プランジ凍結：透過型電子顕微鏡での懸濁細胞の超微細構造と免疫学的研究のためのツール

以下の実験の目的は、透過型電子顕微鏡での可視化のための浮遊細胞の超微細構造および免疫局在研究のためのツールを提案することです。この技術は使いやすく、低コストで、細胞構造の優れた保存を提供します。これは浮遊細胞の培養です。

まず、細胞をさまざまな遠心分離機で回収し、微量遠心チューブ内でペレットを取得します。第2ステップでは、サンプルをプランジ凍結によって急速に凍結し、細胞を固定し、氷の結晶の形成を制限します。次に、固定剤として四酸化オスミウムを含む溶媒で水を置換し、細胞構造を安定化するために凍結置換を行います。

結果は、プランジ凍結と凍結置換が細胞のインフラストラクチャを完全に保持することを示しています。化学固定は、透過型電子顕微鏡で組織や細胞を固定するための主要な方法でしたが、この方法では、通常、アーチファクトや細胞内容物の抽出が観察されます。化学固定に代わるものとして、凍結固定があります。

この方法は、薄い樹脂切片で最高品質の形態を作り出すための最良の選択です。プランジ凍結は、従来の化学的固定による損傷を避けるために、細胞内の分子を瞬時に固定化する凍結固定技術です。サンプルを急降下凍結する前に、Formvarフィルムでグリッドカットされたグリッドを凍結のサポートとして使用する準備をする必要があります。

スライドガラスを糸くずの出ない布で光沢が出るまで磨き、きれいに拭きます。スライドガラスをFormvar 0.3%クロロホルムの溶液に数秒間浸し、ビーカーで直立させて乾かします。操作は、クロロホルムの存在により、個人用保護具を使用してヒュームフードの下で実現する必要があります。

晶析装置に蒸留水を入れた後、水面にガラスバーを通してほこりを取り除きます。フィルムが乾いたら、鋭利なカミソリの刃で端に切り込みを入れて、フィルムが浮き上がるようにします。スライドに大きく息を吐き出してスライドを霜で消し、フィルムに水蒸気の層を作ります。

スライドの底面に水面に対して約30度の角度で触れて、すぐにフィルムを水面に浮かせます。スライドをゆっくりとお風呂に下げ、必要に応じてフィルムをからかいます。Formvarフィルムはゆっくりと水面に沈殿します。

ピンセットを使用して、晶析装置の端にフィルムを取り付けます。400メッシュの銅グリッドをフィルム上に伏せて、適切な厚さでしわのない領域にそっと置きます。グリッド付きのフィルムは、水面に浮かんでいる間、ジョセフペーパーで覆うことによってピックアップされます。

ジョセフ紙の端を拾うと、グリッド付きのフィルムが付属しているはずです。指を水面に触れさせないと、水中にフィルムが残る危険があります。グリッドを使用する前に、数時間乾かしてください。

超微細構造研究では、四酸化オスミウムアンプルをガラスフラスコに入れます。フラスコをよく振ってアンプルを壊します。適切な量のアセトンを100%加えて最終濃度を4%にします凍結置換培地を含むフラスコを攪拌し、プラスチックトランスファーピペットで1.5ミリリットルのアリコートをクライオバイアルに分注します。

すべてのキャップを閉じ、マイナス84度で冷凍庫に保管してから使用してください。タンパク質免疫標識研究では、アセトン中に0.1%の酢酸ウラニルを調製します。溶液が透明になったら、0.2 μメートルのフィルターを使用して濾液し、1.5 ミリリットルのアリコートをクライオバイアルに分注します。

マイナス84度の冷凍庫に保管してからご使用ください。異なる細胞タイプからのペレットの適切な一貫性を持っていることを確認するために、生酵母細胞は、9つの細胞に1つの10を得るために、最小の完全な液体培地で。DTY培地中の大腸菌を5つの10〜10個の細菌細胞を得る。

AM培地でリーシュマニア鞭毛を、SDM79培地でTrypanosoma bruceiを5個から8個の寄生虫細胞で取得する。浮遊細胞を含む培地を50ミリリットルのプロピレンチューブに移し、1,500gで3分間遠心分離する。上清を取り除き、ペレットをそれぞれの細胞培養培地1ミリリットルに再懸濁します。

マイクロ遠心チューブ内で3, 900gで1分間遠心分離し、上清を完全に取り除きます。プランジ凍結法では、プロパンボンベにチューブを接続したプロパンボトルを使用する必要があります。

プロパンは爆発性があるため、換気の良い部屋やヒュームフード内で液化を実現します。直火は禁止されています。液体窒素を使用するときは、クライオグローブを含む個人用保護具を常に着用する必要があります。

