Name: 回復時間の増加とリミテッド炎症反応における迷走神経刺激メカニズムを研究するためにLPSの管理を減少 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 学ぶ迷走神経刺激法による炎症制御メカニズム。神経免疫学におけるコリン作動性抗炎症経路の解析と細胞応答の理解に役立つ実験手法をマウスモデルで解説します。

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この研究は、スウェーデン研究評議会、スウェーデンリウマチ協会、カロリンスカ研究所財団、ストックホルム郡議会、ワレンバーグ財団、およびGV 80 Years' Foundationの研究によって支援されました。著者はまた、原稿を校正してくれたHannah Aucottに感謝します。

全ての動物実験は、カロリンスカ研究所、ストックホルムで地元の倫理委員会によって承認された動物の管理と使用のためのガイドラインに従って行いました。地元の倫理委員会は、動物のケアに関する欧州連合指令に従っています。 注：元のプロトコルからの主な変更点は、手術後の回復時間（1時間対 6時間）であり、LPSのレベルを（15ミリグラム/ kgの対 2mg / kgの）を注入しました。それ以外の場合は、手術自体に関連するさまざまな設定が変更されていません。 1.刺激のための材料を準備<ol><li>コンピュータ及び刺激電極（ 図1A）に連結されたデータ収集システムをオン。 </li><li>アクノリッジプログラムを入力します。 </li><li> 1×PBS中5mg / mlの濃度のLPSのストック溶液を調製し、アリコートにし、-20℃で保管します。実験の日に、アリコートを解凍し、ADEを準備重量に応じて、動物に約100μLを注入するために、LPSのquateサンプル（0.5 mg / mlと）。 </li></ol> 2.麻酔のための動物の準備<ol><li> C57BL / 6マウスを使用してください。 、12時間の明/暗サイクルで気候制御された条件下でそれらを維持し、それらを標準的なげっ歯類固形飼料を供給し、それらに水を自由に与えます。 </li><li>実験の日に、周りに25グラムの重量を量るマウスに手術を行います。 注：炎症反応が誘導されると、動物での臨床反応の定期検診や観察を行うことが特に重要です。動物の条件は倫理的な基準を満たしていない場合はCO 2吸入による早期の安楽死が必要とされています。 </li><li>麻酔マシンを設定します。 <ol><li>チューブが正しく接続されており、どのような方法で破損していないことを確認します。換気が正常に動作していることを確認してください。イソフルランボトルにキーフィルタを接続し、VAPOを埋めますイソフルランの十分な量とrizer。 </li><li>ガス供給（空気や酸素）を開き、ボトルは、実験のために十分なガスが含まれていることを確認してください。 3ウェイコネクタは、誘導室やマスクにイソフルランの流れを送信することができます。 </li></ol></li><li>誘導室に、三方コネクタを回します。ホームケージから1匹のマウスを選択し、チャンバー内に動物を挿入します。 1.0 L /分の酸素と1.0 L /分の空気を流量調整器を調整します。 5％ - 4にイソフルラン濃度を調整します。 </li><li>麻酔の所望のレベルに達したときに、麻酔の所望のレベルに達したとき、手術領域を剃るマスクにチャンバーから動物を移動させます。マスクの流れに、三方コネクタを回します。 