Name: SAXSビームライン上のオンラインサイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: 学ぶオンラインSEC・IECをSAXSビームラインに統合する手法。タンパク質の変性を防ぎ、構造生物学における低分解能モデルデータの品質を向上させ、精密な構造解析を可能にする。

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フランスの助成金REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014からのプロジェクトへの財政的支援と、Service de Santé des ArméesおよびDélégation Générale pour l'Armementからの研究助成金に感謝します。SAXSビーム時間については、ESRFに感謝しています。Andrew McCarthy氏、Gordon Leonard氏、Wim Burmeister氏、Guy Schoehn氏には、財政的および科学的な支援に感謝します。

<ol><li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+%28SAXS+and+WAXS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li>
<li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li>
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<li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+solution+scattering+%28SAXS%29+combined+with+crystallography+and+computation%3A+defining+accurate+macromolecular+structures%2C+conformations+and+assemblies+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).</li>
<li>Vestergaard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+biostructural+changes%2C+dynamics%2C+and+interactions+-+Small-angle+X-ray+scattering+to+the+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue.</a> Arch. Biochem. Biophys. , (2016).</li>
<li>David, G., Pérez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography%3A+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).</li>
<li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Pipeline+for+Purification%2C+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
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<li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+GH3.+12+protein+conformation+through+HPLC-integrated+SAXS+measurements+combined+with+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).</li>
<li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).</li>
<li>Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+ion-exchange+chromatography+for+small+angle+X-ray+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst%22%5BJournal%5D)">Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering.</a> Acta Cryst. , (2016).</li>
<li>Selkirk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Purification+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ion-exchange chromatography.</a> Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).</li>
<li>Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+exchange+chromatography+of+proteins+and+clearance+of+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).</li>
<li>Pernot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upgraded+ESRF+BM29+beamline+for+SAXS+on+macromolecules+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Synchrotron+Radiat%22%5BJournal%5D)">Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution.</a> J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).</li>
<li>Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+evolution+of+the+archaeo-eukaryotic+primase+superfamily+and+related+palm-domain+proteins%3A+structural+insights+and+new+members%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).</li>
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<li>Hutin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+vaccinia+virus+helicase-primase+D5%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5.</a> J. Virol. , 4604-4613 (2016).</li>
<li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioSAXS+Sample+Changer%3A+a+robotic+sample+changer+for+rapid+and+reliable+high-throughput+X-ray+solution+scattering+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

