後に、各希釈プレート上のC.difficileコロニーをカウントし、コロニー形成単位を計算して、マウスに投与された感染用量を取得します。評価のためにマウスから糞便サンプルを採取するには、まず、首と背中の緩い皮膚で対象のマウスを軽く、しかししっかりと拘束し、動物が苦痛を感じていないことを確認します。
小指を使って、動物の尻尾をそっと持ち上げ、肛門を露出させます。重量がわかっている滅菌微量遠心チューブを動物の肛門の真下に保持し、チューブがマウスに直接触れないようにします。動物が排便したら、糞便ペレットをチューブに集めます。
必要なサンプルがすべて収集されるまで、チューブを室温で保管します。分析スケールで糞便を含むチューブを計量し、質量を小数点以下4桁まで記録します。チューブの重量を差し引いて、糞便ペレットの重量を計算します。
次に、内容物の1〜10希釈を計算し、1x PBSに再懸濁します。ピペットの先端を使用して、糞便を穏やかに溶液に混乱させます。サンプルを室温で30分間インキュベートし、内容物が沈殿するまで待ちます。
溶液を嫌気的に維持し、1x PBSで各サンプルの段階希釈を行います。各段階希釈液の100マイクロリットルをTCCFAプレートに移します。滅菌L字型スプレッダーを使用し、メディアをプレートに均一に塗布します。
プレートを摂氏37度の嫌気性条件下で24時間インキュベートします。最後に、C.difficileコロニーを列挙し、糞便含有量のグラムあたりのコロニー形成単位を計算します。この図は、C.difficile R20291のチャレンジ後の数日間のマウスの体重を示しています。
0 日目では、ベースラインの重みは 100 に設定されます。マウスの平均体重は、その後14日間、毎日測定されました。負荷をかけたマウスでは、負荷後2日目から7日目に体重の有意な減少が観察されました。
マウスはこの時点以降、回復して体重が戻ったように見えました。ここでは、チャレンジ後の数日間の糞便中のC.difficile負荷を示します。チャレンジ後24時間で、すべてのマウスに糞便1グラムあたり10〜7番目のCFUをコロニー化しました。
この負荷は7日目以降に減少しましたが、C.difficileはまだ存在しています。感染の経時的な経過過程にわたるマウスの病理組織学的検査では、盲腸に最も顕著な病理学的変化が示されました。合計盲腸組織学的スコアは、チャレンジ後 0 日目と 2 日目および 4 日目とで有意に異なっていました。
一般に、このマウスモデルを初めて使用する個体は、マウスに挑戦するために使用される胞子接種物の計算と調製、および糞便C.difficile細菌負荷の計算に苦労する可能性があります。このプロトコルを試行する際には、マウスに投与されたC.difficile胞子の用量または菌株の変更が、このモデルの結果を変更する可能性があることを覚えておくことが重要です。
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概要
このプロトコルは、臨床的に関連性の高い株R20291を使用したセフォペラゾンマウスモデルのクロストリジウム・ディフィシル感染（CDI）の概要を示しています。CDIを通じての臨床疾患モニタリング、細菌数の評価、毒素の細胞毒性、および組織病理学的変化を強調しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 微生物学
- 感染症
- 動物モデル
背景
- クロストリジウム・ディフィシルは、抗生物質関連下痢の重要な原因です。
- セフォペラゾンマウスモデルは、ヒトのCDIを模倣します。
- CDIの病因理解は、新しい治療法の開発にとって重要です。
- このモデルは、ヒト症例と同様の長期的な臨床観察を可能にします。
研究の目的
- セフォペラゾンマウスモデルの実装のための詳細なプロトコルを提供すること。
- CDIに関連する実験の正確な実行を促進すること。
- CDIの病因理解と治療アプローチを向上させること。
使用方法
- C. ディフィシル胞子接種液の調製。
- 感受性を引き起こすためのセフォペラゾンの投与。
- マウスにおける臨床疾患進行のモニタリング。
- 細菌数と毒素活性の評価。
主要な結果
- 抗生物質治療後のマウスにおけるC. ディフィシルの成功的な定着。
- 臨床症状と疾患進行の詳細な観察。
- 細菌数の定量分析と毒素効果。
- CDIと一致する組織病理学的変化が観察されました。
結論
- セフォペラゾンマウスモデルは、CDIの研究に効果的です。
- このモデルは、C. ディフィシルの病因に関する洞察を提供します。
- これは新しい治療戦略をテストするためのプラットフォームとして機能します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The cefoperazone-treated mouse model using C. difficile strain R20291 enables translationally relevant evaluation of novel therapeutics targeting chronic and recurrent Clostridium difficile infection. By recapitulating the prolonged clinical course and non-uniform lethality observed in human CDI, this model supports predictive confidence in preclinical efficacy and mechanistic de-risking for anti-infective portfolios. Its quantitative outputs and disease-relevant endpoints position it as a critical inflection point for therapeutic candidate triage and advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a clinically relevant infection model.
- Supports biological de-risking by modeling chronic CDI progression and host-pathogen interactions.
- Facilitates functional target validation through quantitative bacterial load and toxin activity measurements.
- Provides mechanistic insight into colonization resistance and disease amelioration.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized protocols for bacterial enumeration and toxin cytotoxicity assays.
- Ensures reproducibility of infection severity and clinical monitoring across cohorts.
- Generates quantitative outputs for comparative evaluation of therapeutic candidates.
- Prepares validated animal systems for downstream efficacy and biomarker studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with human disease features, supporting translational biomarker development.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of anti-CDI agents.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on clinically relevant endpoints.
- Provides histopathological and clinical data for mechanistic de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
This model bridges early discovery and preclinical validation by providing a robust platform for hypothesis testing, efficacy screening, and translational assessment of anti-C. difficile interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of colonization, toxin production, and host response.
- Screening: Enables reproducible, quantitative assessment of bacterial load and clinical disease metrics.
- Analytics: Provides colony-forming unit enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological scoring for comparative analysis.
- Translational Research: Models chronic infection and recovery, aligning with human CDI for biomarker and efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, genetically tractable platform adaptable to diverse therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in anti-infective development.
- Operational Value: Standardizes infection protocols and quantitative outputs for cross-study comparability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by modeling clinically relevant disease courses.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic candidates targeting CDI.
Implementation Considerations
- Requires expertise in anaerobic microbiology and animal handling.
- Demands access to specialized instrumentation for bacterial enumeration and histopathology.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of dosing and clinical monitoring protocols.
- Adaptable to different C. difficile strains and dosing regimens with outcome-dependent considerations.
- Model outcomes are sensitive to inoculum preparation and strain selection, impacting reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Inoculation of Mice with Clostridium difficile
3:22
Enumeration of C. difficile from Mouse Fecal Content
5:03
Results: The Murine Model of C. difficile Infection Demonstrates Significant Weight Loss, Bacterial Colonization and Histopathological Changes in Infected Mice
6:10
Conclusion
