Name: プランジ凍結：透過型電子顕微鏡での懸濁細胞の超微細構造と免疫学的研究のためのツール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: 学ぶプランジ凍結法による懸濁細胞の透過型電子顕微鏡観察。凍結置換で細胞構造を完全に保存し、超微細構造と免疫局在解析に有用な低コスト技術です。

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私たちは、原稿上の彼らの助けとコメントのためにM. Bouchecareilh、E.Tétaud、S. Duvezin-Caubet、およびA.デヴィンへの感謝の意を表明します。私たちは、画像が撮影されたボルドーイメージングセンターの電子撮像ポールに感謝しています。この作品は、センター国立デラRECHERCHE科学研究によってサポートされていました。

ホルムバールグリッドフィルムの調製注：個人用保護具（手袋、白衣、メガネ）を使用して、ヒュームフードの下でクロロホルム操作を実行します。 400のメッシュの電子顕微鏡銅グリッドを使用してください。他のグリッドタイプ（他のメッシュサイズ、金とニッケルグリッド）で、凍結の品質が悪化しています。 <ol><li>クロロホルム中の0.3％ホルムバール100mLの溶液を調製します。それは、攪拌せずに一晩溶解させます。 </li><li>アセトンを含有するガラスバイアル（高さ3センチメートル及び径2a CM）中で400メッシュ（平方インチ当たりの穴の数）電子microscopycopperグリッド（直径3.05ミリメートル）を置きます。手の円運動でガラスバイアルをかき混ぜます。プラスチック製のトランスファーピペットを用いてアセトンを除去します。溶剤を5分間蒸発させます。濾紙上にそれらを注ぐことによって、グリッドを転送し、それらを5分間乾燥させます。 </li><li>滑り/光沢まで、糸くずの出ない布で拭いて76×26 mm 2のスライドガラスを研磨します。</li><li>晶析装置（直径15センチメートル、高さ：7 cmであり、容量1200 ml）に取り、蒸留水で縁にそれを埋めます。ほこりを取り除くために二回表面にガラス棒を渡して、水面を清掃してください。 </li><li>二本の指の間にガラススライドを持ち、数秒間ホルムバール溶液中に浸し。 5分間逆さまにビーカーの下で乾燥するために直立それを保持。 </li><li>膜が乾燥しているときに、スライドから除去されるフィルムの限界を定義するために鋭利なカミソリの刃を用いてガラススライドのエッジのスコア。 </li><li> 深呼吸をして、わずかに不透明なフィルムをレンダリングし、その視認性を高めるために、フィルムの上や下に水蒸気の層を得るために、スライド上に大きく息を吐きます。 <ol><li>直ちに約30°の角度でスライドの底に触れることにより、晶析装置の水面上に膜をフロート。スライドからフィルム剥離をしようと晶析装置の水面上にそれをはがします。ゆっくりとフィルムをやってのけますピンセット、必要に応じて。 </li></ol></li><li>穏やかグリッドは適切な厚さ（約10nm）および皺なしである領域に水面に浮かぶ膜上伏せ置きます。 </li><li> 彼らは晶析装置の水面に浮くようジョセフ・ペーパーでグリッドを覆うことによりフィルムをピックアップ。 <ol><li>片手でジョセフ紙を持ち、フィルムの一端にジョセフ紙の一方の端をタッチします。ジョセフ紙が完全に湿潤するまでお待ちください。引っかかってグリッドとジョセフの用紙を取り除きます。 </li></ol></li><li>室温で使用する前に最終的な乾燥および保管のために覆われたペトリ皿で24時間グリッドを置き。 </li></ol>凍結置換培地の調製注：四酸化オスミウム（のOsO 4）および酢酸ウラニルは、有害化学物質です。白衣や手袋など、適切な個人用保護具（PPE）を着用したままヒュームフードでそれらを扱います。 Foll（のOsO 4）を取り扱うための安全警告および酢酸ウラニルOW。 OsO 4の漏れを避けるために、Oリングの凍結バイアルを使用します。 <ol><li> 超微細構造の研究 <ol><li>ガラスフラスコにガラスのOsO 4アンプルを入れてください。 </li><li>フラスコを振ってアンプルを破ります。 </li><li> 4％の最終濃度を得るために、アセトン100％の適切なボリュームを追加します。 </li><li>攪拌し、1.8 mLのクリオバイアルに1.5 mLのアリコートを分配します。 </li></ol></li><li> タンパク質の免疫標識 <ol><li>ガラスフラスコに酢酸ウラニルを0.05gを置き。 </li><li> 100％のアセトン50mlを加えます。 </li><li>マグネチックスターラーで溶液を攪拌します。溶液が透明になったとき、0.2μmのフィルターを使用してフィルタリングします。 </li><li> 1.8 mLのクリオバイアルに1.5 mLのアリコートを分注します。 