Name: サル免疫不全ウイルス特異的CD8の分析 +ペプチドMHC-I四量体染色によりアカゲザルにおけるT細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: 学ぶSIV特異的CD8⁺T細胞の解析法。アカゲザルPBMCを用いたペプチドMHC-I四量体染色とフローサイトメトリーにより、ワクチンまたは感染誘導の抗原特異的T細胞応答を直接定量評価する。

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私たちは、本発明の方法論の最適化を可能にした実験を支援するためのデビッド・ワトキンスに感謝したいと思います。この刊行物で報告された研究は、受賞数P30AI073961の下で国立衛生研究所のエイズ研究のためのマイアミセンターが提供するパイロット助成金によって部分的にサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

この原稿で利用末梢血単核細胞（PBMC）のサンプルは、ウィスコンシン国立霊長類研究センターに収容インドのアカゲザルから得ました。これらの動物は、ウィスコンシン大学院動物実験委員会33の大学によって承認されたプロトコルの下ウェザーレポートに従って世話しました。すべての動物の手順は、麻酔下で実施し、すべての努力は、潜在的な苦痛を最小限にするために行われました。 1. PKI治療注：これはオプションですが、MAMU-B * 017に推奨：01四量体。 結果と考察セクションを参照してください。 <ol><li> 1.6×10 7細胞/ mlの濃度で、R10培地中で再懸濁PBMC。 </li><li>サイトメトリーチューブ対応するフローにこの細胞懸濁液の50μlのを追加します。各チューブにPKIの100 nMの溶液50μlを追加します。 </li><li>各チューブをボルテックス。 37℃で30分間インキュベートします。このの終わりまでにステップは、各チューブは、8.0×10 5 PBMCおよびPKIの50 nMのを含む100μlの細胞懸濁液を持っている必要があります。 </li><li> pMHC-I四量体染色工程に進みます。 </li></ol>蛍光色素で標識されたのpMHC-I四量体2.染色<ol><li> pMHC-Iテトラマーマスターミックスを準備する前に、4℃で少なくとも15分間、20,000×gで遠心分離器のpMHC-I四量体チューブを。このステップの目的は、バックグラウンド染色を増加させることができるのpMHC-I四量体溶液中のタンパク質凝集体をペレット化することです。遠心分離工程が行われると、タンパク質凝集体が蓄積してきたであろう、チューブの底からピペッティングを避けます。 </li><li>すべての実験のチューブを染色するのに十分なのpMHC-I四量体のマスターミックスを調製します。エラーをピペッティングするためのアカウントにこのマスターミックスの総体積の15％の過剰を準備します。 </li><li>染色バッファー（ 例えば 、ブリリアントステインバッファー）中の希釈のpMHC-I四量体のpMHC-Iテトラマーマスターミックス25μlをADDEになるように、各テストにD。 <ol><li>テストごとに2つのpMHC-I四量体でラベルPBMC。ブリリアントバイオレット（BV）421にアロフィコシアニン（APC）およびその他に結合1。 </li></ol></li><li> 100μlの最終体積でチューブサイトメトリー対応するフローに8.0×10 5 PBMCを追加します。細胞は上述のPKI処理を行った場合は、既にこの段階で、100μl中に再懸濁されるべきです。 </li><li>サイトメトリーチューブ対応するフローへのpMHC-Iテトラマーマスターミックス25μlのを追加します。このステップの終わりまでに、各チューブ内の最終容量は125μlであるべきです。 </li><li>細胞懸濁液を均質化するために各チューブをボルテックス。 </li><li> 45分間室温で暗所でインキュベートします。この45分間のインキュベーションの間に表面染色mAbのカクテルを準備します。 </li></ol> 3.表面染色<ol><li>すべての実験のチューブを染色するのに十分なmAbのマスターミックスを調製します。アカウントにこのマスターミックスの総体積の15％超過を準備ピペット操作エラーの。 </li><li> 50μlのは、テストごとに追加されるように、染色バッファーでマスターミックスの音量を調節します。 </li><li>適切な非CD8 + T細胞の排除およびメモリサブセットの描写のために、使用は、表面染色マスターミックスの次の分子に対して向けられたモノクローナル抗体の量を滴定しました。 