Name: 神経化学的マーカーのためのビオシチンで満たされたと加工セクションの免疫染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 学ぶバイオシチン充填と免疫染色による神経細胞形態回復法。電気生理学的記録後に神経化学マーカーを同定し、脳ネットワークにおける神経細胞の構造と機能の多様性を解明する効率的な手法です。

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著者らは、VSにNIH / NINDS R01 NS069861とNJCBIR CBIR14IRG024からの支援を感謝したいです

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<li>Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dentate+cannabinoid-sensitive+interneurons+undergo+unique+and+selective+strengthening+of+mutual+synaptic+inhibition+in+experimental+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy.</a> Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).</li>
<li>Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dentate+total+molecular+layer+interneurons+mediate+cannabinoid-sensitive+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition.</a> Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).</li>
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<li>Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+for+functional+labeling+of+neurons%3A+activity-dependent+promoters+have+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Circuits+Revealed%22%5BJournal%5D)">A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age.</a> Neural Circuits Revealed. , 109(2015).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

プロトコル内の重要なステップ ビオシチンでパッチを適用する細胞を充填することは形態の完全な回復を確実にするために最も重要なステップです。細胞の完全な回復のために、スライス中のプロセスの切断を最小限に抑えるために、最適なスライスの向きを選択することが重要です。この配向は検査中の回路および細胞タイプに基づいて異なる場合があります。次に、ビオサイチンは、樹状突起と軸索に拡散するのに十分な時間を確保することが不可欠です。このようなneurobiotinなどの一部の染料は、また、ギャップ結合を介して記録された細胞に結合されたニューロンを貫通することができます。ピペットチップの大きさはまた、細胞体は、開口が大きく、ピペットチップが小さすぎるとビオシチン負荷が危険にさらされたときに引き出される傾向にあるように、最適化する必要があります。さらに、全細胞モードから離脱しながら適切な手順は、ソーマを回復するために必須です。 24時間記録した後、その後のインキュベーションPBSに続いて4％PFA内のスライスの組織の架橋は免疫組織化学のために重要である、低減されることを...