0.25リットル/分の酸素および0.25リットル/分の空気を流量調整器を調整します。 <ol><li> 2.5％ - 1.5イソフルラン濃度を調整します。外科procedurを開始する前に、反射制御および呼吸数によって麻酔のレベルをチェックしてください電子。 </li></ol></li><li>粘着テープを使用した作業台にマウスの足を固定してください。動物の鼻はまだ慎重にマスク内に配置されていることを確認してください。 </li></ol>迷走神経の3手術と刺激<ol><li> 70％エタノールで手術領域を消毒します。 </li><li>メスを使用して、慎重に首（約1〜1.5センチの切開部）のレベルで皮膚を切開。 注意：プロトコルでは、手術の手順は、偽手術動物のためにここで終了。確かに、それだけで金属製の工具で神経に触れることは、すでにある程度までそれを刺激することが示されています。したがって、LPSの少量を使用した場合、より正確な手術コントロール動物を取得するには、この段階で手術を停止します。 </li><li>顕微鏡（12.5Xの目的）の助けを借りて、解剖ピンセットを用いて頸動脈から左迷走神経を分離します。まず皮膚や脂肪の層を除去することにより、胸鎖乳突筋を見つけて、それを撤回神経と動脈の両方の後ろに鉗子を置くため。 注：神経および動脈が互いに密接に付着される次のステップは、非常に厄介です。したがって、血管を切断して、動物を殺すことは非常に簡単です。しかし、神経と動脈の間で非常に慎重にピンセットを置くことによって、彼らは最終的に分離し、神経を単離することが可能です。 </li><li>迷走神経の下電極（ 図1B）を置きます。針電極はかなり長いので、神経が刺激中に、わずかに移動しても、それは常に、電極と接触することになります。 </li><li> （サイトカインレベルに対する読み出しのために、 すなわち、ダウンレギュレーションの効果を測定するために）注射器の助けを借りて、LPSの腹腔内（ip）注射（2mg / kgの）を実行します。 </li><li>刺激を開始する前に、5分待ってください。 </li><li>アクノリッジプログラムのスタートボタンを押して5 V及び1Hzで5分間、迷走神経を刺激します。 </li><li>再電極を移動させ、手術用縫合糸を用いて動物の創傷を縫合。 </li><li>治癒を向上させ、感染から保護するために傷口にはありませんスティングバリアフィルム（NSBF）をスプレーしてください。 </li></ol>動物の4.回復<ol><li>手術後、目覚めと回復のために戻ってそのホームケージに動物を移動します。体温を維持するために、赤外光の下では、完全な意識が回復されるまで、動物を監視するようにしてください。 </li><li>動物は、分析のために犠牲にする前に6時間、そのケージに回復しましょう。 注意：迷走神経刺激の効果は非常に高速であり、また、（48時間まで）持続長いことが示されているので、回復時間は、研究のニーズに応じて、実験者によって設定することができます。 </li></ol>さらなる分析のための5サクリファイス<ol><li> CO 2投与装置にリンクされているケージに動物を置きます。 </li><li> 5上のデバイスを設定します。CO 2吸入の-minサイクル。 </li><li>安楽死が行われると、関心のある器官を収集し、直接、さらなる分析（ 例えば、マウスTH1 / TH2 9プレックスアッセイを用いて脾臓抽出物中のサイトカインレベルの測定）のためにドライアイス上でそれらを凍結3。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