注：CD14 BV 510、CD16 BV 510、CD20 BV 510、CD8αBV 785、CD28 PE Cy7の、およびCCR7 FITC：各モノクローナル抗体に結合させた蛍光色素は、参考資料としてご提供するものです。 CD14、CD16、およびCD20に対するmAbは、それらが「ダンプ」ゲートに含まれることになるので、同じ蛍光色素（ すなわち、BV 510）に結合されていることに注意してください。 </li><li> [ すなわち、アミン反応性染料（ARD）]表面染色マスターミックスに死細胞を識別するための固定可能な染料を含めます。 ARD試薬は、「ダンプ」ゲートに使用されるものと同様の発光スペクトルと蛍光色素に結合していることを確認します。この場合、ARDアクアを使用します。 </li><li> 50μlのを追加します。染色マスターミックスチューブサイトメトリー対応するフローを3.1〜3.4にします。このステップの終わりまでに、各チューブ内の最終容量は175μlであるべきです。 </li><li>各チューブをボルテックス。 25分間室温で暗所でインキュベートします。 </li><li>洗浄緩衝液（PBSウシ血清アルブミン、0.1％を含有する溶液0.45グラム/ LのNaN 3）で細胞を洗浄します。 注意：アジ化ナトリウムは有毒物質です。でも、微量への暴露は、症状を引き起こす可能性があります。これらの実験は行われている教育機関での環境・健康・安全（EHS）オフィスで指定されたガイドラインに従って、この物質を取り扱います。 </li><li> 5分間、510×gで遠心分離管。慎重に個別の廃棄物容器に上清をデカントします。ペレットを乱さないようにしてください。 注意：それは洗浄緩衝液中でアジ化ナトリウムの存在と反応し、有毒ガス34の形成をもたらすことができるように漂白剤を含むリザーバーに洗浄緩衝液上清をデカントしないでください。 C言語これらの実験は、アジ化ナトリウムを処分する方法のガイドラインのために行われている教育機関でEHSオフィスをontact。 </li><li>デカントした後、各チューブ内に保持残った液体中の細胞をボルテックス。 </li></ol> 4.細胞固定<ol><li>細胞を固定するために、すべてのチューブに2％パラホルムアルデヒド（PFA）の溶液250μLを加えます。 注意：PFAは有毒物質です。でも、微量への暴露は、症状を引き起こす可能性があります。これらの実験は行われている教育機関でEHSオフィスで指定されたガイドラインに従って、この物質を取り扱います。 <ol><li> 2％PFA液を細胞に等張性でなければならないので、この溶液を調製し、PBSを使用しています。 2％PFA溶液を100ミリリットルの複数の実験のために十分です。十分にすぐに細胞凝集体の形成を防止するために、2％PFAを添加した後、全てのチューブをボルテックス。 </li></ol></li><li> 20分間4℃で暗所でインキュベートします。 </li><li> Wステップ3.7から3.9を繰り返して灰細胞。このステップが完了すると、細胞は24〜48時間、4℃で暗所に保存することができます。透過処理の段階に進む前に、徹底的にチューブをボルテックス。 </li></ol>細胞の5.透過処理<ol><li>透過化緩衝液500μlを追加します。ボルテックスすべてのチューブ。 </li><li> 10分間室温で暗所でインキュベートします。 </li><li>ステップ3.7から3.9を繰り返して細胞を洗浄。 </li></ol> 6.細胞内染色<ol><li>すべての実験のチューブを染色するのに十分なmAbのマスターミックスを調製します。 </li><li>細胞内のmAbマスターミックス50μlのは、テストごとに追加されるように、PBSまたは染色バッファーで音量を調整します。 </li><li> CD3およびGZM B.に対して向けられたmAbの滴定量を用いて6.1および6.2に記載されたmAbのマスターミックスを調製します 注：のpMHC-I四量体によってTCR結合は、四量体+ CD3 + CD8の検出を妨害することができますCD3内在、+になることができますT細胞を、抗CD3 mAbで表面染色マスターミックスに追加された場合。細胞を透過性にした後、これを回避するために、この段階では、抗CD3モノクローナル抗体を加える、つまり、。 CD3 PerCPをCy5.5標識とGZM B PE：各mAbに結合させた蛍光色素は、参考として記載されています。 </li><li>対応するチューブにモノクローナル抗体カクテルの50μlのを追加します。 30分間室温で暗所でインキュベートします。 </li><li>ステップ3.7から3.9を繰り返して細胞を洗浄。チューブは、フローサイトメーターで取得する準備ができています。 </li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