多くの巨大分子は、クロマトグラフィーを用いて、最終的な精製工程は、良質のデータセットを取得するためにSAXSデータ収集の前に必要とされます。しかしながら、全てのサンプルは安定したままで、彼らは、オリゴマー化状態の混合物に凝集または再平衡化する傾向があります。したがって、ビームラインの最終オンライン精製工程は、最高の品質のSAXSデータを得るために、精製し、データ収集の間の時間を最小化するために必要とされます。関心対象のタンパク質の生物物理学的特性に依存して、SEC-SAXSまたはIEC-SAXSは、最適なサンプル品質が得られるように選択されるかもしれません。ここでは、ヘリカーゼ/プライマーゼD5由来タンパク質構築に、両方の技術を説明し、議論されています。 SEC-SAXSデータの取得は、より多くの標準化になって、多くのBioSAXSビームラインで使用可能です。データ分析、特にバックグラウンド減算は、比較的単純で簡単です。しかし、安定したバッファ信号そして、高分子種の十分な分離が不可欠まま。したがって、完全にカラムを平衡化するのに十分な時間を確保することが重要です。この方法の失敗は、目的のタンパク質と同様のサイズ、低濃度、および放射線に敏感なバッファの永続的な汚染物質であることができます。 実際には、最初に、SEC-SAXSは、ほとんどの高分子試料のための選択の方法として使用される可能性があります。それでも、多くの精製プロトコルは、汚染物質または凝集の存在による前IECステップを必要とします。各濃縮およびクロマトグラフィー工程は、試料（30〜50％と推定される）と、時間の損失と関連していることを考えると、直接IEC-SAXSが有利です。 SECによって精製することができないサンプルについては、原因で同様の大きさの「汚染物質」の存在又はそれが必要な濃度で激しく集約、IEC-SAXSは、常により良い適したアプローチになるので、それをすること。また、より高い流量がサポート多くのIECカラムによって精製および測定間の通過時間を減らすのを助けることができます。ここで紹介する例では、IECは慎重に塩濃度のステップを選択することにより、汚染物質からD5 323から785の近いピークの分離を可能にする段階溶出で使用されました。原理的には、ステップの数は無制限ですが、実用上、ピークごとに少なくとも1ステップが必要であり、あまりにも多くはないが選択されるべきです。上述の背景差分法の場合は、一致するものを見つけるために別のバッファ組成物の比較的高い数を測定することが重要です。 両方の技術の共有欠点は、正確なタンパク質濃度情報の欠如です。これにより、前方散乱に基づいた正確な質量決意は不可能です。このようなD5 323から785のような球状タンパク質の場合、Porod量はあまり正確で、質量推定いえますが、非常に柔軟なまたは無秩序なタンパク質のために、代替手段を提供します、このアプローチは有効ではありません。 ここで提示段階的勾配IEC-SAXS法の変化ではなく、線形勾配を使用することです。段階的溶出を用いてサブピークを単離するために、所望の直線勾配法で、完全にSAXSを開始する前にピークを分離するために慎重に勾配条件を最適化するために必要とされることは、多くのステップで動作することが可能であるが実験。このアプローチでバックグラウンド減算は、フレーム単位に行うことができ、個々のフレームを比較することにより確認することができ、それは、より高度なデータ処理を必要とし、専用のソフトウェアがまだ存在していません。 それは巨大分子種の分離を決定するなどの適切な列の選択は、両方の技術のために重要です。イオン交換カラムは、種類や濃度が変化しながら、サイズ排除カラムは、充填容量、分離可能な巨大分子のサイズ範囲、および解像度が異なりますその固定化された電荷の。 ここで紹介するプロトコルはESRFビームラインBM29に固有のものですが、他のSAXSビームラインへの適応は、原理的には、簡単です。主な要件は、作成することができる十分に高いX線束秒以下の範囲内で合理的な信号対ノイズデータを取得するための適切な検出器（理想的には単一光子計数）、およびオンライン液体クロマトグラフィーシステムでありますグラデーション。正確な実装は、もちろん、ローカルビームラインの環境に依存します。 2つの方法を使用してD5 323から785に得られた結果が若干異なります。回転半径は、SECデータよりもIECデータに対して僅かに小さく、かつ散乱曲線の極小値は、わずかに大きい散乱ベクトルにシフトされます。これは、IEC-SAXSで測定D5 323から785は、SEC-SAXSでもう少しコンパクトD5 323から785よりも測定されることを意味します。これは、bの可能性がありますSEC精製したサンプル中の汚染物質への精製および測定の間の時間における試料調製の違いに起因する電子（IECが高速です）、または、可能性が低いです、。両方の方法で完全に独立して得られたビーズのモデルは（ 図1H）程度です。 D5 323から785までは期待中空、六量構造18を示しています。 結論として、オンラインイオン交換およびオンラインサイズ排除クロマトグラフィーは、SAXS 6,7,9-12,25,26に直接結合することができる重要な生化学的精製法です。 IEC-SAXSデータのバックグラウンド減算は、SEC-SAXSのためのよりもわずかに困難とあいまいですが、それにもかかわらず可能です。目的のタンパク質の生物物理学的特性に応じて、SECおよびIEC-SAXSの両方が固有の利点を有する種の分離の最適化を可能にします。検証ステップは、（説明したように）正確に観察されること、得られたデータを分析することができるウィットを提供H自信、およびモデルは、コミュニティ内で利用可能な標準ツールを使用して決定することができます。一緒に、両方の技術は、標準的な静的測定を介してアクセスされないデータを得、生体高分子の広い範囲のためのオンライン分離を可能にします。