脳は、その個々の神経要素の構造的および機能的特性の多様性のために知られています。脳機能と病理学の明確なニューロンタイプの役割を理解することは、特性評価および神経細胞の明確な同定を必要とします。軸索樹枝状のパターンが潜在的なシナプス後の標的を識別しながら、構造的に、SOMATO樹状の場所で定義された形態学的特徴は、与えられたニューロンが受ける潜在的な入力を決定します。ニューロンの構造的多様性は、ラモン・Yカハールの精液の組織学的研究1の時代から高く評価されています。単一細胞記録技術の出現は、構造的に異なるニューロンはまた、発火パターンおよびシナプスの特性の違いを示すことが明らかになりました。構造や生理機能の多様性は、GABA作動性抑制性ニューロン2,3に特に明らかです。また、structurallことがますます明らかになってきていますyの同様のニューロンは、異なる神経化学的マーカーを発現し、機能の違い4に対応する表示することができます。同様に、同じ神経化学的マーカーとニューロンは異なる構造と機能5-10を持つことができます 。したがって、実際には、ネットワーク内のニューロンの機能特性の解析とその役割は、両方の形態学的および神経化学的アイデンティティを定義することを伴います。さらには特定の神経化学的マーカーを標的レポーターマウス株の出現と、免疫組織学11に基づいて、形態およびサブタイプの同一性を決定することがしばしば必要です。 急性脳スライスに記録されている細胞を特徴付けるために使用される標準的な方法は、記録時のビオシチンまたはneurobiotinでそれらを埋める録音以下のパラホルムアルデヒド（PFA）でセクションを修正し、形態および神経化学を明らかにするために、免疫組織化学を使用することです。スライス生理学のためのセクションの厚さは、典型的には300μmであるので、以上、最も抗体は、その深さを介してすべての道を貫通しないので、そのスライスはビオサイチンと神経化学的マーカー12-14のための同時免疫染色を可能にするために、60μm以下に再区分する必要があります。残念ながら、切除は面倒です。切片中の組織のリスク損失。および形態学的再構成を複雑に、組織の収縮を差動につながることができます。さらに、形態学の予備知識は、細胞によって発現される可能性のある候補マーカーを絞り込む助けることができます。我々は最初の形態の回収のために、その後、潜在的な神経化学的マーカーの同定のためのセクションのシリアル処理を可能にするために、標準的なビオサイチン免疫組織学プロトコルを変更しました。 免疫組織化学は、組織または細胞中の抗原の分布の研究であり、酵素、蛍光標識、放射性元素、金コロイド粒子15を用いて可視化することができます。手続きの私具体的に可視化するための一次抗体を標的とする蛍光二次抗体の使用に続いて一つ以上の特定の抗原を、タグおよび増幅するために一次抗体を使用してnvolves。重複せず、それぞれの二次抗体の蛍光スペクトルを区別する必要性のために、抗原の唯一の限定された数を同時に検査することができます。従って、形態学の予備知識は、細胞分類の候補神経化学的マーカーを選択するのに有用であり得ます。概念的には、すでに染色切片のシリアル処理の背後にある論理的根拠は、1つのタンパク質またはペプチドを免疫標識することは構造的に独立したペプチド16のための抗原性及びその後の免疫標識を妨害してはならないことを前提としています。干渉の欠如は、抗原上の特定のタンパク質のエピトープに対する抗体の結合によるものであるため、同じ組織内の複数の抗原の同時染色を可能にします。抗原の数reveale免疫染色により、Dは、蛍光二次抗体の非重複スペクトルの必要性によって、および交差反応17,18を除去するように、異なる種において産生された抗体を用いて個々の抗原を標的とする必要性によって制限されます。これは、マウントされたセクション上の1つまたは複数の抗原のための免疫標識が完了した後に報告されていない第二の抗原に対する免疫染色、我々の知る限り、相互作用することができる二つの異なる抗体を用いたシリアルではなく、同時標識の背後にある理由は、ですが。ここでは、以前に染色し、取り付けられたセクションのシリアル免疫染色のための方法を説明します。私たちは詳細厚い部分でのタンパク質/ペプチドマーカーについて染色した形態の回復のためのシリアル免疫標識手順については、このプロセスをしながら、同様の手順は、薄い組織切片だけでなく、標準的に使用することができます。加えて、我々は取り除くために、ビオシチン、プロセスを記録したニューロンを埋めるための実践的なアプローチを説明します私たちの最近の研究6,8に示されるように、神経細胞の軸索と樹状突起アーバーの充填を最適化するために、録画の終了時にセルからの電極。 ここで説明する手順の最も重要な利点は、記録された細胞の形態が完全に切除またはスライス免疫染色しようとする前に回収して画像化することができるということです。ある種の抗体の浸透の問題は、二次免疫染色のために切除スライスにそれが必要なレンダリングかもしれないが、ここで詳述される手順は、複数のセクションから複雑なニューロンを再構築する必要がなくなると復興を損なうことができ、組織の損失と収縮差に起因する問題を回避するであろう切除以下。付加的な利点は、プロセスが免疫染色とビオシチンで満たされたニューロンが回収されたスライスに再切片を制限することによって、コスト、時間、労力、そして高価な抗体を削減することです。最も実用的な側面は、広告です上記の技術を使用する前に、染色切片ヶ月で行うことができditional免疫染色。具体的には、形態の回復はかなりの細胞からの生理学的データを伴う細胞型の基本的な形態学的特徴付けを得ることができないために廃棄されていることの可能性を減少させます。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fluka</td><td>60129</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>229806</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>モルモット 抗 CB1&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Af530-1</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>マウス 抗</td><td>CCK 治療、UCLA</td><td>提供: G. Ohning</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>ウサギ 抗パルブアルブミン</td><td>Swant</td><td>PV27</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン、Alexa Fluor コンジュゲート</td><td>分子プローブ</td><td>S11227</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>正常ヤギ血清 (NGS)</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>ベクタシールド&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>二次抗体</td><td>Invitogen 分子プローブ</td><td>Alexa Fluor 標識色素</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>Labnet orbit 低速シェーカー</td><td>Bioexpress</td><td>S-2030-LS</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>Dumont</td><td>11231-30</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>スライドフォルダー</td><td>EMS</td><td>71520</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>Vibratome VT 1200 S</td><td>Leica</td><td>14048142066</td><td>電気生理学</td></tr><tr><td>マルチクランプ 700B アンプ</td><td>分子デバイス</td><td>マルチクランプ 700B</td><td>電気生理学</td></tr><tr><td>pCLAMP 10 ソフトウェア</td><td>分子デバイス</td><td>pCLAMP 10&nbsp;</td><td>電気 生理 学</td></tr><tr><td>デジタイザー</td><td>分子デバイス</td><td>Digidata 1440 デジタイザー</td><td>電気生理学</td></tr><tr><td>フィルターチップ</td><td>Nalgene</td><td>171-0020</td><td>電気生理学</td></tr><tr><td>ソニケーター フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>15-335-100</td><td>電気生理学</td></tr><tr><td>マイクロローダー</td><td>エッペンドルフ</td><td>930001007</td><td>電気生理学</td></tr><tr><td>バイオサイトン</td><td>シグマ</td><td>B4261</td><td>電気 生理 学</td></tr></tbody></table>