この手順のメリットの議論におけるいくつかのステップは、彼らが最適な結果をもたらすために重要であるとして。生物試料の品質が任意のフローサイトメトリーアッセイ38の成功の強力な予測因子であるので、まず、すべてのケアは、細胞が染色手順の間に実行可能な及び懸濁液中であることを保証するために注意しなければなりません。凍結保存したサンプルで作業するとき、彼らは凝集しやすいであり、典型的に死んだ細胞のより高い数字を含むので、これは特に関連します。これらのケースでは、前のpMHC-I四量体標識操作に70μmのセルストレーナーを介して細胞懸濁液を渡すと、実質的な結果を改善する可能性があります。第二に、アッセイで使用される蛍光色素の適切な補償は、複数のパラメータが同じ実験で評価されている場合は特に、正確なデータ分析のために重要です。この点で、新鮮な単一色補正コントロールは、すべてののpMHC-I四量体のために準備することをお勧めしますアッセイをtaining。私たちは、その広い抗Ig反応性と、彼らは正と負の集団の明確な二峰性の分布を得ているという事実の補償ビーズの使用を好みます。これらのビーズは、MHC-I分子に結合しないので、抗体は...

それらは、腫瘍免疫監視に関与し、細胞内病原体1の撲滅に寄与するようにCD8 + T細胞は、適応免疫系の重要な成分を含みます。簡単に言えば、CD8 + T細胞は、特異的に、宿主細胞の原形質膜上に存在するI（のpMHC-I）分子をペプチド-主要組織適合性複合体クラスを認識するT細胞受容体（TCR）を発現します。これらのペプチドは、内因的に合成されたタンパク質のタンパク質分解に由来するので、細胞表面のpMHC-I複合体は、細胞内環境にウィンドウを提供します。ウイルス感染時に、例えば、感染した細胞は、CD8 + T細胞をパトロールによって発現のTCRに対するリガンドとして機能することができるウイルス由来のペプチドを含むMHC-I分子を表示します。ウイルス特異的CD8 + T細胞は、そののpMHC-Iリガンドを提示する感染細胞を検出した場合には、TCRの関与は、CD8 + T細胞の活性化とultiをもたらしますmately細胞溶解をターゲットにつながります。 CD8 + T細胞応答の大きさ、特異性、および表現型を決定し、これらのTCR /のpMHC-Iの相互作用の重要性を考えると、多くの場合、ヒトの疾患についての重要な手がかりを明らかにすることができます。 1990年代初頭までは、Ag特異的CD8 + T細胞の定量化は、技術的に厳しい限界希釈アッセイ（LDA）2,3に依存していました。だけでなく、LDAが完了するまでに数日必要でしたが、それはまた、増殖能力を欠いていた細胞を検出することができませんでした。その結果、LDAは非常に免疫反応に関与する抗原銀（Ag）特異的CD8 + T細胞を実際の頻度を過小評価しました。 ELISPOTおよび細胞内サイトカイン染色アッセイの開発は非常に細胞性免疫を測定する能力を改善したが、これらの方法は依然としてAg特異的T細胞4を定量するためのインビトロ刺激を必要としました。それは1996年アルトマン、デイビス、および高専までではなかったですeaguesはのpMHC-I四量体技術5の開発を報告し、その画期的な記事を掲載しました。この技術の成功に重要なことにより、フローサイトメトリーアッセイの洗浄ステップ中に脱落のpMHC-I四量体の可能性を低減する、TCR /のpMHC-Iとの相互作用の半減期延長のpMHC-I分子の多量体でした。上記アッセイ上のpMHC-I四量体の主な利点は、正確に、インビトロ再刺激を必要とすることなく、直接ex vivoでのAg特異的CD8 + T細胞を検出する能力です。また、マルチカラーフローサイトメトリーでのpMHC-I四量体染色の組み合わせは、分化段階、メモリー表現型、およびAg特異的CD8 + T細胞2-4の活性化状態の詳細な分析を可能にしました。 