注：プランジ凍結プロセスの前に、凍結置換媒体を含むクライオバイアルを準備し、-84℃の冷凍庫に保管してください。捨ててガラスフラスコを反転有害廃棄物中のOsO 4アンプル。 </li></ol></li></ol>細胞の調製注：このステップは、方法の成功のために重要です。全ての細胞型のために、細胞の指示された数を得るために、細胞を増殖させます。指定された時間および速度で示される管内の遠心分離機。 <ol><li>次のように異なる細胞型からのペレットの適切な整合性を得るために、細胞を増殖させます。 <ol><li> サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）及びシゾサッカロミセス・ポンベのために、最小または完全液体培地5mlに酵母を接種します。 28℃、回転（180 rpm）で一晩インキュベートします。一晩培養物の600nmで（OD 600）での光学密度を測定します。 0.2ミリリットル50新鮮な選択培地のOD 600に酵母細胞を希釈します。 1×10 9酵母細胞7を得るために、回転し、28℃で細胞をインキュベートし続けます。 </li><li> リーシュマニア鞭毛のために、イノ7.5％FCS（ウシ胎児血清）とAM培地5mlでculate寄生虫。 24℃、回転（180 rpm）で一晩インキュベートします。一晩培養物のOD 600を測定します。 0.2ミリリットル50新鮮な選択培地のOD 600に寄生虫細胞を希釈します。 5×10 8寄生虫セル12を得るために、回転し、24℃で細胞をインキュベートし続けます。 </li><li> トリパノソーマのために、10％FCSおよび30μgの/ mLのハイグロマイシンを用いてSDM-79培地5mLに寄生虫を接種します。 27℃、回転（180 rpm）で一晩インキュベートします。一晩培養物のOD 600を測定します。 50mLの新鮮な選択培地中で0.2のOD 600に寄生虫細胞を希釈します。 5×10 8寄生虫細胞13を得るために、回転、27℃で細胞をインキュベートし続けます。 </li><li> 大腸菌のために、100μg/ mLのアンピシリンを有するDYT培地5ml中の細菌を接種します。 （180回転、37℃で一晩インキュベートしますRPM）。一晩培養物のOD 600を測定します。 0.2ミリリットル50新鮮な選択培地のOD 600に細菌細胞を希釈します。 5×10 10細菌細胞14を得るために、回転し、37℃で細胞をインキュベートし続けます。 注：一晩のインキュベーション後、培養中の細胞は、いずれかの対数または定常増殖期にあってもよいです。経験的に決定されるように非常にゆっくりと成長している細胞株は、一晩、または細胞のより多くの接種より長いインキュベーション時間を必要とするかもしれません。 </li></ol></li><li>全ての細胞タイプについて、1500×gで3分間、50 mlのポリプロピレン製チューブと遠心分離機に細胞を含む培地を移します。 </li><li>上清を除去し、関連する細胞培養培地1ml中の全ての細胞型のペレットを再懸濁します。 </li><li>遠心3,900×gで1分間マイクロ遠心チューブ内の全ての細胞型。完全に上清を除去します。 </li><li>氷の上で細胞を保管してください。 </li></ol>注意：注意して液体窒素を処理します。 cryoglovesやゴーグルなどの個人保護具を使用してください。プロパンは、潜在的に爆発性であるため、風通しのよい部屋またはヒュームフードの下で液化を行います。裸火禁止は許可されません。 <ol><li>ポリスチレントレイに液体窒素の約150ミリリットルを入れました。それを凍結し、液体窒素中で真鍮カップ（高さ3.6センチメートル、径2a cmであり、厚さ1.5ミリメートル）を置きます。液体窒素は、真鍮のカップの中に浸透させないでください。 </li><li>気泡が真鍮のカップが凍結されていることを確認するために治まるまで待ちます。 </li><li>真鍮カップ壁に接触してプロパンボンベに接続されたホースを入れてください。 </li><li>ゆっくりプロパンボンベのバルブを開きます。 注：このステップで、プロパンは真鍮カップで液化します。 </li><li>プロパンボンベのバルブを閉じて、急速にガスホースを除去することにより、液状化を停止します。 </li><li>液体NIポリスチレントレーを充填真鍮カップの上部から5mmまでトローゲン。液体窒素は、真鍮のカップの中に浸透させないでください。 </li></ol>サンプルの5プランジ凍結<ol><li>ポリスチレントレイに液体窒素の約200ミリリットルを入れました。液体窒素でそれらを置くことによって少し真鍮カップ（高さ直径1.5cm 2.5センチメートルと厚さ1ミリメートル）を凍結。 1つの懸濁細胞のサンプルに対して一杯に入れました。サンプルを混在しないように注意してください。このため、 などカップ2、で、カップ1のサンプル2をサンプル1を置きます。 </li><li>液体窒素中でその先端を沈めることにより、ピンセットをフリーズします。 </li><li> 3.5で得られたペレット中の針を解剖ダブルエッジプランジ。 </li><li>ピンセットを使用して、セクション1で調製したホルムバールでコーティングされた400メッシュ銅顕微鏡グリッドを取ります。 </li><li>解剖針を使用して、グリッド上3.5で得られたペレットのドロップを置きます。異なる液滴サイズ（ 例えば、2、5、10μL）を試してみてください。 </li><li>非常に急速に液体プロパン遺伝子の中にピンセットで開催されたグリッドを急落4章で評価し、数秒間円運動でグリッドをかき混ぜます。 </li><li>急速にセクション5.1で凍結した小さな真鍮カップにピンセットで凍結されたグリッドを転送します。 注：各試料について、少なくとも3つのグリッドを作ります。必ず、銅グリッドを取る前にピンセットを凍結します。 </li></ol> 6.凍結置換注：四酸化オスミウムが潜在的に揮発性であるので、蒸気カートリッジと空気浄化呼吸器を使用します。プランジ凍結も解決される前に液体窒素中で固定液を凍結。 <ol><li>超微細構造研究のために、セクション2.1で調製した凍結置換培地を含有する1.8mLのクライオバイアル管を開きます。免疫局在研究のために、セクション2.2で調製した凍結置換培地を含有する1.8mLのクライオバイアル管を開きます。クライオバイアルのキャップを置きます。 </li><li>液体窒素中でその先端を沈めることにより、ピンセットをフリーズします。 </li><li>急速にキャップを外し、冷凍グリッドiを転送しますピンセットを使用してクリオバイアルNTO。 </li><li>バッククライオバイアルのキャップを置きます。 </li><li>各サンプルの各グリッドのための操作を繰り返します。 </li><li>すべてのキャップを閉め、サンプルを凍結置換培地中であることを保証するために手の円運動とクリオバイアルをかき混ぜます。 </li><li>凍結置換処理中に-84℃の冷凍庫に3日間気密ボックス内の凍結バイアルを置きます。 </li></ol> 7.サンプル温暖化<ol><li> 微細研究 <ol><li> -30℃の冷凍庫に（急激な温度上昇を回避するため）、ポリスチレントレーで凍結バイアルを運びます。 1時間-30℃の冷凍庫でそれらを置きます。 </li><li> 2時間にわたって-15℃のフリーザーで凍結バイアルを置きます。 2時間4℃でサンプルを置き、次いで室温で30分間インキュベートしました。 </li><li>プラスチック製のトランスファーピペットで凍結置換媒体を取り外します。 100％アセトンの約500μLを追加します。 </li><li>クライオバイアル1.8ミリリットルをかき混ぜます急速に円形の手の動きとを有するガラスバイアルにグリッド（高さ3センチメートル及び直径2cmに）を含むアセトン（1.5ml）に注ぎます。 </li><li>すべてのグリッドを転送してください100％アセトン1mLで同じクライオバイアルをすすぎます。手の円運動とクライオバイアルを攪拌し、ガラスバイアル中にクリオバイアルの内容を注ぎます。 </li><li> 10分間、100％アセトン3mLの3回各ガラスバイアルをすすぎます。 </li><li>参照15で説明したように埋め込み、封入手順に従います。 （25％、50％、および75％）アセトン中のエポキシ樹脂の濃度を増加させてサンプルを含浸し、ゼラチンカプセル中の100％のエポキシ樹脂と試料を埋め込みます。 </li></ol></li><li> 免疫標識の研究 <ol><li>ポリスチレントレイに1.8 mLのクリオバイアルを運ぶ-30℃の冷凍庫に（急激な温度上昇を避けるため）。 </li><li> -30℃の冷凍庫に2時間クライオバイアルを置きます。 </li><li> -30°で<html> Cフリーザーに入れ、手の円形の動きでクライオバイアルを攪拌し、ポリプロピレンバイアル（高さ5cmおよび直径1.5cm）に凍結置換媒体を急速に注ぐ。 </li><li>凍結置換培地を2 mlの新しい凍結置換培地で置換する。 </li><li>ポリプロピレンバイアルを-30℃の冷凍庫に2時間入れます。 </li><li>ポリプロピレンバイアルを100mLの2mLのアセトンで1時間、100mLの2mLのエタノールで3時間3回洗浄します。 </li><li>参考文献15に記載されているように、埋め込みおよび包含手順に従ってください。サンプルをアクリル樹脂（25％、50％、および75％アセトン）の濃度を増加させて含浸させ、サンプルを100％アクリル樹脂でゼラチンカプセルに包埋する。 </li></ol></li></ol> 8.サンプルの可視化<ol><li>埋め込み後、サンプルの80nm超薄切片をウルトラミクロトームで作製する。セクションを2％クエン酸鉛と室温で1分間対照するお尻= &quot;外部参照&quot;&gt; 15。 </li><li>切片15を観察するために80キロボルト又は120 kVの電子顕微鏡を使用します。 </li></ol>