神経化学的マーカーのためのビオシチンで満たされたと加工セクションの免疫染色

Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

パッチクランプ法を用いて細胞の電気生理学的記録は、発射パターンに基づいて、異なる神経形式の識別のために許可されています。記録電極におけるビオサイチン/ neurobiotinを含めることは、樹状樹枝状分岐し、記録ニューロンの軸索によって標的領域を決定するために必要な形態学的な詳細の事後の回復を可能にします。しかし、明確な神経化学的アイデンティティと機能を備えた形態学的に類似した神経細胞の存在を考えると、細胞型特異的タンパク質のための免疫組織化学的染色は、決定的に神経細胞を識別することが不可欠です。ネットワーク接続を維持するために、生理学的な記録のために脳切片を、300ミクロン以上の厚さで製造されます。しかし、この厚さは、多くの場合、組織の切除を必要とする、抗体の浸透の問題に起因する免疫組織学的後処理を妨げます。スライスの切除は、しばしばresul、挑戦的な芸術であります組織および細胞の形態の喪失ティン、そこから電気生理学的データが使用できないデータをレンダリングし、得られました。ニューロンマーカーの選択におけるデータ損失やガイドを制限する形態の回復以来、私たちは、二次免疫染色に続いて最初の細胞形態を回復する戦略を採用しています。私たちは、生理学的記録と神経化学的同一性を決定するためにセクションの再染色が続く形態の回復のためのその後のシリアル免疫染色、中に充填ビオサイチンする実用的なアプローチを紹介します。我々は、（PFA）パラホルムアルデヒドで固定し、染色し、そしてカバーガラスをビオシチンを充填したセクションは、削除され、2回目以降の一次抗体日で再染色することができると報告しています。この再染色は、カバースリップの除去、緩衝液中のセクションの洗浄、および神経化学的アイデンティティを明らかに一次および二次抗体のインキュベーションを必要とします。この方法は、DATを除去するために有利です。形態を回復し、形態学に基づいてテストされる神経化学的マーカーを絞ることができないことによる損失。

正常に完了すると、セクションでは、ビオサイチンフィルと免疫標識は、ステップ2で行われ、共焦点またはエピ蛍光顕微鏡を用いて画像化することができる保持します。また、処理されたセクションはまた、図2に示すセクションでは、ステップ3で、その後の処理中に標識された抗原のための免疫染色が表示され、肉厚部（300ミクロン）でビオシチンで満たされたニューロンの形態は、ストレプトアビジンを用いて明らかにしました赤で可視化し、最初のプライマリ（CB 1 R）が緑色で可視化しました。最初の免疫染色は、PFA固定の7日以内に実施されました。スライスは、CCK抗体について再染色する前に、共焦点顕微鏡を用いて画像化、2ヶ月の期間保存された、水性マウンティング培地中にマウントしました。軸索のアーバー（ 図2E）を含む記録されたニューロンの形態を、メモ、共焦点画像oから再構築しました最初の染色手順後btained。 CB 1 R免疫反応性（ 図2 F - H）...

