細胞分裂と拡張の動解析：成長とサンプリング発達ゾーンの細胞基礎での定量化トウモロコシ葉

この分析の全体的な目標は、トウモロコシの葉の成長の細胞基盤を決定し、これらのデータを使用して、発生段階固有のサンプリング戦略を実行することにより分子成長調節メカニズムを調査することです。この方法は、植物発生生物学における重要な問題に対処するのに役立ちます。細胞分裂と細胞増殖は、臓器全体の成長の違いにどのように寄与しますか?

このアプローチにより、植物器官全体の成長の根底にある生化学的、分子的、生理学的プロセスの調査と空間マッピングが可能になります。このシステムは、トウモロコシの葉の成長に関する洞察を提供できますが、この手法は他のシステムにも使用できます。他の草種や器官を含みます。

これらの方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。採取時には、そのデモンストレーションなしでは、サンプルの二分化と測定のステップを実行することは困難です。手順を実演するのは、Katrien SprangersとViktoriya Avramovaです。

私の研究室から2人の博士課程の学生。単子葉植物の葉の成長の完全な系統解析を行うには、成長室で制御された条件下で、処理と遺伝子型ごとに少なくとも15の植物を育てます。興味のある葉が現れたら、定規を使用して葉の長さ、つまり土から葉の先端までの長さを、葉が完全に広がるまで毎日測定します。

関心のある開発段階では、少なくとも5つの代表的な植物から植物の地上部分をできるだけ根の近くに切り取り、骨髄領域を無傷に保ちます。次に、外側の葉から始めて、目的の葉まですべての葉を1枚ずつゆっくりと広げます。必要に応じて、ベースから数ミリメートル余分なものを取り除き、葉を切り離します。

次に、頂点と目的の葉で囲まれた小さな葉を取り除き、葉から中央静脈の片側の基部から3センチメートルのセグメントを切り取ります。葉が茎に接続されている場所で葉を切ることが重要です。高く切ると、分裂組織のサイズを過小評価することにつながります。

セグメントを1.5ミリリットルの試験管に保管し、3つの2つの1容量の無水エタノール酢酸溶液を充填し、摂氏4度で24時間から数ヶ月まで保管します。静脈の反対側から、基部から11センチメートルのセグメントを切り取り、このセグメントを無水エタノールで満たされた15ミリリットルのチューブに摂氏4度で少なくとも6時間保存して、色素を除去します。4°Cの無水エタノールで2回目の24時間ラウンドした後、エタノールを純粋な乳酸に置き換え、さらに24時間、またはさらなる分析まで、セグメントを4°Cで保存します。

分裂組織を測定するには、まず3センチメートルの葉の部分を新しく準備したすすぎ緩衝液に20分間移します。インキュベーションの終わりに、セグメントをDapi染色溶液の容器に移し、暗闇の氷上で2〜5分間。次に、組織をガラス製の顕微鏡スライドにすばやく取り付け、セグメントをカバーガラスで覆います。

表皮細胞の蛍光を顕微鏡でUV蛍光で確認します。次に、新しいガラスカバー付きの新しい顕微鏡スライド上のリンスバッファーにサンプルをマウントします。20倍の倍率を使用して、セグメントを顕微鏡に戻し、サンプルをスクロールして増殖性有糸分裂像を見つけます。

発達中のステムマタの形成的な細胞分裂を避け、次に最も遠位の有糸分裂像がどこにあるかを定義します。画像解析ソフトウェアプログラムを使用して、画像フレームの全長を測定します。この例では、645 マイクロメートルです。

次に、最も遠位の有糸分裂像から葉の基部までの全分裂組織の長さをカバーするフレームの数を数え、この数に1フレームの長さを掛けて、全分裂組織の長さを求めます。細胞長プロファイルを取得するには、乳酸から11センチメートルのセグメントをベンチに移し、メスを使用して組織を1センチメートルのセグメントに10個に切断します。得られた葉の断片を1つの顕微鏡スライドに取り付け、乳酸を少量滴垂らします。

すべてのピースを同じ面を上にして配置します。次に、微分干渉コントラスト光学系を備えた顕微鏡でスライドを移します。葉の基部に最も近いセグメントから始めて、適切な画像解析ソフトウェアプログラムを使用して、ステムマタルファイルに直接隣接する少なくとも20の複製表皮細胞とファイルの長さを測定し、各セグメントに沿って等間隔の位置で同じ細胞タイプを一貫して選択できるようにします。

取るのは、葉全体の各測定値に対応する位置を右に下げることです。次に、補足ファイル 1 として利用可能な R スクリプトに実装されたローカル多項式平滑化手順を使用して、葉軸に沿った各ミリメートルでの平均セル長を決定します。滑らかにしすぎないように注意してください。

スムージングにより、セル データのノイズが除去されますが、曲線の全体的な形状には影響しません。ここでは、水やりが良好な植物と、葉の成長に関して干ばつストレス条件にさらされた植物との比較を示しています。対照植物の最終的な葉の長さは、葉の伸び率が低かったため、干ばつストレスを受けた植物よりも40%短くなりました。

干ばつでストレスを受けた植物の葉の伸び率は、細胞産生が減少するため、十分に水をやった対照群の葉の伸び率よりも73%低くなっています。これは、主に細胞分裂率の低下によって引き起こされます。運動学的分析は、葉の成長ゾーンの局在化のマップを提供し、分子および生化学的分析のためのサブゾーン分解能でのサンプリングを可能にします。

例えば、十分に水をまき、乾燥した条件にさらされた植物のトウモロコシの葉の成長ゾーンに沿ったMDA定量は、水分の源泉徴収条件に応じて、成長ゾーン全体でこの脂質分解の生成物が大幅に増加することを示しています。干ばつに反応して葉が短くなったため、この実験では、対照植物とストレスを受けた植物で発生ゾーンが一致しませんでした。ただし、細胞長プロファイルを使用して、発生ゾーンの長さを決定できるため、個々のゾーンのMDAレベルを比較できます。

一度習得すると、この手法が適切に実行されれば、1つのサンプルを4時間で処理できます。この手順を試みる際には、収穫中に分裂組織を無傷に保つことを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、分子パラメータや生化学的パラメータの決定など、他の手法を適用して、成長調節への関与を研究することができます。

このビデオを見れば、成長中のトウモロコシの葉の細胞分裂と細胞増殖を定量化する方法、さまざまな成長ゾーンのサイズを決定する方法、それに応じて分子データと生化学データを解釈する方法を十分に理解できるはずです。乳酸や酢酸、EDTAの取り扱いには危険が伴うことを忘れないでください。したがって、この手順を実行するときは、手袋を着用し、使用後は各段階で顕微鏡を清掃するなどの予防措置を常に講じる必要があります。