BioSAXSは、ナノサイズの物体1-4の形状を決定するための強力なツールです。 nmの範囲内の大きさの巨大分子を含む溶液によるX線の散乱は、非常に低い角度で記録されます。この角度範囲は、グローバルパラメータに関する情報が含まれています：回転半径を、最大の粒子内の距離。粒子形状。そして、折りたたみ、変性、または障害の程度。技術は、結晶を必要とせず、高分子が溶液中に留まり、従って、例えば、これらの要因の知識を判断するのに役立つ可能性がある等のイオン強度、pH、などの細胞の特定の重要なパラメータを模倣する条件下で維持することができ、または、目的のタンパク質の生理学的に関連性のオリゴマー状態は、複合体の提案モデルの妥当性を検証します。異なる緩衝液条件でのタンパク質 - タンパク質相互作用の特徴付け、不足しているドメインのモデルの作成、相同性モデルの改良、およびデ個別の折り畳まれ展開状態の終了を迅速かつ容易5行うことができます。 未解釈のデータを生じ得る凝集または変性試料は、粒子の混合物を、不均質サンプル、放射線損傷、およびバッファの不一致：任意の技術と同様に、BioSAXSは、固有の弱点を有しています。多くの分析法のために、暗黙のうちに、試料は、実際に得ることはしばしば困難である要件は、単分散であることが想定されます。多くの場合、サンプルの分解は微妙であり、独自のデータで検出することができず、データを解釈しようとすると、不正確な、あるいは誤った結果を与えます。これらの障害を克服するために、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）およびSAXSの組み合わせは、データの品質を保証するために、ますます困難試料6-11については、この技術をよりアクセス可能にする多数のビームライン上で実施されました。最近、我々はオンラインでのイオン交換を開発することによって、レパートリーに新しいメソッドを追加しましたクロマトグラフィー（IEC）は、SAXS 12共役型。両方の技術は分析する以前は不可能生物学的粒子の広い範囲にSAXSを開いています。使用する方法の選択は、目的の粒子の生物物理学的特性に依存します。 SECは、見かけの分子量の少なくとも10％の差が分離のために必要とされるサイズ、によって高分子を分離します。カラムとサンプルの生理学的特性の物理的な限界は、疎水性表面、柔軟性、および安定性の欠如のように、また、データの収集、分析、および解釈を複雑にします。 従って、それらの電荷に基づいて分子を分離し、イオン交換クロマトグラフィーは、IECカラムへの結合親和性は、代わりに、またはSECに加えて使用することができます。全電荷は容易に制御エルための比較的簡単な方法を提供し、pHを変化させる、または緩衝液の塩濃度を変化させることによって操作することができますIECカラムから分子のution。電荷を用いて、他の方法で分離することが困難であろう類似の種類や分子の大きさの分離は、IECで日常的に行うことができます。また、IECは、一つのタンパク質を変性させるの潜在的リスクを伴う濃縮工程を回避することができ、希釈した試料を扱うことができるという利点を有します。電荷分布は非常にサンプルに依存しているとして残念ながら、IECは、pHや塩濃度13,14についての最適化が必要。 発現、精製、またはその両方することは困難であり、多くのタンパク質については、サンプルの唯一の低量は勉強するために利用可能です。効率的であることがあり、したがって、損失を精製工程の数を最小化しすることが重要です。この理由のために、最後の精製工程は、良好なデータセットを収集する可能性を高めるために、従来のSAXSデータ取得に直接オンラインです。 ここに、我々は提示し、オンラインSEC-SAXSとIEC-SAXSを比較します。両方の技術はグルノーブル、フランス15の欧州放射光施設（ESRF）でBioSAXSビームラインBM29上に実装されました。テストケースとして、我々は他の方法を用いて構造的に分析することはかなり困難であったワクシニアウイルスタンパク質D5のD5Nおよびヘリカーゼドメインを使用していました。ワクシニアウイルスは、ポックスウイルス科のファミリーのメンバーであり、痘瘡ウイルス、天然痘の原因98％同一です。ワクシニアシステムを使用して、我々は本質的なヘリカーゼプライマーゼD5にここに焦点を当て、複製機構を研究しています。 D5は、システインクラスター領域（解像度。240から345）16に続いて、N末端archeo-真核生物ゼ（AEP）ドメイン16と95-kDaのタンパク質です。さらに（RES。460から785）C末端がD5Nドメイン常にD5型ヘリカーゼと関連している（RES。340から460）、そして最後にスーパーファミリー3（SF3）ヘリカーゼドメインを来に向けて17（FigurEの1A）。 D5のヘリカーゼドメインはタイトなDNAへの結合のために必要とされる六量体環構造を構築します。最近SAXSおよびEM研究のおかげで、プライマーゼおよびヘリカーゼドメインの低解像度構造は、現在18知られています。 ここでは、D5のC末端断片（残基323から785）の構造への洞察を得るためにESRFでBioSAXSビームラインBM29上に実装され、オンラインでのクロマトグラフィー技術を使用する方法を示しています。

