サル免疫不全ウイルス特異的CD8の分析 ⁺ペプチドMHC-I四量体染色によりアカゲザルにおけるT細胞

このアッセイの全体的な目標は、ワクチン接種または一次感染によって生成されたサル免疫不全ウイルス特異的CD8陽性T細胞集団を列挙し、特徴づけることです。この方法は、ワクチン接種または感染によって誘導される抗原特異的CD8 T細胞の頻度など、T細胞免疫学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、in vitroでの再刺激を必要とせずに、ex vivoで直接得られた生体サンプル中の抗原特異的CD8 T細胞を定量できることです。

この手法の意味は、アカゲザルの切開特異的CD8 T細胞の評価や、複数の疾患設定におけるCDB T細胞応答の研究にまで及びます。一般に、この方法に不慣れな人は、アカゲザルのMHC遺伝学に関する知識が不完全であること、またフローサイトメトリー染色には正確な抗体の適用が必要であるため、苦労するでしょう。まず、アカゲザルPBMCをR10培地に再懸濁します。

ミリリットルあたりの7番目の細胞濃度に1.6倍の10を加えます。50マイクロリットルの細胞を適切な数のフローサイトメトリーチューブに分注し、各チューブに50マイクロリットルのプロテインキナーゼ阻害剤を添加します。各チューブをボルテックスし、サンプルを摂氏37度で30分間インキュベートします。

適切な量の滴定ペプチドMHCテトラマーを、すべての実験チューブを染色するのに十分なマスターミックスで希釈する必要があります。したがって、ピペッティングエラーを考慮するために、マスターミックスを15%過剰に調製することが重要です。細胞をインキュベートしている間に、遠心分離によりタンパク質凝集体を四量体溶液中にペレット化し、バックグラウンド染色を最小限に抑えます。

次に、テトラマーを十分な染色バッファーで希釈し、25マイクロリットルのテトラマーマスターミックスを各フローサイトメトリーチューブに添加できるようにします。次に、サンプルチューブをボルテックスし、PBMCテトラマー溶液を暗所で室温で45分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、50マイクロリットルの染色マスターミックスを適切なサンプルチューブに加えます。

そして、ボルテックスのためにチューブを混合します。室温で25分間暗所で細胞を洗浄し、細胞を遠心分離してペレット化し、ペレットを乱さずに上清を慎重にデカントします。各チューブの残りのバッファーで細胞をボルテックスし、チューブあたり250マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒドでサンプルを固定します。

すぐにボルテックスし、暗闇の中で摂氏4度でチューブをインキュベートします。20分後、細胞を新鮮な洗浄バッファーで洗浄します。遠心分離により細胞をペレット化し、ペレットを乱さずに上清をデカントします。

細胞を500マイクロリットルの透過化緩衝液、ボルテックスに再懸濁し、暗所で室温で10分間インキュベートします。次に、細胞を洗浄してペレット化します。次に、前述のように上清をデカントします。

50マイクロリットルの細胞内染色マスターミックスを適切なチューブに加えます。各サンプルをボルテックスし、室温で暗所で30分間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、細胞を洗浄してペレット化します。

これで、サンプルをフローサイトメーターで取得する準備が整いました。Mamu-B017.01四量体は通常、薄暗い染色をもたらしますが、これはプロテインキナーゼ阻害剤による細胞の前処理によって大幅に改善できます。バックグラウンド染色を避けるために、目的の抗原特異的CD8陽性T細胞集団を含むまたは含まないMHCクラス1適合細胞を標識し、関連する四量体と複数回希釈して、四量体陽性と陰性のCD8陽性T細胞間の最適な分離をもたらす最適量を決定する必要があります。

これらのグラフでは、Mamu-A 01陽性のアカゲザルにおけるワクチン誘発性Gag CM9特異的CD8陽性T細胞応答の大きさと記憶表現型を分析するために使用されたゲーティング戦略が示されています。四量体陽性CD8陽性T細胞集団は、バックグラウンド染色が最小限に抑えられ、十分に分離されていることに注意してください。また、メモリサブセットは、四量体ゲート内のCD28、CCR7、およびグランザイムBの発現によって明確に描かれています。

このテクニックは、一度マスターすれば、きちんと行えば約3時間で完成させることができます。この手順を試行する際には、各抗体またはテトラマーマスターミックスに正しい試薬を添加し、実証されているように毎回実験チューブを操作することを忘れないでください。その開発後、この技術は、免疫学の分野の研究者が抗原特異的CD8 T細胞の特異性と表現型を探求する道を開きました。

このビデオを見れば、ヒトHIV-1 AIDS研究のアカゲザルモデルのアッセイでMHCクラス1テトラマー染色を設定する方法について十分に理解できるはずです。アカゲザルの生体試料を扱うには、サンプル処理中に適切な個人用保護具を着用するなどの特別な予防措置が必要であることを忘れないでください。