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著者は、彼らが興味の競合がないことを宣言します。

TEMは、細胞小器官、細胞、および組織の微細構造観察するための強力な方法です。低温固定/凍結置換は現在、超微細構造とタンパク質の抗原性の両方の保全のための最善の方法です。化学固定剤は、超微細2の完全な安定化の前に構造的再編成を許可することにより、非常にゆっくりと浸透し、行動します。逆に、低温固定/凍結置換は瞬時に細胞構造4を安定させます。しかし、低温固定/凍結置換法は、それによってアプリケーションの彼らの範囲を限定する制約や困難の数が含まれます。これはサンプル、凍結成果物、技術、コスト、および機器の実現に関するものです。高圧凍結/凍結置換技術は、細胞の詳細の保存6,7の高度を可能にしました。これとは対照的に、PFはすでにOBSのために使用されていますアモルファス氷9の薄膜に懸架小さなオブジェクトをアービング。ここでは、超微細構造および免疫標識研究のためのPF /凍結置換法は、高...

サンプル調製は、電子顕微鏡検査の成功のために重要です。従来のEM固定は、透過型電子顕微鏡（TEM） 1の組織または細胞を固定するための主要な方法であった1 。まず、アルデヒドと四酸化オスミウムを用いて室温で材料を化学的に固定する。次いで、材料を有機溶媒で脱水し、浸透させ、エポキシ樹脂に包埋する。この方法は、細胞への固定剤の浸透率に依存する。結果として、アーチファクトおよび細胞内容物の抽出が通常観察される2 。 凍結融解は、明らかに、細胞構造3の保存のためのより良い選択肢であり、それらをそのまま維持する。薄い樹脂切片における最高品質のTEM画像4は、低温固定/凍結置換法を用いて得ることができる。この技術の目的は、ガラス化されたbiologicalサンプル氷晶形成せず、または細胞の超微細構造を損傷しない十分に小さな氷晶を含みます。 （HPF）を凍結高圧またプランジ凍結（PF）と呼ばれる超急速低温固定は、サンプルをcryofixするための2つの方法です。 HPFは瞬間セル内の分子を固定化し、従来のEM固定によって引き起こされる損傷を回避します。冷凍機や自動置換デバイスのいくつかのタイプが5を開発されています。冷凍機や消耗品（液体窒素等のキャリアを試料）は高価であり、それらは、高品質の電子顕微鏡写真6,7の製造を可能にします。 PFは、1950年代初期に使用された技術であり、PF手順を.During簡単で安価な8として文献に記載され、調製された試料は、氷の結晶が5nm未満3サイズ得るために急速に凍結されます。この目的を達成するために、サンプルがありますエタン、プロパン、エタンまたはプロパンの混合物として、液体寒剤に突入。 1950年代以来、PFの改善は、より多くのユーザーにこの技術を利用できるようにするために行われてきました。 PFは広く画像小さな物体（&lt;100 nmのに使用されるのに対し、高圧凍結は、現在、50ミクロン（ディスク状サンプルについて200μmの厚さまで）5よりも厚い試料の多種多様を凍結するための唯一の実行可能な方法であります）、アモルファス氷9の薄膜に懸濁高分子複合体など。より大きなサンプルは、例えば、真核細胞は、PFによってcryofixedすることができるが、そのようなキャピラリー銅管またはサンドイッチシステム8、10、11のように、試料ホルダーを必要とします。 ここでは、迅速で簡単に使用し、様々な懸濁細胞培養のために使用可能な低コストのプランジ凍結/凍結置換技術が提示されます。