<table><tbody><tr><td>1,4-ジチオスレイトール [DTT]</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td></td></tr><tr><td>10% Mini-PROTEAN TGX プレキャストタンパク質ゲル</td><td>Biorad</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>F 548</td><td></td></tr><tr><td>酢酸氷河</td><td>VWR ケミカルズ (BDH Prolabo)</td><td>20104.298</td><td></td></tr><tr><td>アガロース D-5</td><td>Euromedex</td><td>LF45130653</td><td></td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-15遠心フィルターUltracel -30K</td><td>Millipore Ltd</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>Euromedex</td><td>EU0400-D</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagene</td><td>70750-3</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>8122</td><td></td></tr><tr><td>完全プロテアーゼ阻害剤カクテル&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11231400</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10 DG 脱塩カラム</td><td>Bio-rad</td><td>732-2010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>VWR ケミカルズ (BDH Prolabo)</td><td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Euromedex</td><td>26-128-6405-C</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Roche</td><td>656313</td><td></td></tr><tr><td>HisSelect HF ニッケルアフィニティーゲル</td><td>シグマ</td><td>H0537</td><td></td></tr>塩<tr><td>酸(HCl)</td><td>VWRケミカルズ(BDH Prolabo)</td><td>20252.295</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>AppliChem Panreac</td><td>A1073,0500</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>LBブロスMiller</td><td>Fluka Analytical</td><td>L3152</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</sub</td><td>>ICN Biomedicals Inc.</td><td></td><td></td>191421</tr><tr><td>NaCl</td><td>VWRケミカルズ(BDH Prolabo)</td><td>27808.297</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>Fermentas</td><td>ER0571</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21 Star(DE3)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C6010-03</td><td></td></tr><tr><td>pProEx HTb ベクトル&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>10711018</td><td></td></tr><tr><td>プライマー</td><td>&nbsp;Eurofins mwg operon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel extraction kit</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kid</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel stain</td><td>Invitrogen life technology</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TEV</td><td></td><td></td><td>home made</td></tr><tr><td>TOP 10</td><td>Invitrogen life technology</td><td>C404003&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>ユーロメデックス</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td>宇野Q 1Rコラム&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>720 0011</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>MPBiomedicals, LLC</td><td>194834</td><td></td></tr><tr><td>名</td><td>企業名</td><td>strongカタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビームライン制御ソフトウェアBsXCuBE</td><td>ESRF</td><td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td><td>local development</td></tr><tr><td>Camserver software</td><td>Dectris</td><td>n.a.detector</td> <td>control software</td></tr><tr><td>DAMAVER</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>program to align ab initio models&nbsp;</td></tr><tr><td>DAMMIF</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>ab initioモデル再構築プログラム</td></tr><tr><td>HPLCプログラム Biologic Duo Flow</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLCプログラム LabSolutions</td><td>島津</td><td>製作所 n.a.ISPyB</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ESRF</td><td>De Maria Antolinos et al. (2015).Acta Cryst. D71、76から85。</td><td>ローカル開発</td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>プログラムは、実験的なSAXS</td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>DeLano Scientific LLC</td><td>の操作を実行します https://www.pymol.org/</td> <td>視覚化のための</td></tr><tr><td>ソフトウェア SUPCOMB</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>3D構造を重ね合わせるプログラム</td></tr><tr><td>Name</td><td>会社<</td><td>strong>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Duo Flow</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Biofracフラクションコレクター</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLCシステム</td><td>島津製作所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labsonic P</td><td>Sartorius Stedimバイオテクノロジー</td><td>BBI8535108</td><td></td></tr></tbody></table>

