Name: マイクロ電極アレイ上のネットワーク・アクティビティを測定するための人工多能性幹細胞の急速な神経分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶ hiPSCから興奮性大脳皮質ニューロンへの急速分化法。マイクロ電極アレイを用いた電気生理学的ネットワーク活動測定が可能で、神経疾患のメカニズム解明に応用できます。

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著者は、全細胞パッチクランプ実験を行ったジェシカ・クラッセンに感謝します。私たちの実験で使用したiPSCは、ナイメーヘンのラドバウド大学のHuiqing Zhou氏とWillem van den Akker氏から提供されました。このプロトコールで使用した転写ベクターは、ボン大学医療センターのOliver Brüstle氏、Philipp Koch氏、Julia Ladewig氏のご厚意により提供されました。

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<li>Benevento, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+by+the+Kleefstra+syndrome+protein+EHMT1+mediates+homeostatic+synaptic+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Histone methylation by the Kleefstra syndrome protein EHMT1 mediates homeostatic synaptic scaling.</a> Neuron. 91 (2), 341-355 (2016).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、Zhang らによって発表され、効率的なhiPSC-分化プロトコルを実装しています。 MEAの上hiPSC由来の神経回路網のネットワーク活動を測定する（2013）12。我々は、神経分化を誘導する前のrtTA / Ngn2陽性hiPSCラインを作成することによって、元のプロトコルを適応しました。この追加のステップは、私たちは、MEA上の神経細胞密度を制御することができます。神経細胞の密度の制御は、MEAのにプロトコルを適応させるための性と一貫性を確保するための重要な前提条件でした。 MEAを用いた神経回路網の活性を測定するために、神経細胞は、MEAの電極17,18の上に直接密なネットワークを形成する必要があります。これは必ずしも神経細胞のプレーティング密度を厳密に制御する必要があります。この戦術は、分化前にhiPSCsの急性レンチウイルス形質導入に依存しないためのrtTA / Ngn2陽性hiPSCラインは、ニューロン密度を制御することができます。rtTA / Ngn2陽性hiPSCラインは、したがって、ほぼ例えば、レンチウイルスの毒性および可変感染効率に起因最終収率の変動を排除します。 実験手順のもう一つの重要なステップは、差別hiPSCsと共培養されたラットアストロサイトの数です。アストロサイトは、積極的に神経機能するために重要なプロセスであるその全てが、シナプス形成、保守、および除去を制御することにより、神経回路の開発の洗練に貢献しています。本論文で提示プロトコルは非常にアストロサイトに依存している：完全に成熟と機能のシナプスを形成するために、ニューロンはアストロサイトからのサポートを必要とします。我々は、アストロサイトの数は、ニューロンの成熟と自発的な活性を示す神経回路網の形成をサポートするために、hiPSC由来のニューロンの数にほぼ等しくなければならないことを経験しました。私たちのアストロサイトのプロトコル利回り初代細胞CULので、限られた寿命を持つトゥーレスは、ラットアストロサイトの単離は、定期的に実行する必要があります。 Zhang らによって発表されたプロトコルの私達の適応。 （2013）12は、MEA技術で使用するための可能性が大幅にhiPSC派生ネットワークのネットワーク活動を研究する当社の能力を向上させます。以前は、時間のかかる分化手順13-16に頼ったMEAとhiPSC由来の神経回路網の研究のために使用されるプロトコル。 Zhang らからプロトコル。 （2013）は、迅速な代替手段を提供し、私たちの修正は、それが今より実現可能な特に高スループットまたは薬理学的研究では、MEAの技術と組み合わせてhiPSC由来の神経細胞を使用することが可能になる変動性の源を除去します。また、この方法は、Zhang らにより発表されているため。 （2013）12は、私たちの適応プロトコルはネットワークAへの可能なフォーカスされた研究を行い、上位層皮質ニューロンの均一な集団を生成しますこの特定の神経細胞のサブセットのctivity。 それにもかかわらず、このアプローチはまた、いくつかの制限を有します。培養物は、ニューロンの異なるクラス（ すなわち、抑制性および興奮性ニューロン）の異種ネットワークを構成する生体内ネットワークに似ている可能性が低いため、最初に、培養物の均質性はまた、不利と考えることができます。さらにMEA技術とhiPSC由来の神経細胞の使用を強化するために、他の神経細胞集団のための迅速な（導入遺伝子ベース）の分化プロトコルを開発することが重要であろう。プロトコルが利用可能になった場合は、in vitroでのネットワークは、より密接にin vivoでのネットワークを模倣します。第二に、現在ではラットアストロサイトは、成長をサポートするためのhiPSC由来の神経細胞に添加しなければならないので、結果として神経回路網は、人間の神経回路網狭義ではありません。アストロサイトにhiPSCsを区別するための信頼性の高いプロトコルは、将来のゾル5月この問題は26 VEの 。ここで説明するように、第3の、二次元の神経回路網は、複雑な三次元インビボで神経回路網を研究するための限られたモデルです。幸いなことに、MEAの技術と組み合わせて、ラット初代神経細胞の三次元培養を記述するプロトコルは、27,28はすでに利用可能です。将来を見越して、3次元培養技術とMEA技術でhiPSC由来の神経細胞とアストロサイトを得るための迅速な分化プロトコルの組み合わせは、神経疾患の根底にある生物学的メカニズムに新たな洞察を提供する必要があります。

in vitroでのヒト神経細胞を生成するために、人間の人工多能性幹細胞（hiPSCs）の開発分化プロトコルは、神経疾患を研究するための強力な新しいツールを提供しています。最近まで、これらの疾患の研究は厳しく、人間の神経細胞を用いたモデルシステムの欠如によって妨げられました。げっ歯類の神経疾患を研究するために使用することができるが、そのような試験の結果は、ヒト1に容易に変換することができません。これらの制限を考えると、hiPSC由来のニューロンは、神経学的障害の根底にある分子メカニズムを解明し、インビトロ薬剤スクリーニングのためにするために使用することができる有望な代替モデルです。 過去十年間では、ニューロンへhiPSCsを変換するには、いくつかのプロトコルが2-8を開発されてきました。しかし、これらのプロトコルは、依然として多くの方法で制限されています。まず、プロトコルは、多くの場合、時間がかかる：（ すなわち synap十分な成熟と神経細胞を生成しますSE形成）および機能的活性は、9困難な大規模な研究をレンダリングする培養手順、数ヶ月を必要とします。また、hiPSC対のニューロンの変換効率が低いです。プロトコルは、多くの場合、神経細胞の異種集団を得、従って、神経細胞の特定のサブセットの研究を許可していません。また、プロトコルが異なるIPSCライン10,11のために異なる結果をもたらす、再現性がありません。最後に、成熟段階と、得られた神経細胞の機能的特性はまた、10の変数です。 これらの問題に対処するために、Zhang ら。 （2013）12を迅速かつ再現ニューロゲニン-2転写因子を過剰発現させることによってhiPSCsからのヒトの神経細胞を生成するプロトコルを開発しました。ニューロンの特性は、複数の独立している（ - （3週間ニューロゲニン-2の発現を誘導した後にのみ2）、プロトコルが再現可能である著者によって報告され、分化が比較的迅速に発生しますhiPSCライン）をtarting、およびhiPSCツーニューロンの変換は（ほぼ100％）は非常に効率的です。そのプロトコルで生成された神経細胞の集団は、神経疾患への細胞型特異的な貢献の調査を可能にすること、（上位層皮質ニューロンに似ている）均質です。さらに、彼らのhiPSC由来のニューロンは、わずか20日後に成熟した性質（シナプスと堅牢な機能活性を形成するために、 例えば 、能力）を示しました。 hiPSC技術は、ヒト疾患の研究のために利用することができる前に、ネットワークレベルでhiPSC由来の神経細胞の電気生理学的特性を特徴づけることは、重要な前提条件です。この理由のため、多くの研究グループは、最近、マイクロ電極アレイ（MEA）装置（マルチチャンネルシステムズ、ロイトリンゲン、ドイツ）13-16を用いて、ネットワークレベルで幹細胞由来のニューロンを研究し始めました。 MEAの電極は、神経細胞を培養することが可能な基板内に埋め込まれています。MEAは、神経回路網の電気生理学的特性およびその活性のインビトロでの発達を調査するために使用することができます。現在、のMEAは、成熟したネットワークを生成するために数ヶ月を要する分化プロトコルと組み合わせて使用​​されます。したがって、迅速な分化プロトコルでのMEAを組み合わせて、神経障害の大規模な研究で、この技術の使用を容易にすべきです。 