<table><tbody><tr><td>グリッド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>T400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Formvar</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>プロパン N35</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダブルエッジ解剖針</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72947</td><td></td></tr><tr><td>クライオバイアル</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>61802-02</td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>19130</td><td></td></tr><tr><td>ガラスバイアル8.5mL</td>電子<td>顕微鏡科学</td><td>64252</td><td></td></tr>酢<tr><td>酸ウラニル</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>48851</td><td></td></tr>アセ<tr><td>トン</td><td>シグマ</td><td>32201</td><td></td></tr>エ<tr><td>タノール100%</td><td>シグマ</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td>VWR 国際</td><td>631-9439</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アクリル樹脂</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>104371</td><td></td></tr><tr><td>エポキシ樹脂 M</td><td>シグマ</td><td>10951</td><td></td></tr><tr><td>エポキシ樹脂 M 硬化剤</td><td>シグマ</td><td>10953</td><td></td></tr><tr><td>フタル酸ジブチル&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>エポキシ樹脂 M 加速器</td><td>シグマ</td><td>10952</td><td></td></tr><tr><td>晶析装置</td><td>フィッシャー 科学</td><td>08-762-9</td><td></td></tr><tr><td>ジョセフ ペーパー</td><td>VWR 国際</td><td>111-5009</td><td></td></tr><tr><td>真鍮カップ</td><td></td><td></td><td>自分でやる ショップ または自分で作った</td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shizosacharomyces cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leishmania amazonensis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>気密ボックス</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>7135-0001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>空気清浄マスク</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 7502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>呼吸器用カートリッジ</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 6001</td><td></td></tr><tr><td>Particulate filter</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 5N11&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

プランジ凍結：透過型電子顕微鏡での懸濁細胞の超微細構造と免疫学的研究のためのツール

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

透過型電子顕微鏡（TEM）は、タンパク質を局在化し、非常に高い分解能で高分子複合体を可視化するために、細胞の超微細構造を研究するための特別なツールです。しかし、本来の状態にできるだけ近い取得するには、完璧なサンプル保存が必要です。従来の電子顕微鏡（EM）アルデヒド固定、例えば、良好な超微細構造保存を提供しません。固定剤の遅い浸透は、様々な細胞成分の細胞の再編成および損失を誘発します。したがって、従来のEM固定は、構造および抗原性の瞬間的安定化および保存を可能にしません。細胞内事象を調べるための最良の選択は、その天然の状態で細胞を維持し、凍結置換固定法に続いて低温固定を使用することです。高圧凍結細胞の超微細構造の整合性を維持する/凍結置換は、最も一般的に使用される方法ですが、expensiが必要です機器VEの。ここでは、懸濁細胞培養のための凍結置換に続いて、使いやすく、低コストの凍結固定方法が提示されます。

この記事では、超微細構造（ 図1及び図2）及び免疫標識（ 図3）研究のために使いやすく、低コストのプランジ凍結方法が提供されます。私たちは、凍結置換法のためと温暖化手続きではなく、専用のシステムを使用して、24時間の6時間未満を取ることを特別な機器を用意する必要はありませんことを示しています。 PF /凍結置換法は、 サッカロミセス・セレビシエ （ 図1Aおよび1D-H）、 シゾサッカロミセス・ポンベ （ 図1Bとの細胞内構造の改善された保存をもたらし ...