6染色多量のpMHC-IによりCD8 + T細胞レパートリーを特徴付けるための最近の技術の進歩を考慮して、アプリケーションの幅FORこの方法論は引き続き拡大する可能性があります。 生物医学研究におけるいくつかの領域は、HIV免疫学7のフィールドよりのpMHC-I四量体染色からより多くの恩恵を受けています。 CD8 + T細胞は、時間的アルトマン、デイビス、と同僚8,9によって公開時点によってHIVウイルス血症の初期制御に関連付けられていたが、その後の年のpMHC-I四量体の使用が大幅に我々の理解を拡大しましたHIV特異的CD8 + T細胞応答。例えば、のpMHC-I四量体染色は、ほとんどのHIV感染者10月12日におけるウイルス特異的CD8 + T細胞応答の強固な大きさを確認助けました。この方法はまた、HIVおよび抗レトロウイルス療法、「エリート制御」として知られる現象の非存在下でのウイルス複製の自発的なコントロールに関連付けられたMHC-I分子によって制限SIV特異的CD8 + T細胞応答の特徴付けを容易に<suP&gt; 13-15。また、のpMHC-I四量体は、制御されていない慢性感染におけるHIV特異的CD8 + T細胞の機能不全の表現型に可逆経路としてプログラム死1（PD-1）/ PDリガンド1（PD-L1）軸の確立に尽力しました16,17。まとめると、これらの研究は、AIDSウイルスに対してCD8 + T細胞応答をモニターするためのpMHC-I四量体の有用性を強調する。 アカゲザル（ アカゲザル ）の実験SIV感染は、HIV / AIDS 18,19に対する免疫介入を評価するための最良の動物モデルのまま。過去25年間で、実質的な進歩がMHC-I対立遺伝子の発見およびペプチド結合モチーフ13,20-27の定義を含め、このサル種におけるSIV特異的CD8 + T細胞の同定および特徴付けになされたもので。その結果、のpMHC-I四量体は、SIV特異的CD8 + T細胞の分析のために開発されていますこの動物モデル28における応答。 MAMU-A1はMAMU-A1は*、001 * 002：：、01 MAMU-B * 008：これらの試薬のほとんどは、4アカゲザルMHC-I対立遺伝子の遺伝子産物で作られている01、およびMAMU-B * 017：01。注目すべきは、アカゲザルは、MHC-C遺伝子座29を発現しません 。本実験で使用したのpMHC-I四量体の大部分はエモリー大学のNIH四量体コア施設で生産されました。それにもかかわらず、免疫優性のGag CM9エピトープに結合MAMU-A1 * 001四量体を含む、これらの試薬のいくつかは、唯一のライセンス契約のために商業的供給源から得ることができます。上記の4つのアカゲザルの対立遺伝子のpMHC-I四量体を使用して、我々は、ワクチン接種またはプライマリSIV感染30,31によって誘導された21 SIVエピトープ（ 表1）の合計に対して、CD8 + T細胞を正常に列挙している（マーチンらら 、未発表の観察）。 現在の原稿が提供しますアカゲザルにおけるSIV特異的CD8 + T細胞の頻度および記憶表現型を決定するためのpMHC-I四量体染色プロトコルを最適化しました。 TCRの内在化を減少させ、それによってのpMHC-I四量体染色32を改善するために、アッセイは、タンパク質キナーゼ阻害剤（ここでは、ダサチニブが使用されるPKI）で待機30分のインキュベーションで始まります。 01四量体：後述するようにMAMU-B * 017を使用している場合、この治療は、特に有用です。蛍光標識のpMHC-I四量体およびモノクローナル抗体（mAb）で細胞を標識する方法の説明も提供されます。このプロトコルはまた、細胞溶解関連分子のグランザイムB（GZM B）の細胞内検出のための細胞透過のステップを含みます。 CD3に対するmAbは、このTCRシグナル伝達分子の検出を向上させるだけでなく、この工程で添加されます。参考として、この染色パネルに用いられる全ての蛍光色素が記載されています。