ここでは、Zhang らの変更を提示します。 （2013年）12プロトコルとのMEA上で使用するためにそれを適応させます。具体的には、むしろ急性レンチウイルス形質導入に頼るよりも、我々は代わりに安定的に分化を誘導する前のrtTA / Ngn2を表現hiPSCラインを作成しました。我々は、神経細胞の密度は、神経ネットワーク形成のための、および神経細胞およびMEA 17,18の電極間の良好な接触のために重要であるため、主に、神経細胞密度にわたって再現可能な制御を持つようにこれをしました。 Althoug時間Zhang ら。プロトコルは、形質導入hiPSCsの変換に関して非常に効率的である、それは最初は12（Zhang らに図2Eを参照してください）メッキhiPSCsの数からニューロンの最終収率に関して本質的に可変です。安定したラインで、我々はこのようなレンチウイルスの毒性と感染効率などの変動を引き起こす多くの問題を、排除します。私たちは、その後、第3週することで、ネットワークの成熟（ 例えば 、チャネルの大部分を含む同期イベント）を得、確実にMEAの上hiPSC由来の神経回路網を生成するパラメータを最適化しました。この迅速かつ信頼性の高いプロトコルが異なる（ すなわち、患者特異的）hiPSCラインだけでなく、薬理学的研究のための強固な一貫性を提供由来ニューロン間の直接比較を有効にする必要があります。

<table><tbody><tr><td>レボビッツのL-15ミディアム</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>B-27 supplement</td><td>Gibco</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+-free HBSS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>2.5% トリプシン</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>高グルコース DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS (ウシ胎児血清)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro;m cell strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 レンチウイルス包装ベクター</td><td>Addgene</td><td>プラスミド #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G レンチウイルス包装ベクター</td><td>Addgene</td><td>プラスミド #12259</td><td></td></tr><tr><td>基底膜マトリックス</td><td>Gibco</td><td>A1413201</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>細胞剥離液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>E8 培地</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>ROCK阻害剤</td><td>Gibco</td><td>A2644501&nbsp;</td><td>あるいは、チアゾビビンのようなROCK阻害剤を使用することもできます。</td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8168-10ML</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>ビトロネクチン</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル MEAs</td><td>マルチチャネル システム</td><td>60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr</td><td></td></tr><tr><td>ガラス カバースリップ</td><td>VWR</td><td>631-0899</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-オルニチン (PLO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655-10MG</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-5G</td><td></td></tr><tr><td>N-2 