この原稿は、透過型電子顕微鏡により懸濁細胞を可視化するために使いやすく、低コストの低温固定の方法を記載しています。

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

以下の実験の目的は、透過型電子顕微鏡での可視化のための浮遊細胞の超微細構造および免疫局在研究のためのツールを提案することです。この技術は使いやすく、低コストで、細胞構造の優れた保存を提供します。これは浮遊細胞の培養です。まず、細胞をさまざまな遠心分離機で回収し、微量遠心チューブ内でペレットを取得します。第2ステップでは、サンプルをプランジ凍結によって急速に凍結し、細胞を固定し、氷の結晶の形成を制限します。次に、固定剤として四酸化オスミウムを含む溶媒で水を置換し、細胞構造を安定化するために凍結置換を行います。結果は、プランジ凍結と凍結置換が細胞のインフラストラクチャを完全に保持することを示しています。化学固定は、透過型電子顕微鏡で組織や細胞を固定するための主要な方法でしたが、この方法では、通常、アーチファクトや細胞内容物の抽出が観察されます。化学固定に代わるものとして、凍結固定があります。この方法は、薄い樹脂切片で最高品質の形態を作り出すための最良の選択です。プランジ凍結は、従来の化学的固定による損傷を避けるために、細胞内の分子を瞬時に固定化する凍結固定技術です。サンプルを急降下凍結する前に、Formvarフィルムでグリッドカットされたグリッドを凍結のサポートとして使用する準備をする必要があります。スライドガラスを糸くずの出ない布で光沢が出るまで磨き、きれいに拭きます。スライドガラスをFormvar 0.3%クロロホルムの溶液に数秒間浸し、ビーカーで直立させて乾かします。操作は、クロロホルムの存在により、個人用保護具を使用してヒュームフードの下で実現する必要があります。晶析装置に蒸留水を入れた後、水面にガラスバーを通してほこりを取り除きます。フィルムが乾いたら、鋭利なカミソリの刃で端に切り込みを入れて、フィルムが浮き上がるようにします。スライドに大きく息を吐き出してスライドを霜で消し、フィルムに水蒸気の層を作ります。スライドの底面に水面に対して約30度の角度で触れて、すぐにフィルムを水面に浮かせます。スライドをゆっくりとお風呂に下げ、必要に応じてフィルムをからかいます。Formvarフィルムはゆっくりと水面に沈殿します。ピンセットを使用して、晶析装置の端にフィルムを取り付けます。400メッシュの銅グリッドをフィルム上に伏せて、適切な厚さでしわのない領域にそっと置きます。グリッド付きのフィルムは、水面に浮かんでいる間、ジョセフペーパーで覆うことによってピックアップされます。ジョセフ紙の端を拾うと、グリッド付きのフィルムが付属しているはずです。指を水面に触れさせないと、水中にフィルムが残る危険があります。グリッドを使用する前に、数時間乾かしてください。超微細構造研究では、四酸化オスミウムアンプルをガラスフラスコに入れます。フラスコをよく振ってアンプルを壊します。適切な量のアセトンを100%加えて最終濃度を4%にします凍結置換培地を含むフラスコを攪拌し、プラスチックトランスファーピペットで1.5ミリリットルのアリコートをクライオバイアルに分注します。すべてのキャップを閉じ、マイナス84度で冷凍庫に保管してから使用してください。タンパク質免疫標識研究では、アセトン中に0.1%の酢酸ウラニルを調製します。溶液が透明になったら、0.2 μメートルのフィルターを使用して濾液し、1.5 ミリリットルのアリコートをクライオバイアルに分注します。マイナス84度の冷凍庫に保管してからご使用ください。異なる細胞タイプからのペレットの適切な一貫性を持っていることを確認するために、生酵母細胞は、9つの細胞に1つの10を得るために、最小の完全な液体培地で。DTY培地中の大腸菌を5つの10〜10個の細菌細胞を得る。AM培地でリーシュマニア鞭毛を、SDM79培地でTrypanosoma bruceiを5個から8個の寄生虫細胞で取得する。浮遊細胞を含む培地を50ミリリットルのプロピレンチューブに移し、1,500gで3分間遠心分離する。上清を取り除き、ペレットをそれぞれの細胞培養培地1ミリリットルに再懸濁します。マイクロ遠心チューブ内で3, 900gで1分間遠心分離し、上清を完全に取り除きます。プランジ凍結法では、プロパンボンベにチューブを接続したプロパンボトルを使用する必要があります。プロパンは爆発性があるため、換気の良い部屋やヒュームフード内で液化を実現します。直火は禁止されています。液体窒素を使用するときは、クライオグローブを含む個人用保護具を常に着用する必要があります。ポリスチレントレイに少量の液体窒素を入れます。真ちゅう製のカップを液体窒素に入れます。泡が出ます。泡が収まるまで待ちます。