saxsビームライン上のオンラインサイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィー

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

生物学的な小角X線散乱（BioSAXS）を溶液構造、粒子のサイズおよび形状、および高分子の表面対体積比を決定するために使用される分子および構造生物学における強力な技術です。技術は、濃度、pH値、イオン強度、温度、添加剤などの広範囲にわたる溶液条件の非常に広範囲に適用可能であるが、試料が単分散であることが必要です。この警告は、SAXSのビームライン上の液体クロマトグラフィーシステムの導入につながりました。ここでは、ビームラインにサイズ排除（SEC）、イオン交換クロマトグラフィー（IEC）の上流の統合を説明する、最適なバックグラウンド減算、およびデータ整理のための種々の方法。例として、我々はD5Nヘリカーゼドメインからなる、本質的なワクシニアウイルスタンパク質D5の断片上sec-およびIEC-SAXSを使用方法について説明します。我々は番目の六量体構造を示し、その全体的な形状及び分子量を決定しますEタンパク質。

モデルフリー不変分析の結果を表1に記載されています。 D5 323から785 SEC-SAXSデータの分析は、338 kDaの対345キロダルトンの（Porod分析からの）分子量の推定値を示し、IEC-SAXSを用いて観察しました。両方とも、ヘキサマーのための6倍の53.5キロダルトン（321キロダルトン）の予想質量と一致しています。両方のデータセットの第一原理モデリングはなし課さ対称で行われた（SEC-SAXS：χ2 = 0.88、IEC-SAXS：χ2 = 3.1）とC6の対称性を用いて、（SEC-SAXSを：χ2 = 1.0、IEC-SAXS ：χ2 = 4）。両方の再構成のための散乱データの全体的な適合が、両方の場合（ 図1D及びE）に匹敵するように、C6対称性を仮定することができます。したがって、このモデルは、部分的に（SEC遮ら表示され、中央チャネル、と六角形の円錐状の構造に対応します。 図1F; IEC： <str>図1H）。平均化の前に、個々のモデルの検査は、この障害は、平均化処理のアーチファクトである可能性が高いことを示しています。 </str><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg"> 図1：SAXS データ分析およびD5 323 -785（参考文献12および18から適応図） の比較 。 D5タンパク質とD5 323から785のA）概略ドメイン構造。 B）3のピークの表示とオフラインイオン交換クロマトグラム。オレンジ色の曲線：280nmの（AU）、青色の曲線の吸光度：ピークのバッファBのバッファB.パーセンテージの割合が示されています。 C）オンラインイオン交換クロマトグラム。 B.のようにカラーキーはさらに、測定された強度は、緑色で表示されます。実験的散乱曲線aND SEC-SAXS D）及びIEC E）D5 323から785までのデータの解析によって得られたモデルの曲線を計算しました。 SECデータとG）IECデータに基づいて、D5 323から785のF）ビーズモデル。 SECおよびIECモデルのH）オーバーレイ。 F内のパネル）Hへ）は、分子可視化ソフトウェア24を使用して作成されました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> データ収集パラメータ </td><td></td></tr><tr><td>楽器： </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td>波長（Å） </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Q-範囲（Å-1） </td><td> 0.0032から0.49 </td></tr><tr><td>サンプル・ツー・検出器までの距離</td><td> 2.864メートル</td></tr><tr><td>露出時間（秒） </td><td>フレームあたり1 </td></tr><tr><td>濃度域</td><td>ナ</td></tr><tr><td>温度（K） </td><td> 293 </td></tr><tr><td>検出器</td><td>ピラトゥス1M（Dectris） </td></tr><tr><td>フラックス（光子/秒） </td><td> 1×10 12 </td></tr><tr><td>ビームサイズ（μmの2） </td><td> 700×700 </td></tr><tr><td> D5 323から785、SECのための構造パラメータ </td><td></td></tr><tr><td> I 0（-1）[ギニエから] </td><td> 0.0237 </td></tr><tr><td> RG（Å）[ギニエから] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> R gの最小 Q -ギニエに使用Q 最大 R gの</td><td> 0.77から1.24 </td></tr><tr><td> D 最大 （Å）[P（R）から] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> P（R）（Å-1）のために使用されるQ-範囲</td><td> 0.02から0.17 </td></tr><tr><td> Porod体積V P（A 3）[散布から] </td><td> （570±5）10×3 </td></tr><tr><td>分子質量M R（kDaの）[V pから] </td><td> 345 </td></tr><tr><td>シーケンスから計算された単量体氏（kDaの） </td><td> 321 </td></tr><tr><td> D5 323から785、IECのための構造パラメータ </td><td></td></tr><tr><td> I 0（-1）[ギニエから] </td><td> 0.386 </td></tr><tr><td> RG（Å）[ギニエから] </td><td> 46.5±0.1 </td></tr><tr><td> R gの最小 Q -ギニエに使用Q 最大 R gの</td><td> 0.44から1.29 </td></tr><tr><td> D 最大 （Å）[P（R）から] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> P（R）（Å-1）のために使用されるQ-範囲</td><td> 0.03から0.18 </td></tr><tr><td> Porod体積V P（＆＃197; 3）[散布から] </td><td> （577±5）10×3 </td></tr><tr><td>分子質量M R（kDaの）[V pから] </td><td> 339 </td></tr><tr><td>シーケンスから計算された六量氏（kDaの） </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> 表1：SAXS データパラメータ。テーブルには、SAXSデータ収集と分析のパラメータをまとめたものです。