<table><tbody><tr><td>ダサチニブ</td><td>Axon medchem</td><td>Axon&nbsp;1392</td><td>DMSOに再懸濁し、すぐに-20°Cで保管する必要があります。C</td></tr><tr><td>RPMI w / Glutamax</td><td>gibco / Life Technologies</td><td>61870-036</td><td>4°Cで保管する必要があります。C&nbsp;</td></tr><tr><td>熱不活性化FBS</td><td>gibco / Life Technologies</td><td>10082-147</td><td>4°Cで保管する必要があります。C&nbsp;</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンB</td><td>ロンザ</td><td>17-745E</td>は<td>4°Cで保存する必要があります。C&nbsp;</td></tr><tr><td>DMSO、無水</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズD12345</td>室温<td>で保存してください。</td></tr><tr><td>5 ml丸底ポリプロピレンチューブ</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr>蛍光<tr><td>色素共役pMHC-IテトラマーNIH</td><td>テトラマーコアまたはMBL、Inc.</td><td></td><td>使用前に、4°Cで20,000 x gで15分間遠心分離機に保管および維持する必要があります。凍結しないでください。</td></tr><tr><td>蛍光色素標識mAbs</td><td>さまざまな企業が</td><td></td>&<td>nbsp; 4°Cで保管および保守する必要があります。凍結しないでください。</td></tr><tr><td>生きる/死ぬ&nbsp;フィックス可能なアクア&nbsp;死んだ&nbsp;Cell Stain Kit</td><td>Life Technologies</td><td>l34957</td> -<td>20°Cで保存する必要があります。使用前のDMSOのl。</td></tr><tr><td>Brilliant Stain Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>563794</td> &<td>nbsp; 4 °Cで保管する必要があります。C&nbsp;</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水</td><td>VWR</td><td>97064-158</td>室温<td>で保存</td></tr><tr><td>アルブミン牛</td><td>VWR</td><td>700011-230</td><td>&nbsp; 4 > で保存する必要があります。C&nbsp;</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>室温で保管してください。有毒物質。漂白剤と混ぜないでください。</td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>VWR</td><td>89501-620</td><td>腐食性化学物質、アジ化ナトリウムと混合することはできません。パラ</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15714-S</td>可燃性<td>、腐食性、毒性のある試薬の取り扱いに注意してください。取り扱いには注意が必要</td></tr><tr><td>ポリソルベート 20 (Tween-20)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L15029</td><td>室温で保存</td></tr><tr><td>透過化溶液 2&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>340973</td><td>毒性および腐食性試薬。お手入れのハンドル</td></tr><tr><td>Sarsdet チューブ 1.5 ml スクリュートップ</td><td>VWR</td><td>72.692.005</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml DNA/RNA 低結合チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>22431048</td><td>滅菌マイクロチューブの使用が推奨されます&nbsp;</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td> 科学者<td></td><td></td><td>の裁量に</td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット&nbsp;</td>科学者<td></td><td></td><td>の裁量に</td></tr><tr><td>ミリQインターグラル水浄化システム</td><td>EMDミリポア</td><td>ZRXQ010WW</td><td>分子生物学グレードの水 任意のプロバイダーから</td></tr>マイクロ<tr><td>遠心分離</td>機を使用できます <td>科学者</td><td></td><td></td>の裁量に</tr><tr><td>遠心分離</td>機 <td>科学者</td><td></td><td></td>の裁量に</tr><tr><td>4 °;C&nbsp;冷蔵庫</td> 科学者<td></td><td></td><td>の裁量により</td></tr>、<tr><td>BD LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>フローサイトメーターには、使用する染色パネルと互換性のあるレーザーとフィルターが含まれている必要があります。</td></tr><tr><td>脱イオン水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>VWR SCIENTIFIC INC.</td><td>89068-738</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td></td><td></td>は<td>37°Cを維持できなければなりません。C&nbsp;内部温度</td></tr><tr><td>FACS Diva ソフトウェア</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowjo ソフトウェアバージョン 9.6</td><td>Flowjo</td><td></td><td>FACS Diva ソフトウェアによって生成された FCS ファイルの分析に使用</td></tr><tr><td>Micropippette tips</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