その後、真鍮のカップを凍らせます。プロパンボンベに接続されたチューブを真鍮製のキャップ壁に接触させます。プロパンシリンダーバルブを静かに開きます。プロパンが液化し始めないため、多くの煙が形成されます。プロパンが液化し始めると、煙は消えます。プロパンシリンダーバルブを閉じ、プロパンシリンダーに接続されたチューブを急速に取り外すことにより、液化を停止します。ポリスチレントレイに真ちゅう製カップの上部から最大5ミリメートルの液体窒素を入れます。小さな真ちゅう製のカップを凍結し、凍結後にサンプルを液体窒素に入れて交換します。1つのサンプルに1つのカップを入れます。サンプルを混ぜないように注意してください。ペレットの適切な一貫性を得るためには、前述の培養条件と遠心分離パラメータを尊重する必要があります。ピンセットは冷凍してから使用してください。Formvarでカットされた400メッシュの銅顕微鏡グリッドを取ります。ペレットに両刃の解剖針を突っ込みます。ツールを使用して、グリッド上にペレットを一滴入れます。グリッドを液体プロパンに非常に急速に突入させ、数秒間攪拌します。小さな真ちゅう製のカップで凍結したグリッドをすばやく移します。サンプルごとに、少なくとも 3 つのグリッドを作成します。グリッドを取る前にピンセットを凍らせることを忘れないでください。ピンセットは冷凍してから使用してください。カップを素早く取り外し、ピンセットを使用して凍結したグリッドをクライオバイアルに移します。キャップをクライオバイアルに戻します。各サンプルの各グリッドに対して操作を繰り返します。キャップを閉じてクライオバイアルを攪拌し、サンプルが凍結置換培地にあることを確認します。クライオバイアルをマイナス84度の冷凍庫で3日間入れます。クライオバイアルをポリスチレントレイに入れて持ち運び、マイナス30度の冷凍庫への急激な温度上昇を避けてください。マイナス30度で1時間しましょう。クライオバイアルをマイナス15度で2時間運び、次にサンプルを4度で2時間、室温で30分間置きます。プラスチック製のトランスファーピペットを使用して凍結置換培地を取り出し、明確に識別された適切な廃液ボトルに入れます。約500マイクロリットルの100%アセトンを入れます。ガラスバイアルを開き、クライオバイアルを攪拌し、凍結置換培地をガラスバイアルに素早く入れます。1つのクライオバイアルを100%アセトンですすいでください。100%アセトンで10分×3回すすいでください。クライオバイアルをポリスチレントレイに入れて持ち運び、マイナス30度の冷凍庫への急激な温度上昇を避けてください。マイナス30度で2時間しましょう。ポリプロピレンバイアルにサンプルを入れた後、凍結置換培地を新鮮な凍結置換培地に交換し、マイナス30度で2時間待ちます。100%アセトンで1時間、100%エタノールで1時間3回すすぎます。プランジ凍結/凍結置換法により、浮遊細胞の細胞内構造が良好に保存された。Saccharomyces cerevisiaeでは、構造は縮小しておらず、細胞質は密集して見えます。また、膜は滑らかで、保存状態が良い証拠です。核、ミトコンドリア、液胞など、すべての細胞小器官を完全に識別できます。優れた保存は、リーシュマニア鞭毛、トリパノソーマブルーセイ、および大腸菌でも観察されます。核内には、核膜を形成する二重膜、核膜孔、紡錘極体、核膜外膜に付着したリボソームがはっきりと見えます。ミトコンドリアでは、クリステと呼ばれる内膜の陥入がはっきりと見えます。重要な細胞小器官は液胞であり、大きな氷の結晶は容易に発達する可能性があるためです。この画像では、液胞は氷の結晶による損傷なしに完全に保存されています。プランジ凍結/凍結置換法は、タンパク質の免疫局在化にも使用できます。この手順は、タンパク質の抗原性を完全に保持し、前述のように、細胞小器官が明確に識別されます。抗ATPシンターゼや抗ポリンなど、酵母のさまざまなタンパク質を標的とするさまざまな抗体がすでにテストされています。このような実験は、フラバリンタンパク質が局在したリーシュマニアのように、さまざまな実験系でも可能です。このビデオを見れば、透過型電子顕微鏡でサンプルを可視化するためのプランジ凍結/凍結置換法によるサンプルの調製方法を十分に理解できるはずです。この手法は、迅速で使いやすく、低コストで、セルインフラストラクチャの優れた保存を提供します。液体窒素、特に四酸化オスミウムと酢酸ウラニルには注意してください。それらは、白衣や手袋などの適切な個人用保護具を着用しながら、ドラフトで取り扱う必要があります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ネイティブに近い状態の細菌細胞の超微細構造を研究するために電子cryotomography（ECT）を使用する方法を私たちは、"高分子"（〜4...