このプロトコルは、ビオシチン充填およびその後の免疫組織化学的後処理を使用して電気生理学的記録の中にパッチを適用したニューロンの形態学的回復のための方法を提示しています。我々は、染色し、カバーガラスをした厚いビオシチン充填された部分は、後に第二次抗体日または数ヶ月で再染色することができることを示しています。

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing ...

このプロトコルの目的は、特定の抗体で再染色して神経化学的同一性を決定する前に、形態の回復のためのバイオシチンおよび免疫染色を使用して、電気生理学的記録中にパッチされたニューロンを同定するための効率的な方法を提示することです。したがって、この方法は、ニューロンの構造と機能の多様性を研究するために必要な重要なステップを説明しています。これは、脳ネットワークにおけるそれらの役割を理解するために不可欠です。シーケンシャル処理技術を使用する主な利点は、形態を回復できないためにデータ損失がなくなることです。したがって、これは、これらの細胞でテストされる神経化学マーカーを導くのにも役立ちます。この方法は、厚い切片の細胞の形態学的回収について説明していますが、薄い切片や、以前に染色およびマウントされたサンプルにも適用できます。一般に、この方法に新規に導入した中性体は、細胞から剥離しながら体細胞を再密封するのが困難であり、正常な充填のための十分な時間を確保できない場合があります。完全な形態を回復するためには、細胞の効果的なバイオサイトン充填に特定の技術が必要であるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。この手順を開始するには、電圧クランプ構成で、セルに近づきながら、浴モードでメンブレンテスト機能を使用して小さな短い電圧ステップを印加します。吸引を適用してセルにパッチを当てます。次に、セルをマイナス70ミリボルトに保持します。ギガオームシールの開発に注意してください。容量性過渡現象を補正し、シリンジまたは経口で制御された吸引を適用して、全細胞構成を実現します。全細胞の静電容量と直列抵抗を推定し、メンブレンテストパルスを停止します。直列抵抗は10メガオーム未満が最適です。これにより、バイオサイトン充填を可能にする全細胞記録条件の確立が保証されます。生理学的記録が完了したら、電圧クランプモードで記録ピペットを小さなステップでゆっくりと動かし、上向きと外側に交互に動かして、パッチクランプ構成を再確立します。細胞の形態学的回復を達成するための最も重要なステップは、記録ピペットを細胞から取り外しながら、ニューロン体細胞の再封止を確実にすることです。メンブレンテスト機能を使用して、容量性過渡現象の損失と直線に対する電流応答の崩壊を視覚化します。これは、セルの再シーリングとピペット先端の外側のアウトパッチの確立を示しています。その間、細胞を脱分極電位に保持すると、再封止プロセスが容易になります。ピペットを細胞から取り外した後、スライスを記録チャンバーに3〜5分間保持して、色素が遠位樹状突起および軸索突起に輸送されるようにします。次に、スライスを4%PFAを含む24ウェルプレートに移して固定します。PFA固定の24〜48時間後、すべての固定スライスをゼロポイント1モルPBSに移して免疫染色前に保存してください。この手順では、組織をゼロポイント1モルPBSでそれぞれ10分間3回洗浄します。次に、室温で10%ブロッキング血清で組織をブロックします。その後、一次抗体CB1Rの切片を室温で一晩インキュベートし、カンナビノイド受容体1型発現を同定します。次に、脳切片を0.1モルPBSでそれぞれ10分間3回洗浄します。ストレプトアビジンと一次抗体に対する二次抗体の両方をウェルプレートに添加し、摂氏4度で一晩保持します。その後、ストレプトアビジン赤色色素コンジュゲートの切片を摂氏4度で暗所で一晩インキュベートし、ビオシチンを明らかにします。その後、0.1モルPBSで脳切片をそれぞれ10分間、3回洗浄します。蛍光を保護し、将来の再染色を容易にするために、切片を等間隔の封入剤に封入します。カバースリップの端を透明なマニキュアで密封します。このステップでは、アセトンの綿棒でスライドガラスからマニキュアを剥がします。