サル免疫不全ウイルス特異的cd8の分析 +ペプチドmhc-i四量体染色によりアカゲザルにおけるt細胞

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

ペプチド-主要組織適合性複合体クラスI（のpMHC-I）四量体は、CD8 + T細胞応答を研究するための貴重なツールとなっています。これらの試薬は、直接CD8 + Tリンパ球の表面上のT細胞受容体に結合するので、蛍光色素標識のpMHC-I四量体は、抗原（Ag）からの正確な検出を可能にする特異的CD8 + T細胞のin vitro再を必要とせず-刺激。マルチカラーフローサイトメトリーと組み合わせた場合にさらに、のpMHC-I四量体染色は、分化段階、メモリー表現型および活性化状態を含む、Ag特異的CD8 + T細胞の重要な側面を明らかにすることができます。分析のこれらのタイプは、CD8 + T細胞は、AIDSへの進行に影響を与える可能性がHIV免疫学の分野において特に有用です。サル免疫不全ウイルス（SIV）とアカゲザルの実験的感染は、エイズウイルスに対する細胞性免疫を研究するための貴重なツールを提供します。その結果、かなりのprogreSSは、この動物モデルにおいてT細胞応答を定義し、特徴付けるてなされたものです。ここでは、のpMHC-I四量体染色によりアカゲザルでSIV特異的CD8 + T細胞を列挙するための最適化されたプロトコルを提示します。私たちのアッセイは、ワクチン接種またはSIV感染によって生成されたSIV特異的CD8 + T細胞応答を追跡するのに有用である可能性がありますテストごとに2つのpMHC-I四量体+ CD8 + T細胞集団の同時定量およびメモリ表現型解析が可能になります。生物医学研究における非ヒト霊長類の妥当性を考慮すると、この方法は、複数の疾患の設定におけるCD8 + T細胞応答を研究するために適用可能です。

ここで説明するプロトコルは、MAMU-A1 * 001 +アカゲザルにおけるワクチン誘導性のGag CM9特異的CD8 + T細胞応答の大きさ及びメモリ表現型を決定するために使用されています。この分析のために、APC結合MAMU-A1 * 001 /ギャグCM9四量体は、8色フローサイトメトリー染色のパネルに使用しました。 図1Aは、 - Fは、各テスト中に存在する両方の四量体に適用されるべきデータを分析するために使用されるゲーティング戦略を示しています。 pMHC-I四量体+ CD8 + T細胞集団がよく、最小限の背景（ 図1FおよびG）で分離されていることに注意してください。 ;、過渡的なメモリ（T EM1; CD28 + CCR7-）、およびエフェクター中央メモリ（CD28 + CCR7 + T CM）：アカゲザルにおけるメモリ...

ここでは、エイズウイルスに対するアカゲザルCD8 + T細胞を列挙し、特徴づけるための最適化されたプロトコルを提示します。この記事では、HIV免疫学の分野にだけでなく、CD8 + T細胞応答が疾患の転帰に影響を与えることが知られている生物医学研究の他の分野のみならず便利です。