2000年代初頭におけるその発見以来、CAPのメカニズムは、徹底的に研究されてきました。私たちは今、ダウンレギュ炎症性メディエーター2に経路の良い写真を持って、特に、標的臓器、脾臓、非常に効率的なチームとしてNE、メモリーT細胞、のAch、およびマクロファージの仕事。また、最近明らかにCAP 3の活性化後の脾臓におけるACh放出のための必須の成分である、特に、PGE 2、マウスにおける機能的なプロスタグランジンシステムの重要性に関するデータを発表しています。 迷走神経刺激として知られている実験的な技術は、簡単に実験室で行うことができますが、いくつかの重要なプロトコルは、動物や手術の手順について観察する必要があります。私たちは中に電荷を構築しないようにするためには、「電荷平衡」刺激することになっている正弦波刺激信号を、使用します（単相性刺激ではなく）、それを破壊する可能性が神経。神経を刺激しながら、それだけで迷走神経切断実験と、他の目的のために行うことができる遠心性...

先天性免疫は、生物の広い範囲の感染および疾患に対する防御の即時の最初のラインを提供します。それは脅威を排除するための一次免疫応答を開始するだけでなく、それはまた、病原体特異的に二次免疫応答を行い、適応免疫を活性化し、教育において重要な役割を果たしています。炎症は順番に感染部位に他の免疫細胞を誘引する能力を持っていると、このような赤み、腫れ、痛み、機能の喪失、および発熱などの炎症の基本的兆候を誘導するサイトカインおよびケモカインの過多によって画策されました。期間や炎症の強さは、いくつかの要因に依存するが、炎症を解決し、恒常性を回復することは慢性炎症性疾患の発症を回避するための重要なステップです。神経科学および免疫学の分野における最近の進歩はINFLを制御するために巨大な治療的可能性を持つ特定の神経機構を解明してきました中枢神経系における及び末梢の両方でammation。これらのメカニズムのいずれかはまた、自律神経系4、5により駆動される炎症性の反射として知られているコリン作動性抗炎症経路（CAP）、です。 現在、炎症性メディエーターは、感覚神経を活性化し、中枢神経系に炎症の状態に関するシグナルを送ることを考えています。反射反応は、その後、遠心性迷走神経を介して活性化されます。 CAPの解剖学的詳細について鋭意研究がそれぞれ二つの神経、迷走神経および脾臓神経、6からなる副交感神経、交感神経モデルを明らかにしました。 CAPにおいて、活性化されたコリン作動性遠心性迷走神経は、まだ探求される機構によってアドレナリン脾臓神経の活性化をもたらす、セリアック病、腸間膜神経節で終わります。このようにして活性化脾臓神経は、内側にはよく知られています白色パルプ、マージナルゾーン、および脾臓の赤脾髄、CAP 7,8の主及び必須の器官における免疫細胞に近接しvate。脾臓神経終末からのノルエピネフリン（NE）は、脾臓Tリンパ球上に発現される、対応するβ2アドレナリン受容体に結合します。これは、今度は、それによりサイトカイン産生および炎症2を限定マクロファージ上のα7ニコチン性アセチルコリン受容体（α7nACh）を、活性化コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）媒介性アセチルコリン（ACH）放出を誘導します。したがって、神経系は、末梢組織に炎症を調節すると、局所免疫恒常性を復元することが可能であることが明らかです。 経路の名前が示すように、AChのシステムでは、この神経免疫調節経路の機能に中心的な重要性です。興味深いことに、メカニズムは、の活性化に関与しますCAPは、周囲の中枢神経系で異なるように見えます。脾臓中のニコチン性受容体（α7nAChR）の重要性は以前9が実証されてきたが、ムスカリン受容体（のmAChR）は経路10、11の中心活性のために必須です。致死マウス内毒素血症時より最近、中枢作用性M1ムスカリン性アゴニストの末梢投与が有意に抑制血清および脾臓腫瘍壊死因子α（TNFα）、12シグナリング無傷の迷走神経及び脾臓神経を必要なアクション。我々はまた、プロスタグランジンE 2（PGE 2）を欠損したマウスは、迷走神経刺激に応答し、血清および脾臓3におけるサイトカインのLPS誘導性の解放をダウンレギュレートしませんでしたができなかったことが最近示されています。したがって、CAPは、メインアセチルコリンpathw以外のシステムにより調節されるかもしれませんAY。 迷走神経は、理由は体内での放浪もちろん、肝臓、肺、脾臓、腎臓、および腸13を含む主要臓器を支配などの名前が挙がっています。この大規模な神経支配と迷走神経の非常に強力な免疫抑制効果を考慮すると、CAPの治療可能性は、炎症状態の広い範囲をカバーできます。迷走神経は、体に加えない薬剤と、電気的に（または機械的に）活性化され、電圧および周波数の制御と、従来の治療法とは逆であってもよいです。試験は、慢性炎症14を治療する際のVNSの臨床的意義をテストするために、例えば、リウマチ患者では、現在進行中です。要するに、炎症の神経免疫通信および調節は、従来の治療に対する可能な代替治療を提供しており、現在調査中です。そのため、迷走神経の分析stimulation個の異なる神経支配器官における効果が、慢性炎症の動物モデルでの潜在的な治療行為のも特徴づけは、間違いなく洞察を与え、新しい潜在的な治療標的のために望んでいるだろう。 トレイシーと同僚4によって開発されたオリジナルの方法論が原因（LPSの致死量によって）炎症反応の過剰刺激とCAPの活性化と読み出しの間にあまりにも短い時間帯に研究の私たちのフィールドに置き換えることができませんでした。本論文では、我々は、元のプロトコルに対する変更を提示サイトカインレベル上の2つの異なる方法を比較し、標的臓器（脾臓）に新しい反対観察を強調表示します。