サプリメント</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>NT-3、ヒト組換え</td><td>プロモカイン</td><td>C66425</td><td></td></tr><tr><td>BDNF、ヒト組換えプロ</td><td>モカイン</td><td>C66212</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>ギブコ</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>L-アラニル-L-グルタミン</td><td>ギブコ</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>神経基礎中</td><td>ギブコ</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>シトシン &β;-D-アラビノフラノシド&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768-100MG</td><td></td></tr> ストレート先端細<tr><td>鉗子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251</td><td></td></tr><tr><td>先端細口スプリングハサミ&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロ電極アレイ上のネットワーク・アクティビティを測定するための人工多能性幹細胞の急速な神経分化

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

人間の人工多能性幹細胞（hiPSCs）由来のニューロンは、神経疾患を研究するための有望な新しいツールを提供しています。過去十年間では、ニューロンへhiPSCsを区別するための多くのプロトコルが開発されています。しかし、これらのプロトコルは、多くの場合、高い変動、低再現性、および低効率と遅いです。また、これらのプロトコルを用いて得られたニューロンは、多くの場合、未成熟であり、ニューロンは、数ヶ月のために培養される場合を除き、単一細胞とネットワークの両レベルで十分な機能活性を欠いています。部分的に起因するこれらの制限のために、hiPSC由来の神経回路網の機能特性は、まだ十分に特徴付けられていません。ここでは、転写因子ニューロゲニン-2 12の強制発現によってhiPSCsからのヒトの神経細胞の産生を記載し、最近公開されたプロトコルに適合させます。このプロトコルは、transducのほぼ100％の変換効率で、迅速な（3週間以内に成熟ニューロンを生じる）と効率的ですED細胞（&gt; DAPI陽性細胞の95％であるMAP2陽性）。さらに、プロトコルは、神経疾患への細胞型特異的な貢献の調査を可能にする興奮性ニューロンの均一な集団を生成します。私たちは私たちに、ニューロンの総数を明示的に制御を与え、安定的に形質導入されたhiPSC細胞を生成することにより、元のプロトコルを変更しました。次いで、これらの細胞を微小電極アレイ上hiPSC由来神経回路網を生成するために使用されます。細胞密度の観点から実験間の一貫性を保持しつつ、このようにして、hiPSC由来の神経回路網の自発電気活動を測定し、特徴付けることができます。提示されたプロトコルは、特にヒト神経ネットワーク上の機序および薬理学的研究のために、広く適用可能です。

ここでは、正常にhiPSCsは、転写因子ニューロゲニン-2 12を過剰発現させることにより、皮質神経細胞に直接区別されているプロトコルを変更していると我々はのMEAの使用のためにそれを適応しています。このアプローチは、高速、私たちは分化誘導後第3週の間に、既に機能的ニューロンおよびネットワーク活動を得ることができるように効率的です。 分化プロトコルの過程で、細胞は形態学的に神経細胞に似始め：小プロセスが形成されたニューロンは、互いに（ 図1A）への接続を開始しました。我々は、開発中に、そのニューロンの形態とシナプスの特性を測定することにより、健全な制御hiPSCライン由来のニューロンの神経生理学的プロファイルを確立しました。 hiPSC由来のニューロンは開始後異なる日にMAP2とシナプシン1月2日のために染色しました分化（ 図2A）の。派生ニューロンは3週間分化誘導後、すでに成熟した神経細胞の形態を示します。シナプシン1月2日の涙点（シナプスの数の尺度）の数は、シナプシン1月2日免疫細胞化学染色に基づいて定量しました。シナプシン-1/2涙点の数は、神経接続のレベルも（ 図2B）が増加していることを示唆し、経時的に増加しました。 