勉強するリニアアガロースチャネルを使用しますショウジョウバエ幼虫クロールの動作

この手順の全体的な目標は、線形アガロースチャネルを這う幼虫期のショウジョウバエを観察して、神経回路の発達を研究することです。この方法は、運動パターンを生成する神経コードの理解や、運動制御のためのニューロン回路の範囲を特定する主要な遺伝的および細胞的プロセスの特定など、神経行動学および発生生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、研究者が単一のマルチパターンを詳細に研究できるように、幼虫の行動レパートリーを制限することです。

手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるZarion Marshallです。まず、幼虫の健康状態を評価することが重要です。録音の3〜4日前に、大人用ケージの収集プレートを交換してください。

これを毎日、そして一日の同じ時間に進めてください。皿の上の卵と新しく孵化した幼虫を数えます。予想される卵の数は500から2, 000の間です。

必要に応じてケージ内の大人の数を調整します。24時間後にプレートを検査し、幼虫が健康かどうかを判断します。ほとんどの卵は幼虫に孵化し、幼虫は酵母ペーストに這い入ったはずです。

健康状態不良の兆候には、孵化していない卵が多数ある、酵母ペーストから離れた死んだ幼虫の体、免疫反応の指標である腹部に異常に暗い斑点がある幼虫などがあります。幼虫が健康でないように見える場合は、新しく準備したプレートを使用してケージを変更し、成虫の遺伝子型を確認してください。実験のために、1〜2日齢のプレートから新しく孵化した2番目の幼虫を収集します。

これらのステージはすべて解析に使用できます。このプロトコルでは、リニアチャネルPDMS鋳造金型を用意します。鋳造金型をイソプロピルアルコールで洗浄します。

乾いたら、型を10センチの蓋などに入れます。次に、55°Cに冷却した3%のアガロースを型に充填します。型に気泡が閉じ込められないように、アガロースを慎重に注ぎます。

型はアガロースで覆うだけです。固まったら、アガロースチャネルを金型から取り外します。円盤状のチャネルの端をトリミングし、チャネルを水に浸します。

摂氏4度の水で最大7日間保存できます。チャネルを使用する前に、チャネルを室温まで温めてください。幼虫の幅に一致するチャネルを選択します。

チャネルの幅は100〜300ミクロンで、深さはすべて150ミクロンです。次に、清潔なカミソリの刃を使用して、準備したディスクから1つのチャネルを切り取ります。鉗子を使用して、溝のある面を上にして、チャネルを適切なサイズのガラスカバースリップまたはスライドに移します。

次に、細い鉗子を使用して、幼虫を絞らずに優しく拾います。先端が細かく描かれた絵筆もうまく機能します。絞ると、転がったり猫背になったりするなどの痛み反射が、チャネル内での幼虫の行動を支配する可能性があります。

次に、幼虫を水に短時間浸して洗い、次にカットチャネルに入れて、所定の位置にそっとからかいます。チャネルに入ったら、幼虫の向きを調整して、目的の構造を画像化しやすくします。次に、チャネルの両端に1滴または2滴の水を配置して、チャネルを水で満たします。

気泡が溜まった場合は、チャネルの側面をそっと持ち上げて取り除きます。幼虫の向きをさらに調整するには、チャネルをそっと動かして幼虫を転がします。これで、幼虫を画像化する準備が整いました。

線形チャネルの幼虫は、リズミカルな這い回る持続的な発作を行います。蛍光プローブの検査が簡単に行えます。例えば、GAL4ドライバーからニューロンにGFPを発現する幼虫は、クロールサイクル中に神経索から発せられる蛍光強度にダイナミックな変化を示します。

中枢神経系は、筋肉の収縮の波が体軸に沿って通過すると、幼虫の頭と尾とほぼ同時に前進し、中枢神経系は焦点面を出入りし、神経索の蛍光を変化させます。蛍光の変化は、3匹の幼虫の3回のクロールストライドから定量化されました。ストライドサイクルにおける神経索蛍光のダイナミクスは、表現型解析に使用できる再現可能なパターンに従っていました。

このビデオを見れば、幼虫の収集方法、行動のための採取方法、アガロースチャネルの準備方法、幼虫をチャネルにロードして直線的なクロール行動を視覚化する方法を理解できるはずです。この手順を試みるときは、幼虫を優しく扱うことを忘れないでください。