サル免疫不全ウイルス特異的CD8の分析 +ペプチドMHC-I四量体染色によりアカゲザルにおけるT細胞

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

このアッセイの全体的な目標は、ワクチン接種または一次感染によって生成されたサル免疫不全ウイルス特異的CD8陽性T細胞集団を列挙し、特徴づけることです。この方法は、ワクチン接種または感染によって誘導される抗原特異的CD8 T細胞の頻度など、T細胞免疫学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、in vitroでの再刺激を必要とせずに、ex vivoで直接得られた生体サンプル中の抗原特異的CD8 T細胞を定量できることです。この手法の意味は、アカゲザルの切開特異的CD8 T細胞の評価や、複数の疾患設定におけるCDB T細胞応答の研究にまで及びます。一般に、この方法に不慣れな人は、アカゲザルのMHC遺伝学に関する知識が不完全であること、またフローサイトメトリー染色には正確な抗体の適用が必要であるため、苦労するでしょう。まず、アカゲザルPBMCをR10培地に再懸濁します。1ミリリットルあたりの7番目の細胞濃度に1.6倍の10を加えます。50マイクロリットルの細胞を適切な数のフローサイトメトリーチューブに分注し、各チューブに50マイクロリットルのプロテインキナーゼ阻害剤を添加します。各チューブをボルテックスし、サンプルを摂氏37度で30分間インキュベートします。適切な量の滴定ペプチドMHCテトラマーを、すべての実験チューブを染色するのに十分なマスターミックスで希釈する必要があります。したがって、ピペッティングエラーを考慮するために、マスターミックスを15%過剰に調製することが重要です。細胞をインキュベートしている間に、遠心分離によりタンパク質凝集体を四量体溶液中にペレット化し、バックグラウンド染色を最小限に抑えます。次に、テトラマーを十分な染色バッファーで希釈し、25マイクロリットルのテトラマーマスターミックスを各フローサイトメトリーチューブに添加できるようにします。次に、サンプルチューブをボルテックスし、PBMCテトラマー溶液を暗所で室温で45分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、50マイクロリットルの染色マスターミックスを適切なサンプルチューブに加えます。そして、ボルテックスのためにチューブを混合します。室温で25分間暗所で細胞を洗浄し、細胞を遠心分離してペレット化し、ペレットを乱さずに上清を慎重にデカントします。各チューブの残りのバッファーで細胞をボルテックスし、チューブあたり250マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒドでサンプルを固定します。すぐにボルテックスし、暗闇の中で摂氏4度でチューブをインキュベートします。20分後、細胞を新鮮な洗浄バッファーで洗浄します。遠心分離により細胞をペレット化し、ペレットを乱さずに上清をデカントします。細胞を500マイクロリットルの透過化緩衝液、ボルテックスに再懸濁し、暗所で室温で10分間インキュベートします。次に、細胞を洗浄してペレット化します。次に、前述のように上清をデカントします。50マイクロリットルの細胞内染色マスターミックスを適切なチューブに加えます。各サンプルをボルテックスし、室温で暗所で30分間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、細胞を洗浄してペレット化します。これで、サンプルをフローサイトメーターで取得する準備が整いました。Mamu-B017.01四量体は通常、薄暗い染色をもたらしますが、これはプロテインキナーゼ阻害剤による細胞の前処理によって大幅に改善できます。バックグラウンド染色を避けるために、目的の抗原特異的CD8陽性T細胞集団を含むまたは含まないMHCクラス1適合細胞を標識し、関連する四量体と複数回希釈して、四量体陽性と陰性のCD8陽性T細胞間の最適な分離をもたらす最適量を決定する必要があります。これらのグラフでは、Mamu-A 01陽性のアカゲザルにおけるワクチン誘発性Gag CM9特異的CD8陽性T細胞応答の大きさと記憶表現型を分析するために使用されたゲーティング戦略が示されています。四量体陽性CD8陽性T細胞集団は、バックグラウンド染色が最小限に抑えられ、十分に分離されていることに注意してください。また、メモリサブセットは、四量体ゲート内のCD28、CCR7、およびグランザイムBの発現によって明確に描かれています。このテクニックは、一度マスターすれば、きちんと行えば約3時間で完成させることができます。この手順を試行する際には、各抗体またはテトラマーマスターミックスに正しい試薬を添加し、実証されているように毎回実験チューブを操作することを忘れないでください。その開発後、この技術は、免疫学の分野の研究者が抗原特異的CD8 T細胞の特異性と表現型を探求する道を開きました。このビデオを見れば、ヒトHIV-1 AIDS研究のアカゲザルモデルのアッセイでMHCクラス1テトラマー染色を設定する方法について十分に理解できるはずです。アカゲザルの生体試料を扱うには、サンプル処理中に適切な個人用保護具を着用するなどの特別な予防措置が必要であることを忘れないでください。

analysis-simian-immunodeficiency-virus-specific-cd8-t-cells-rhesus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

この手順では、精製および抗原特異的CD4 + MHCクラスIIテトラマーを用いて全末梢血とその可視化から、T細胞のin...