<table><tbody><tr><td>コンピュータ</td><td>東芝</td><td>-</td><td>任意のコンピュータは、実際には互換性があります</td></tr><tr><td>MP-150 データ収集システム</td><td>バイオパックシステム</td><td>MP150WSW</td><td></td></tr><tr><td>確認ソフトウェア</td><td>バイオパックシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウス C57BL/6</td><td>チャールズ川</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻酔器</td><td>シムテックエンジニアリング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>医療用酸素ボトル</td><td>AGA</td><td>107563</td><td></td></tr><tr><td>医療用エアボトル&nbsp;</td><td>AGA</td><td>108639</td><td></td></tr><tr><td>ベトフルラン (1,000 mg/g)</td><td>Virbac</td><td>137317</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>Merck Millipore</td><td>1024060080</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>使用濃度10倍希釈</td></tr><tr><td>シリンジ (1 ml)</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>針 23 G</td><td>KD-FINE</td><td></td> 900284 <td>0.6 x 30 mm (青)</td></tr><tr><td>マイクロ解剖鉗子 (湾曲)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td></td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td>外科用縫合糸 4-0</td><td>Ethicon</td><td>G667G</td><td></td></tr><tr><td>安楽死ユニット</td><td>安楽死ユニット 安楽死 Smartbox</td><td>EA-32000</td><td></td></tr><tr><td>カビロン スティングなしバリアフィルム</td><td>3M Health Care</td><td>3346N</td><td></td></tr><tr><td>TH1/TH2 9-Plex アッセイ、超高感度キット</td><td>MesoScale Discovery</td><td>K15013C-1</td><td></td></tr><tr><td>刺激電極デバイス</td><td>Biopac Systems</td><td>STIMSOC</td><td></td></tr><tr><td>Aesculap Isis シェーバー</td><td>Agnthos</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>R70</td><td></td><td></td><td>げっ歯類の食事 スウェーデン、ストックホルム、ラントマンネンから</td></tr></tbody></table>

回復時間の増加とリミテッド炎症反応における迷走神経刺激メカニズムを研究するためにlpsの管理を減少

Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

炎症は、活性化されたマクロファージ、単球、およびサイトカインや他の炎症メディエーターを放出する他の免疫細胞によって媒介される感染および組織損傷に対する局所的な反応です。長い間、体液性および細胞性のメカニズムは、免疫応答の制御におけるそれらの役割について研究されてきましたが、免疫学および神経科学の分野における最近の進歩は、興味深い治療の可能性を秘めた特定の神経メカニズムも解明してきました。いわゆるコリン作動性抗炎症経路(CAP)は、自然免疫応答と炎症を非常に強力に制御することが説明されています。2000年代初頭、トレーシーと共同研究者は、迷走神経を刺激し、経路の効果を模倣する技術を開発しました。この方法論は、心拍変動の調節緩和などの過剰刺激の副作用を回避するために、低電圧および低周波数での迷走神経の電気刺激に基づいています。刺激用の電気デバイスが利用可能になったため、実験室で方法論を簡単にセットアップできるようになりました。この研究の目的は、CAPにおけるプロスタグランジンの潜在的な関与を調査することでした。残念ながら、以前の試みに基づいて、誘発された炎症反応が高すぎるか、酵素代謝特性に適していなかったため、元のプロトコルを使用できませんでした。元の手術プロトコルのさまざまな設定はほとんど変更されていませんでしたが、炎症誘発に関する条件と犠牲までの時点は、私たちの目的に合うように改善されました (つまり、より限定的な炎症反応への CAP の関与を調査するため)。
ここで提示されている元のプロトコルの修正版には、迷走神経の刺激と分析の間のより長い時間範囲が含まれており、これは炎症反応のより低い誘導に関連しています。さらに、注入するリポ多糖(LPS)のレベルを下げる一方で、脾臓の機構特性に関する新しい観察結果にも出くわしました。

手術後の経過時間を増加し、LPSの投与量を減少した後、TNFαおよびインターロイキン-1β（IL-1β）のレベル先に示したように、元のプロトコルを使用して、VNSは、TNFαのレベルおよびIL-1β（360.0±40.21 PG / MGに（39.7±10.8 PG / VNSのMg、P &lt;0.001対SHAMで169.3±24.9 PG / mg）を減少しました腹腔内LPS注射（15ミリグラム/ kg）を（ 図2A）後の脾臓におけるVNSにおける191.7±27.2 PG / mgで、P &lt;0.01）に対するSHAM。 6時間に1から、分析のために時間を変えて15 2 / kgでのLPSの投与量を減少した後、我々は、TNFαに対するVNSの効果を観察した（13.67±1.81で8.82±1.20 PG / mgの対SHAMに/ mgのPG VNS、P &lt;0.05）、IL-1βは影響されなかった（368.6...

迷走神経刺激は、末梢の炎症を減少させる強力な効果があることが証明されています。ここでは、限られた炎症反応におけるコリン作動性抗炎症メカニズムのさらなる調査を可能にする修正された迷走神経刺激プロトコルを紹介します。

回復時間の増加とリミテッド炎症反応における迷走神経刺激メカニズムを研究するためにLPSの管理を減少

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release ...

