神経化学的マーカーのためのビオシチンで満たされたと加工セクションの免疫染色

このプロトコルの目的は、特定の抗体で再染色して神経化学的同一性を決定する前に、形態の回復のためのバイオシチンおよび免疫染色を使用して、電気生理学的記録中にパッチされたニューロンを同定するための効率的な方法を提示することです。したがって、この方法は、ニューロンの構造と機能の多様性を研究するために必要な重要なステップを説明しています。これは、脳ネットワークにおけるそれらの役割を理解するために不可欠です。

シーケンシャル処理技術を使用する主な利点は、形態を回復できないためにデータ損失がなくなることです。したがって、これは、これらの細胞でテストされる神経化学マーカーを導くのにも役立ちます。この方法は、厚い切片の細胞の形態学的回収について説明していますが、薄い切片や、以前に染色およびマウントされたサンプルにも適用できます。

一般に、この方法に新規に導入した中性体は、細胞から剥離しながら体細胞を再密封するのが困難であり、正常な充填のための十分な時間を確保できない場合があります。完全な形態を回復するためには、細胞の効果的なバイオサイトン充填に特定の技術が必要であるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。この手順を開始するには、電圧クランプ構成で、セルに近づきながら、浴モードでメンブレンテスト機能を使用して小さな短い電圧ステップを印加します。

吸引を適用してセルにパッチを当てます。次に、セルをマイナス70ミリボルトに保持します。ギガオームシールの開発に注意してください。

容量性過渡現象を補正し、シリンジまたは経口で制御された吸引を適用して、全細胞構成を実現します。全細胞の静電容量と直列抵抗を推定し、メンブレンテストパルスを停止します。直列抵抗は10メガオーム未満が最適です。

これにより、バイオサイトン充填を可能にする全細胞記録条件の確立が保証されます。生理学的記録が完了したら、電圧クランプモードで記録ピペットを小さなステップでゆっくりと動かし、上向きと外側に交互に動かして、パッチクランプ構成を再確立します。細胞の形態学的回復を達成するための最も重要なステップは、記録ピペットを細胞から取り外しながら、ニューロン体細胞の再封止を確実にすることです。

メンブレンテスト機能を使用して、容量性過渡現象の損失と直線に対する電流応答の崩壊を視覚化します。これは、セルの再シーリングとピペット先端の外側のアウトパッチの確立を示しています。その間、細胞を脱分極電位に保持すると、再封止プロセスが容易になります。ピペットを細胞から取り外した後、スライスを記録チャンバーに3〜5分間保持して、色素が遠位樹状突起および軸索突起に輸送されるようにします。

次に、スライスを4%PFAを含む24ウェルプレートに移して固定します。PFA固定の24〜48時間後、すべての固定スライスをゼロポイント1モルPBSに移して免疫染色前に保存してください。この手順では、組織をゼロポイント1モルPBSでそれぞれ10分間3回洗浄します。

次に、室温で10%ブロッキング血清で組織をブロックします。その後、一次抗体CB1Rの切片を室温で一晩インキュベートし、カンナビノイド受容体1型発現を同定します。次に、脳切片を0.1モルPBSでそれぞれ10分間3回洗浄します。

ストレプトアビジンと一次抗体に対する二次抗体の両方をウェルプレートに添加し、摂氏4度で一晩保持します。その後、ストレプトアビジン赤色色素コンジュゲートの切片を摂氏4度で暗所で一晩インキュベートし、ビオシチンを明らかにします。その後、0.1モルPBSで脳切片をそれぞれ10分間、3回洗浄します。

蛍光を保護し、将来の再染色を容易にするために、切片を等間隔の封入剤に封入します。カバースリップの端を透明なマニキュアで密封します。このステップでは、アセトンの綿棒でスライドガラスからマニキュアを剥がします。

細い先端鉗子を使用してカバースリップを慎重に取り外し、切片に0.1モルPBSの液滴を数滴置きます。水性封入剤から組織をアンマウントする際に、プロセス組織を損傷しないことが重要です。細い絵筆を使用してスライドからセクションを慎重に取り外し、シェーカーで0.1モルPBSで24〜48時間洗い、摂氏4度の光を避けます。

封入剤を完全に除去するために、翌日に切片を0.1モルPBSで毎回10分間、1回から2回洗浄します。次に、切片を2番目の一次抗体であるコレシストキニンと1日間インキュベートします。脳切片を0.1モルPBSでそれぞれ10分間3回洗浄します。

続いて、フルオロフォア標識二次抗体ヤギ抗マウスで切片を染色します。二次抗体の励起発光スペクトルがストレプトアビジンおよび以前の免疫蛍光染色と重ならないようにします。その後、切片を水性封入剤に封入します。

カバースリップの端を透明なマニキュアで密封します。バイオサイトチンの充填に成功し、最初の免疫染色プロセスを行った後、60倍の倍率で得られた共焦点画像に示すように、ニューロン構造を視覚化およびイメージングすることができます。この切片は、ビオシチンと共に CB1R についても免疫染色されており、ニューロン体細胞を発現するバイオサイトンにおける CB1R の免疫染色は矢印で示されています。

同じ切片を1週間後にCCK免疫反応性について処理し、画像はアスタリスクで示されたいくつかのニューロンにおけるCCK免疫標識の回復が成功したことを示しています。矢印で示されたバイオサイトン標識細胞はCCKを発現しなかったことに注意してください。パネル A、B、C の結合画像は、3 つの標識すべてが堅牢に可視化されており、バイオシチンと CB1R の重なりが明らかであることを示しています。

この画像は、2回目の免疫染色プロセスが前の染色プロセスからのシグナルを損なわないことを示しています。バイオシチン充填細胞の形態は、このCCK免疫染色に先立つ共焦点画像から取得しました。重要なことは、体細胞と樹状突起に加えて、軸索を視覚化でき、CB1R とバイオサイトチン標識された軸索突起の共標識が観察されることです。

この手順を試みるときは、プロセスが切断されたニューロンを避けるために、スライス表面の下にある健康な細胞を標的にすることが重要です。そして、それは形態の回復を損なう可能性があります。習得すると、パッチクランプ記録中にバイオサイトン充填細胞の形態学的回復を確実に得ることができます。

シリアル免疫染色技術の導入が成功すると、データ回収の効率が向上し、標準的なパッチクランプ記録中のニューロンの特性評価が容易になります。このビデオを見れば、バイオサイトンを充填した細胞を効果的に使用して神経細胞の形態を回復し、神経化学的マーカーを決定する方法についてよく理解できるはずです。