小角X線散乱（SAXS）によるタンパク質の溶液構造の決意は、単分散のサンプルを必要とします。オンラインサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）とオンラインイオン交換クロマトグラフィー（IEC）：ここでは、2つのサンプル調製およびデータ収集の間の最小遅延を保証する可能性を提示します。

SAXSビームライン上のオンラインサイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィー

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

小角X線散乱ビームラインにオンラインサイズ排除クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーを実装する全体的な目標は、サンプル調製とデータ取得の間の遅延を最小限に抑えることにより、より高品質の低分解能モデルデータを取得することです。これらの方法は、構造生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。半径演算と同様に、最大特定内距離、粒子形状、折り畳み変性または乱れの程度。SAXSには、モル分散したサンプルが必要です。この手法の主な利点は、精製から測定までの時間が短いため、サンプルの変性や付着を防ぐことができることです。ビームライン施設に行く前に、既報の方法を用いて濃縮試料を調製し、SEC試験を実施してください。ビームライン施設では、1.5mLの反応管に1mLのゲルろ過バッファーを入れます。次に、ゲルろ過バッファーのボトルを、SAXSセットアップのフロースルーキャピラリーに沿ってHPLCシステムに接続します。流量、最大カラム圧力、および取得時間を設定します。カラムがない場合の背圧に注意してください。ラインをパージし、サイズ除外クロモトグラフィーカラムを接続して平衡化します。1ミリリットルのバッファーサンプルをサンプルチェンジャーにロードします。実験ハッチを出て固定またはイントラロックし、サンプルチェンジャーモードでビームライン制御ソフトウェアにログインします。サンプルチェンジャー内のバッファーサンプルをSAXSフロースルーキャピラリーに直接送ります。SAXSの試験を短時間実行し、音波X線散乱強度に放射線損傷の兆候がないことを確認します。ビームライン制御システムをHPLCモードに切り替え、フルHPLC SAXSシステムを介してバッファーのSAXS試験を実行します。データが最初の測定値と一致しない場合は、再平衡化して別のテストを実行します。次に、実験室で、タンパク質サンプルを13, 000倍Gで10分間遠心分離し、凝集体を除去します。上清をHPLC対応ガラスバイアルに移します。バイアルをオートサンプラーにロードし、サンプルの位置をメモします。ハッチをインターロックし、ビームライン制御システム内に実験データ用のフォルダを作成します。次に、HPLCソフトウェアで[Quick Batch]をクリックします。ファイルパスを設定し、UV-Visデータの自動ASCII変換をアクティブにします。注入量とサンプル位置をオートサンプラーに入力します。[開始] をクリックして、実行をキューに追加します。ファイル名を入力しますが、まだ[保存]をクリックしないでください。ビームライン制御ソフトウェアで、SAXSデータの収集時間がHPLC取得時間よりわずかに長くなるように、データフレーム数を設定してください。ビームラインのシャッターを開け、SAXSデータの収集を開始します。HPLCソフトウェアに切り替え、保存をクリックしてサンプルを注入します。紫外可視データの取得開始時のフレーム番号をメモし、合計された強度を経時的に監視します。サンプル調製中に、25ミリモルから1モルまでの線形塩化ナトリウムグラジエントを使用してIECテストランを実行します。対象のピークごとに、移動相中の高塩バッファーBの対応する量を決定します。IEC SAXS実験を開始するには、バッファーAとBのサンプルを1ミリリットル確保し、バッファーをHPLCシステムに接続します。HPLCパラメータを設定し、システムをパージし、低塩分バッファーA.イオン交換カラムをバッファーA.A.バッファーA.1ミリリットルのサンプルをサンプルチェンジャーにロードして、ラインをフラッシュします。ハッチをインターロックし、サンプルチェンジャーモードで各バッファーサンプルに対して短いSAXSテストランを実行して、放射線損傷に対するバッファーの感受性を確認します。次に、HPLCモードに切り替えて、バッファーAに対して別のSAXSテストを実行します。