抗原特異的CD4 + T細胞はMHCクラスIIテトラマーを用いての可視化

その場テトラマー染色やin situハイブリダイゼーション（ISTH）で組み合わせる手法は可視化、マッピングおよび分析、そのウイルスに感染したターゲットへのウイルス特異的CD8 +...

同時にウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染細胞を可視化するテクニックその場で</em

我々は、合計だけでなく、アカゲザルのCD4 +とCD8 + T細胞、HIV...

アカゲザルの細胞性免疫応答のマルチカラーフローサイトメトリー解析

エピトープ特異的T細胞の低周波の集団を区別し、フローサイトメトリーによって、それらを分析するためのMHCテトラマーと磁性マイクロビーズ：このプロトコルは、ペプチドの使用について説明します。この方法は、から対象の内因性T細胞集団の直接調査を可能に...

ペプチドエピトープ特異的T細胞のMHCテトラマーベースの濃縮

このビデオでは、ペプチド主要組織適合遺伝子複合体クラスI(pMHC-I)四量体を使用して、サル免疫不全ウイルス(SIV)に特異的なCD8+メモリーT細胞を特徴付ける方法を示しています。pMHC-I四量体は、SIV特異的ペプチドに結合し、蛍光色素に結合した4つのMHC-I分子の複合体です。これらの四量体は、SIV特異的CD8+...

SIV特異的CD8+メモリーT細胞を解析するためのペプチド-MHC-I四量体染色技術

ここでは、免疫組織化学的局在、表現型、組織における抗原特異的 T 細胞の量を決定するとその場でMHC テトラマー染色を組み合わせた手法について述べる。このプロトコルは、他のセルの種類および組織の構造を基準にして抗原特異的 CD8 T...

その場でMHC テトラマー染色と場所、豊富と組織における抗原特異的 cd8 陽性 T 細胞の表現型を決定するための定量解析

96 遺伝子の発現を量的に方法論が説明し、単一セルがex vivo、差動の同定を可能にする 18 の表面タンパク質は感染していない細胞を基準にしてウイルスに感染した細胞の遺伝子そして蛋白質を表明しました。+ T 研究 SIV 感染 CD4...

MRNA およびサル免疫不全ウイルス感染 cd4 表面タンパク質発現の単一細胞定量+ T 細胞孤立したアカゲザルから

ここでは、元のプロトコルを提案生体内抗原特異的 CD8 の定性的検出+ T 細胞。分析は、単一細胞懸濁液の臓器や血液量が少ないからで可能です。広範な研究には、細胞傷害性 T 細胞の反応 (予防接種・癌免疫療法研究)...

反ベクトルと反遺伝子特定 CD8 の同時定量+ T はマイク ウイルスベクターを用いたワクチン後染色テトラマー MHC を介して細胞

私たちは、磁気ビーズベースのT細胞濃縮およびペプチド:主要組織適合遺伝子複合体(MHC)四量体を通じて、マウス肺の希少抗原特異的T細胞集団を単離および同定するための詳細なプロトコールを提供します。...

ペプチド:主要組織適合遺伝子複合体四量体を用いたマウス肺由来の希少抗原特異的T細胞の同定

クロム放出アッセイ、細胞傷害性T細胞活性を検出するための一般的なアッセイは、いくつかの制限を有する。抗原特異的CD8...

xCELLigenceシステムにCR51リリースアッセイを比較することによって、人間Her2neu特異的CD8 T細胞の最適な細胞傷害活性を決定する

学ぶSIV特異的CD8⁺T細胞の解析法。アカゲザルPBMCを用いたペプチドMHC-I四量体染色とフローサイトメトリーにより、ワクチンまたは感染誘導の抗原特異的T細胞応答を直接定量評価する。

サル免疫不全ウイルス特異的CD8の分析⁺ペプチドMHC-I四量体染色によりアカゲザルにおけるT細胞

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