ポリスチレントレイに少量の液体窒素を入れます。真ちゅう製のカップを液体窒素に入れます。泡が出ます。

泡が収まるまで待ちます。その後、真鍮のカップを凍らせます。プロパンボンベに接続されたチューブを真鍮製のキャップ壁に接触させます。

プロパンシリンダーバルブを静かに開きます。プロパンが液化し始めないため、多くの煙が形成されます。プロパンが液化し始めると、煙は消えます。

プロパンシリンダーバルブを閉じ、プロパンシリンダーに接続されたチューブを急速に取り外すことにより、液化を停止します。ポリスチレントレイに真ちゅう製カップの上部から最大5ミリメートルの液体窒素を入れます。小さな真ちゅう製のカップを凍結し、凍結後にサンプルを液体窒素に入れて交換します。

1つのサンプルに1つのカップを入れます。サンプルを混ぜないように注意してください。ペレットの適切な一貫性を得るためには、前述の培養条件と遠心分離パラメータを尊重する必要があります。

ピンセットは冷凍してから使用してください。Formvarでカットされた400メッシュの銅顕微鏡グリッドを取ります。ペレットに両刃の解剖針を突っ込みます。

ツールを使用して、グリッド上にペレットを一滴入れます。グリッドを液体プロパンに非常に急速に突入させ、数秒間攪拌します。小さな真ちゅう製のカップで凍結したグリッドをすばやく移します。

サンプルごとに、少なくとも 3 つのグリッドを作成します。グリッドを取る前にピンセットを凍らせることを忘れないでください。ピンセットは冷凍してから使用してください。

カップを素早く取り外し、ピンセットを使用して凍結したグリッドをクライオバイアルに移します。キャップをクライオバイアルに戻します。各サンプルの各グリッドに対して操作を繰り返します。

キャップを閉じてクライオバイアルを攪拌し、サンプルが凍結置換培地にあることを確認します。クライオバイアルをマイナス84度の冷凍庫で3日間入れます。クライオバイアルをポリスチレントレイに入れて持ち運び、マイナス30度の冷凍庫への急激な温度上昇を避けてください。

マイナス30度で1時間しましょう。クライオバイアルをマイナス15度で2時間運び、次にサンプルを4度で2時間、室温で30分間置きます。プラスチック製のトランスファーピペットを使用して凍結置換培地を取り出し、明確に識別された適切な廃液ボトルに入れます。

約500マイクロリットルの100%アセトンを入れます。ガラスバイアルを開き、クライオバイアルを攪拌し、凍結置換培地をガラスバイアルに素早く入れます。1つのクライオバイアルを100%アセトンですすいでください。

100%アセトンで10分×3回すすいでください。クライオバイアルをポリスチレントレイに入れて持ち運び、マイナス30度の冷凍庫への急激な温度上昇を避けてください。マイナス30度で2時間しましょう。

ポリプロピレンバイアルにサンプルを入れた後、凍結置換培地を新鮮な凍結置換培地に交換し、マイナス30度で2時間待ちます。100%アセトンで1時間、100%エタノールで1時間3回すすぎます。プランジ凍結/凍結置換法により、浮遊細胞の細胞内構造が良好に保存された。

Saccharomyces cerevisiaeでは、構造は縮小しておらず、細胞質は密集して見えます。また、膜は滑らかで、保存状態が良い証拠です。核、ミトコンドリア、液胞など、すべての細胞小器官を完全に識別できます。

優れた保存は、リーシュマニア鞭毛、トリパノソーマブルーセイ、および大腸菌でも観察されます。核内には、核膜を形成する二重膜、核膜孔、紡錘極体、核膜外膜に付着したリボソームがはっきりと見えます。ミトコンドリアでは、クリステと呼ばれる内膜の陥入がはっきりと見えます。

重要な細胞小器官は液胞であり、大きな氷の結晶は容易に発達する可能性があるためです。この画像では、液胞は氷の結晶による損傷なしに完全に保存されています。プランジ凍結/凍結置換法は、タンパク質の免疫局在化にも使用できます。

この手順は、タンパク質の抗原性を完全に保持し、前述のように、細胞小器官が明確に識別されます。抗ATPシンターゼや抗ポリンなど、酵母のさまざまなタンパク質を標的とするさまざまな抗体がすでにテストされています。このような実験は、フラバリンタンパク質が局在したリーシュマニアのように、さまざまな実験系でも可能です。

このビデオを見れば、透過型電子顕微鏡でサンプルを可視化するためのプランジ凍結/凍結置換法によるサンプルの調製方法を十分に理解できるはずです。この手法は、迅速で使いやすく、低コストで、セルインフラストラクチャの優れた保存を提供します。液体窒素、特に四酸化オスミウムと酢酸ウラニルには注意してください。

それらは、白衣や手袋などの適切な個人用保護具を着用しながら、ドラフトで取り扱う必要があります。