散乱パターンをサンプルチェンジャーテストランから得られたパターンと比較します。次に、実験データ用のフォルダを作成します。次に、高塩分バッファー B が 0% から始まり、2 カラム容量の間隔で 5% 増加してバッファー B が 100% に達する HPLC グラジエントを段階的に設計します。サンプルを注入しない 1 回のグラジエント分析を設定します。ビームラインシャッターを開けてSAXSデータ収集を開始し、HPLC運転を開始します。UV 可視化データの収集が開始されたときの経過フレーム数に注意してください。データ収集後、合計強度が少なくとも100フレームにわたって一定であり、バッファーAおよびBのサンプルから得られた値と一致することを確認します。次に、ゼロパーセントバッファーBから始めて、別のステップワイズグラジエントHPLC法を作成しますオフラインIECグラジエントテストランで決定された各パーセントB値のステップを作成します。これらの各値の 1 パーセント ポイント下と 1.5 ポイント上にグラデーション ステップを追加します。各ステップ間隔を2.5カラム容量に設定し、グラジエントの最終ステップを100%に設定します B.必要に応じて上清を希釈してバッファーの組成を達成します A.HPLCポンプを停止し、カラムチューブを検出器から外し、ラインの端をコンテナに入れてカラムの流れを収集します。次に、バッファーAラインを希釈したサンプルに移し、チューブ内に気泡が閉じ込められないようにします。ポンプを始動して、サンプルをカラムに引き込みます。サンプル容器がほぼ空になったら、ポンプを停止し、バッファーAボトルをラインに戻します。ポンプを始動し、バッファーAをカラムに通して2カラム容量分だけ流してから、ポンプを停止してカラムを検出器に再接続します。新しいステップワイズメソッドを使用して、自動サンプル注入なしで 1 回の HPLC ランをセットアップします。ビームラインシャッターを開き、SAXSおよび紫外可視データを取得します。合計された強度を経時的に監視します。次に、後処理ソフトウェアを使用して、HPLCデータをASCII形式に変換します。オンラインデータマネージャーを使用して、サンプル溶出ピークに対応するSAXSフレームを特定します。ギイレーション半径がピーク全体で安定していることを確認します。ピークフレームをSAXSデータ処理プログラムにインポートし、平均未補正散乱曲線を作成します。SCC SAXS の場合、平均バッファーの高 Q 領域が、補正されていない散乱曲線だけでなく、自動減算されたフレームをピークからロードしてスケーリングし、系統的な違いがないことを確認します。すべての曲線を平均化して、最終的な SAXS 曲線を求めます。IEC SAXS の場合、各グラデーション ステップから平均 50 フレーム。これらの平均を未補正曲線と比較し、最も高いQ一致が最適な勾配ステップを選択します。選択した平均を補正されていない曲線から減算して、最終的な SAXS 曲線を作成します。最後に、ペアの距離分布を決定し、ab initioモデリングを実行して、タンパク質の最も代表的なモデルを決定します。D5タンパク質のSECおよびIEC SAXSから得られた構造データパラメータは非常に類似していました。分子量の推定値は、どちらも予測質量と一致していました。Ab initioモデリングは、強制対称性を持たず、C6対称性で実行されました。どちらのモデルも実験データと互換性があり、タンパク質構造がC6対称性を持っていることを示しています。分子モデリングにより、部分的に閉塞した中央チャネルを持つ六方晶ピラミッドのような構造が得られます。平均化されたSECモデルとIECモデルは非常に似ていました。個々のモデルを調べたところ、チャネルの障害物は平均化プロセスのアーティファクトである可能性が高いことがわかりました。SAXSは、より合理的で標準的になりつつありますが、凝集体や汚染物質を取り除くために必要な多くの精製やその他のイオン交換クロモトグラフィーステップに使用されています。このプロトコルでは、バイオ SAXS ビームライン上でのオンライン サイズ排除クロモトグラフィーとオンライン イオン交換クロモトグラフィーの両方の手法を紹介しました。どちらの手法にも共通する注意点は、正確なタンパク質濃度がわからないため、分子量の散乱を決定できないことです。しかし、球状タンパク質の場合、質量体積を推定することはできます。ここでイオン交換クロモトグラフィーで使用したステップワイズグラジエントの代わりに線形グラジエントを適用する場合がありますが、これにはピークを最適に分離するためのバッファー条件の最適化が必要です。これらの技術により、複雑なシステムでも高品質なSAXSデータを収集することができます。

