化学発光法を用いて、生物学的材料に、一酸化窒素経路に亜硝酸塩と硝酸塩、代謝物を測定します

このプロトコルの目標は、三ヨウ化物と塩化バナジウム還元溶液を使用して亜硝酸塩と硝酸塩のレベルを定量することにより、化学発光を使用して生体サンプル中の一酸化窒素を定量することです。このプロトコルは、さまざまな生体サンプルから一酸化窒素の代謝とシグナル伝達を地域的および縦断的に追跡するための強力なツールを提供します。この手法の主な利点は、そのシンプルさと高感度です。

この手順を実演するのは、IRTAフェローのKatelyn Casselです。彼女は、化学発光と三ヨウ化物溶液を組み合わせて亜硝酸塩を測定する方法を紹介します。まず、亜硝酸塩保存溶液を作ります。

蒸留水に118ミリモルNEM1個と890ミリモルのフェロシアン化カリウムを含む溶液を調製します。溶液が結晶のない透明な黄色になるまで、固体を溶解します。次に、この溶液を NP 40 に 9 対 1 の体積比で加えます。

泡立ちを避けるために溶液を穏やかに混合します。この混合物を渦巻きにしないでください。亜硝酸塩保存液は、摂氏4度で保存すれば約1週間使用できます。

このプロトコールは、新たに得られた多くの生物学的サンプルに使用できます。この場合、採取したばかりの血液を遠心分離して、試験用の血漿サンプルを得ました。ヘムタンパク質が亜硝酸塩と反応して亜硝酸塩を破壊するため、血液やヘモグロビンやミオグロビンなどのヘムタンパク質を大量に含む生体サンプルをできるだけ早く処理することが非常に重要です。

さて、内因性血液亜硝酸塩の大部分を保存するために、血漿を亜硝酸塩保存溶液と1〜4体積比で直ちに混合します。この調製のどの段階でも、サンプルはドライアイス上で凍結できます。サンプルを脱タンパクするには、サンプルを等量の冷たいメタノールと混合します。

次に、サンプルを13000Gで摂氏4度で15分間遠心分離し、タンパク質を沈殿させます。上清を取り、亜硝酸塩の測定に使用します。亜硝酸塩の感度測定には、三ヨウ化物還元溶液が最も効果的であると考えられています。

準備するときは、すべての結晶が溶けていることを確認してください。溶液は暗いボトルに保管し、調製後1週間以内に使用してください。塩化バナジウム還元溶液は、硝酸塩の測定に最も精度を提供します。

亜硝酸塩の1マイクロモル溶液は、亜硝酸塩および硝酸塩の標準曲線の決定に使用されます。製造元の指示に従って一酸化窒素分析装置をセットアップします。まず、酸素タンクを開き、機器の電源を入れ、モル水酸化ナトリウムが1つ含まれている酸トラップに接続します。

次に、ヘリウムタンクを開き、ガラス反応チャンバーをヘリウムタンクに接続します。次に、亜硝酸塩測定用の三ヨウ化物溶液を反応チャンバーにロードします。消泡剤を追加します。

ガスの流量を調整して、バブリングを遅くします。次に、アシッドトラップを反応チャンバーに接続します。試行錯誤しながら、ヘリウムの流量を機器の吸引力に合わせて右に調整します。

次に、ビジュアルプログラミングベースの液体ソフトウェアを起動します。まず、データメニューから装置とアクイジションソフトウェア間の通信を有効にし、次にフロントパネルのメインメニューから分析を開始します。光電子増倍管の冷却器がマイナス12°C以下に冷え、光電子増倍管が安定するのを待ちます。

約30分後、ベースラインは1〜2ミリボルト以内に安定します。値の安定性は、値自体ではなく重要です。分析装置が安定したら、よく洗浄したハミルトンシリンジを使用して溶液を注入します。

まず、1 マイクロモル亜硝酸塩標準試料を少なくとも 3 種類注入します。セプタムを介して溶液を還元溶液に注入します。すべての標準試料またはサンプルを2回注入します。

高い亜硝酸塩レベルとサンプルが予想される場合は、標準曲線の傾きをより正確に決定するために、4 番目の容量の標準亜硝酸塩溶液を大量に注入することを検討してください。常に出力を観察し、分析器がベースラインまで再安定するのを待ってから、次のサンプルを注入します。これには少なくとも1分かかります。

正確な結果を得るには、ピークが700ミリボルト未満のサンプル量を使用してください。実行の合間に、シリンジを脱イオン水で十分に洗浄します。シリンジをしっかりと洗うことが非常に重要です。

すべての測定が完了したら、ソフトウェアの停止オプションを押します。データは自動的に保存されます。abortを押すと、データを保存せずに測定が終了します。

反応容器上部のストップコックを閉じ、酸トラップと反応容器をつなげているチューブを外します。実験後、アナライザーをスタンバイ状態にします。メインパネルの分析を押して、スタンバイモードに入ることを確認します。

次に、供給酸素を止めます。O2タンクからアシッドトラップまでのチューブを外します。次に、ヘリウムを使用して三ヨウ化物溶液を洗い流します。

次に、ヘリウムタンクを閉じてガラス反応容器から外します。最後に、必要に応じてエタノールと水を使用して容器を洗浄します。血漿サンプルとともに試験用標準試料を検査すると、注入直後は光電子増倍管の電圧が上昇し、亜硝酸塩がすべて減少するとベースラインに戻ることが示されていますが、これには最大1分かかることがあります。

信号を定量化するために、電圧ジャンプピークの下の領域を使用して、標準から標準曲線を作成しました。標準曲線を使用すると、サンプルの定量は、重複する注入間で非常に再現性がありました。化学発光は、亜硝酸塩濃度を決定するためのゴールドスタンダードと考えられています。

一度習得すると、亜硝酸塩の感度限界は20ミリモルまで低くなります。化学発光を扱うために最も重要なことは、精度です。この方法は感度が高いため、すべてのミスが最終結果に影響を与えます。

ですから、急いではいけません。この技術が2000年代初頭に開発された後、研究者が一酸化窒素代謝経路を探求し、一酸化窒素の欠乏が多くの疾患、特に心血管疾患を引き起こしていることを知る道を開きました。