この外科的介入の全体的な目標は、炎症状態における迷走神経刺激の影響を観察することです。いわゆるコリン作動性抗炎症経路に関与するさまざまなメカニズムと細胞を解析し、理解すること。この方法は、ファインスタイン研究所のケビン・トレーシー研究室で開発されました。この方法は、神経免疫学分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。最近の進歩により、神経系と免疫系の間に密接な関係が確立されています。この手法の主な利点は、実験室で簡単にセットアップできることです。しかし、動物の世話と手術のプロトコルに関しては、重要なルールに従う必要があります。迷走神経が全身をさまよう過程をたまよい、さまざまな動物モデルで情報をダウンレギュレートする能力は、その刺激が多くの炎症性疾患の治療に役立つ可能性があることを示唆しています。通常、この技術に不慣れな個人は、顕微鏡観察下で迷走神経を頸動脈から特定して分離するのに苦労します。しかし、最初は難しいですが、時間と練習を重ねれば楽になります。まず、コンピュータの電源を入れ、刺激電極にリンクされたデータ収集システムの電源を入れます。データ集録および解析ソフトウェアを起動します。次に、5ミリグラム/ミリリットルのリポ多糖またはLPSのアリコートに従い、生理食塩水でゼロポイント5ミリグラム/ミリリットルに希釈します。誘導室で25グラムのマウスに麻酔をかけます。希望の麻酔レベルに達したら、動物をチャンバーからマスクに移動します。三方コネクタを回してマスクを送り、フローレギュレーターを調整します。外科的処置を開始する前に、立ち直り反射の喪失と毎分約100回の呼吸数の定期的な呼吸数による麻酔の手術面を確認してください。マウスに適切な麻酔がかけられたら、マウスの脚を粘着テープで作業台に固定します。動物の鼻がまだマスクに注意深く配置されていることを確認してください。承認された手順に従って、手術部位を適切に消毒します。次に、首の高さの皮膚に1〜1ポイント5センチメートルの切開を行った後、12ポイント5x対物レンズを備えた実体顕微鏡を配置して手術領域を観察します。鉗子で皮膚と脂肪の層を取り除くことにより、胸鎖乳突筋を見つけます。胸鎖乳突筋を引っ込め、鉗子を左迷走神経と頸動脈の両方の後ろに動かします。神経と動脈の間に鉗子を非常に注意深く配置することにより、神経を動脈から分離します。これは、神経と動脈が互いに近いため、血管を切断して動物を殺すのが非常に簡単なため、手順の重要なステップです。しかし、神経と動脈の間に鉗子を非常に慎重に配置することにより、最終的には分離し、迷走神経を分離することが可能です。次に、電極を迷走神経の下に置きます。針電極はかなり長いため、神経は少し動いても常に電極に接触しています。次に、LPSの腹腔内注射を行い、5分待ってから刺激を開始します。5分後、取得ソフトウェアの開始ボタンを押して、5ボルトと1ヘルツで迷走神経を5分間刺激します。刺激期間が終了したら、電極を取り外し、動物の傷口を外科用縫合糸で縫い合わせます。治癒を改善し、感染症から保護するために、傷口に刺さないバリアフィルムをスプレーします。最後に、動物を清潔なケージに移し、完全な意識を取り戻すまで監視します。次の図は、迷走神経刺激後の TNF アルファおよび IL 1 ベータのレベルに対する LPS 濃度の低下と犠牲への潜伏期間の増加の影響を示しています。ここでは、元のパラダイムが、偽の操作コントロールと比較して、TNFアルファとILの1ベータの両方を有意に減少させることがわかります。このビデオで示されているプロトコルは、TNFアルファのレベルを大幅に低下させますが、IL1ベータのレベルは低下させません。ここに見られるように、LPS注射なしで6時間の回復は、TNFアルファまたはIL1ベータのレベルに影響を与えません。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約20分で完了します。その開発後、この技術は神経免疫学の分野の研究者に道を開きました。中枢神経系と免疫系との関係を研究すること。また、新しい臓器の迷走神経神経支配と、慢性炎症性疾患におけるコリン作動性抗炎症経路の影響についても研究します。このビデオを見た後、迷走神経を見つけ、分離し、刺激する方法をよく理解しているはずです。また、誘発された炎症のレベルと動物の回復時間が考慮すべき重要な問題である可能性があることにも留意してください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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