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陽イオン交換クロマトグラフィー:正味表面電荷に基づいて昆虫細胞溶解物から標的組換えタンパク質を単離する技術

このビデオでは、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)とマルチアングル光散乱(MALS)の能力を活用するSEC-MALSについて説明しています。SEC-MALSでは、SECはタンパク質またはタンパク質複合体をそのサイズに基づいて分離し、MALS検出器は分子によってさまざまな角度で散乱された光の強度を測定することにより、平均分子量を決定します。...

タンパク質オリゴマーのためのマルチアングル光散乱を用いたサイズ排除クロマトグラフィー(英語)

ひと脳脊髄液 (CSF) の内因性ペプチドの質量分析法である. します。分子量カットオフろ過、クロマトグラフィーによる事前分別、質量分析、ペプチドの同定戦略の後の組み合わせを採用し、約 10 倍に比べて知られている CSF...

ひと脳脊髄液中の Endopeptidomic の分析のための試料作製

ここでは、いくつかの放射光ビームラインで自動スクリーニングおよびデータ コレクションは、使用可能なオプションを使用する方法をについて説明します。科学者が、放射光に冷凍サンプルを送る回折特性を上映、データ...

完全自律型の特性と生体高分子の結晶からのデータ収集

このプロトコルでは、蛋白質、蛋白質の複合体、および異種サンプル中のペプチドの正確なモル質量決定の多角度光散乱と特異性の高いイオン交換クロマトグラフィーの使用について説明します。このメソッドは、ネイティブのオリゴマー、電荷変形および混合蛋白質のサンプルの特性、品質評価法に関する貴重なです。...

イオン交換クロマトグラフィー (IEX) 蛋白質の分離とキャラクタリゼーションの多角度光散乱 (MALS) に結合

マイクロトームを用いて汎用性の高い解起性BN-MSプロトコルを高解像度の複合プロファイリング用に提示する。...

クライオスライシングBN-MS解析による高解像度複合プロファイリング

SEC-BioSAXSの生体高分子の測定は、高分子とその複合体の溶液構造を決定するための標準的なアプローチです。ここでは、一般的に発生する2種類のSECトレース(完全に解決されたピークと部分的に解決されたピークを持つクロマトグラム)からのSEC-BioSAXSデータを分析します。散布図とBioXTAS...

EFAデコンボリューションとスキャッタによるSEC-SAXSデータの分析

ここでは、長波長高分子X線結晶構造解析実験のために、ダイヤモンド光源のビームラインI23上の真空端局への極低温サンプル調製および結晶の移送のためのプロトコルを提示する。...

ダイヤモンド光源におけるビームラインI23上の真空中長波長結晶構造解析のためのサンプル調製および移送プロトコル

コンフォメーションの柔軟性は、タンパク質の機能に重要な役割を果たしています。本明細書において、我々は、規則及び不規則タンパク質に機能を駆動急速な構造変化をプロービングするための水素 - 重水素交換に結合された時間分解エレクトロスプレーイオン化質量分析法の使用を記載しています。...

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

正確に高分解能質量分析計を接続した液体クロマトグラフィーによる定圧ラベリング、広範な分別、バイオインフォマティクス...

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

学ぶオンラインSEC・IECをSAXSビームラインに統合する手法。タンパク質の変性を防ぎ、構造生物学における低分解能モデルデータの品質を向上させ、精密な構造解析を可能にする。

SAXSビームライン上のオンラインサイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィー

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