細い先端鉗子を使用してカバースリップを慎重に取り外し、切片に0.1モルPBSの液滴を数滴置きます。水性封入剤から組織をアンマウントする際に、プロセス組織を損傷しないことが重要です。細い絵筆を使用してスライドからセクションを慎重に取り外し、シェーカーで0.1モルPBSで24〜48時間洗い、摂氏4度の光を避けます。封入剤を完全に除去するために、翌日に切片を0.1モルPBSで毎回10分間、1回から2回洗浄します。次に、切片を2番目の一次抗体であるコレシストキニンと1日間インキュベートします。脳切片を0.1モルPBSでそれぞれ10分間3回洗浄します。続いて、フルオロフォア標識二次抗体ヤギ抗マウスで切片を染色します。二次抗体の励起発光スペクトルがストレプトアビジンおよび以前の免疫蛍光染色と重ならないようにします。その後、切片を水性封入剤に封入します。カバースリップの端を透明なマニキュアで密封します。バイオサイトチンの充填に成功し、最初の免疫染色プロセスを行った後、60倍の倍率で得られた共焦点画像に示すように、ニューロン構造を視覚化およびイメージングすることができます。この切片は、ビオシチンと共に CB1R についても免疫染色されており、ニューロン体細胞を発現するバイオサイトンにおける CB1R の免疫染色は矢印で示されています。同じ切片を1週間後にCCK免疫反応性について処理し、画像はアスタリスクで示されたいくつかのニューロンにおけるCCK免疫標識の回復が成功したことを示しています。矢印で示されたバイオサイトン標識細胞はCCKを発現しなかったことに注意してください。パネル A、B、C の結合画像は、3 つの標識すべてが堅牢に可視化されており、バイオシチンと CB1R の重なりが明らかであることを示しています。この画像は、2回目の免疫染色プロセスが前の染色プロセスからのシグナルを損なわないことを示しています。バイオシチン充填細胞の形態は、このCCK免疫染色に先立つ共焦点画像から取得しました。重要なことは、体細胞と樹状突起に加えて、軸索を視覚化でき、CB1R とバイオサイトチン標識された軸索突起の共標識が観察されることです。この手順を試みるときは、プロセスが切断されたニューロンを避けるために、スライス表面の下にある健康な細胞を標的にすることが重要です。そして、それは形態の回復を損なう可能性があります。習得すると、パッチクランプ記録中にバイオサイトン充填細胞の形態学的回復を確実に得ることができます。シリアル免疫染色技術の導入が成功すると、データ回収の効率が向上し、標準的なパッチクランプ記録中のニューロンの特性評価が容易になります。このビデオを見れば、バイオサイトンを充填した細胞を効果的に使用して神経細胞の形態を回復し、神経化学的マーカーを決定する方法についてよく理解できるはずです。

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可視化のためのラット海馬スライスにおけるビオシチン充填介在ニューロンの標識

出典:Núñez, F. J., et al. Evaluation of Biomarkers in Gliomas by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures. J. Vis. Exp.

脳腫瘍ニューロスフェア切片におけるバイオマーカーの免疫組織化学的染色

神経回路網の構造を理解するために、個々のニューロンの機能的および形態学的特徴付けが必要である。ここで、我々はまだ、細胞内で樹状および軸索建築の事後再構築のために、ニューロンを標識する能力を維持し、細胞外の構成で電気生理学的記録を可能にするjuxtasomalビオシチンラベルを示しています。...

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学ぶバイオシチン充填と免疫染色による神経細胞形態回復法。電気生理学的記録後に神経化学マーカーを同定し、脳ネットワークにおける神経細胞の構造と機能の多様性を解明する効率的な手法です。

神経化学的マーカーのためのビオシチンで満たされたと加工セクションの免疫染色

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