細菌細胞の電子Cryotomography

超微細構造解析のための神経突起を維持するために、我々は、ガラス質氷の層に懸濁したサンプルを得瞬間冷凍に続く電子顕微鏡グリッド上に、一次ニューロンのメッキのためのプロトコルを記述します。これらのサンプルは、ナノメートルスケールでの構造を可視化するために低温電子顕微鏡で調べることができる。...

低温電子断層撮影法を用いて凍結 - 和状態で神経突起を可視化するための一次ニューロンの調製

基本的な技術および透過型電子顕微鏡による検査のための生体試料とナノ材料のフリーズフラクチャー処理の改良が記載されている。この技術は、生体膜の超微細構造の特徴と専門性を明らかにするため、材料科学、ナノテクノロジー製品の超微細構造レベル次元の空間データを取得するための好ましい方法である。...

生物学電子顕微鏡でのフリーズフラクチャー/フリーズエッチングの基本技術要素

高品質の透過型電子顕微鏡画像を取得することは、特に植物細胞の場合、水で満たされた大きな液胞と曝気された空間が豊富にあるため、困難です。タンデム高圧凍結と急速凍結置換により、TEM用の植物試料の調製時間が大幅に短縮され、超微細構造保存性に優れた試料が得られます。...

タンデム高圧凍結および透過型電子顕微鏡のための植物組織の急速凍結置換

私たちは、ミリ秒の時間分解能を有する膜ダイナミクスの可視化を可能にし、電子顕微鏡、「フラッシュおよび凍結、」における新規技術を開発しました。この技術は、高圧凍結とニューロンの光遺伝学的刺激を兼ね備えています。ここでは、手順を示し、詳細なプロトコルを記述します。...

フラッシュとフリーズ：電子顕微鏡でメンブレンダイナミクスをキャプチャするために新しい技術

ここで提示するプロトコルは、窒化ケイ素膜上での細胞培養およびX線蛍光イメージング前の突起凍結のためのプロトコルであり、シンクロトロン極低温X線ナノプローブを用いた。室温ナノ分析のみが提供される場合、凍結試料をさらに凍結乾燥させることができる。これらは、細胞内元素組成物に関する情報を得るための重要なステップである。...

窒化ケイ素膜上の細胞培養とシンクロトロンX線蛍光ナノ分析のための凍結製剤

ここでは、クライオ軟X線断層撮影法(SXT)で凍結保存細胞全体の超構造を25nmハーフピッチの分解能で画像化するために必要なサンプル調製およびデータ収集ステップを説明するプロトコルを提示する。...

クライオ軟X線断層撮影による細胞の3D地図作成記述

ここでは、細菌、酵母、培養細胞、単離細胞、動物およびヒト組織、ウイルスを含む生物学的標本の迅速凍結にサンドイッチ凍結装置を使用する方法を示す。また、急速凍結後の超薄切片用試料の調製方法もご紹介します。...

電子顕微鏡での生体試料の良好な超構造保存のためのサンドイッチ凍結装置を用いた急速凍結

この原稿は、単粒子低温電子顕微鏡用の生物学的標本を手動で凍結するブロット・アンド・プランジ法の概要を説明している。...

単粒子低温電子顕微鏡用生体試料の手動ブロットとプランジ凍結

ここでは、クライオ電子線トモグラフィー用の細胞サンプルの調製をガイドするための3D相関集束イオンビームミリングのパイプラインを紹介します。目的の蛍光タグ付きタンパク質の3D位置は、まずクライオ蛍光顕微鏡で決定され、次にミリングの標的となります。このプロトコルは、哺乳類、酵母、および細菌細胞に適しています。...

高分解能クライオ電子線トモグラフィーのための3D相関集束イオンビームミリングによるサンプル調製

このビデオプロトコルは、ウイルス学的標本の走査型透過型電子顕微鏡断層撮影法を実行する方法を示しています。最適な結果を得るために、サンプルは高圧凍結とその後の凍結置換によって調製されます。...

ウイルス学における走査型透過型電子顕微鏡断層撮影:高圧凍結凍結置換サンプルの3Dイメージング

学ぶプランジ凍結法による懸濁細胞の透過型電子顕微鏡観察。凍結置換で細胞構造を完全に保存し、超微細構造と免疫局在解析に有用な低コスト技術です。

プランジ凍結：透過型電子顕微鏡での懸濁細胞の超微細構造と免疫学的研究のためのツール

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