23日間分化誘導後のシナプシン1月2日の涙点の数は、2つの独立したIPSライン（ 図2C）で同様でした。 23最もDIVシナプシン/ 2涙点で機能的シナプス（ 図2D）の指標であるPSD-95涙点に並置されました。 Zhang らによって記載された結果と一致し、我々はパン神経細胞およびサブタイプ特異的皮質メートルによって確認され、興奮上層皮質ニューロンの集団を生成このようなBRN2とSATB2（層II / III）としてarkers。私たちは、深い層ニューロンCTIP2（V層）またはFOXP2（層VI）（ 図2EおよびF）について陽性であった神経細胞を観察しませんでした hiPSC由来のニューロンの電気生理学的活性を特徴付けるために、我々は、開発中に測定されたこれらのニューロンへの全細胞電流及び電圧クランプ記録、 すなわち固有の特性および興奮性入力を使用します。神経細胞は、分化の後に1週間すでに活動電位を生成することができたとスパイク細胞の割合は、時間（ 図2GおよびH）の上に増加しました。さらに、ニューロンは週分化誘導後にすでに興奮性シナプス入力を受けた：興奮性シナプス入力の周波数と振幅の両方を開発（ 図2I - K）の間に増加しました。 ntの"FO：=キープtogether.within-ページ" 1 "&gt;優れた単一細胞の活性は、ネットワークレベルの機能を形成するために組み合わせる方法を理解するには、ニューロンがコンサートでどのように機能するかを検討することが不可欠であるin vitroでの神経回路網は、MEAの上で培養。ニューロンのダイナミクスを研究するための貴重な実験モデルを構成している。我々は、6ウェルのMEA（ 図2M）で培養し、健康な制御hiPSCライン由来神経細胞の電気生理学的ネットワーク活動の20分を記録した。数週間を分化誘導した後、ニューロン開発のこの段階（分化の開始後すなわち 16 d）のすべてのチャンネルが関与なし同期イベントで。;自発的なイベント（ 図2N 0.62±0.05スパイク/秒）を示す、機能的に活性な神経回路網を形成し、健康なコントロールhiPSCs由来多国間環境協定の（ 図2O）が検出されたネットワーク活動のレベルは開発中に増加：4週目の間にトン後彼は、分化の誘導、神経回路網は、自発的な高レベルの活性を示した（2.5±0.1スパイク/秒; 図2N）デバイスの全てのウェルインチネットワークはまた、長い期間（2100±500ミリ秒）と同期網バースト（4.1±0.1バースト/分、 図2O）を示しました 。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig1.jpg"> 図1： 神経細胞への分化hiPSC。カバースリップ上のニューロンへのhiPSCsの分化A. 3つの時点。多国間環境協定上のhiPSCsのB.めっき。 T75フラスコ中の100％の集密度でC.星状細胞（細胞がモザイク状の単層を形成することに注意してください）。スケールバー：150μmで。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 1 "&gt;：" =キープtogether.within-ページFO」e_content <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig2.jpg"> 図2.ニューロン特性評価をhiPSCが由来します。 A. hiPSC由来の神経細胞は、分化の開始後異なる日にMAP2（緑）、シナプシン1月2日（赤）について染色しました。スケールバー：10μmです。 2つの独立した実験におけるシナプシンの涙点のB.定量。各実験では、少なくとも10個の細胞を分析しました。二つの独立したIPS株由来の神経細胞におけるDIV23でシナプシン涙点のC.定量。 D. hiPSC由来のニューロンは、23日間分化の開始後PSD-95（緑）、シナプシン1月2日（赤）について染色しました。涙点シナプシンPSD-95の斑点に並置されています。 E. hiPSC由来のニューロンはMAP2（緑）、BRN2（赤）またはSATB2（赤）、分化の開始後23日間染色しました。そのMAP2陽性細胞のF.割合示されたマーカーについて陽性でした。その活動電位を示すG.代表電流クランプ記録は、分化の開始後、早ければ7 dとを生成することができます。一つ以上の活動電位を示す分化誘導後の異なる日での細胞のH.割合 。 I.分化後の異なる日でhiPSC由来のニューロンが受信した興奮性シナプス後電流（EPSCs）の代表的な痕跡。開発中に興奮性シナプス後電流のJ.頻度 。開発中に興奮性シナプス後電流のK.振幅。 L.代表的には、（制御）することなく、およびCNQX（CNQX）とEPSCの録音をトレースします。 1 hiPSCライン由来M.ニューロンは、6ウェルMEA上で培養したとネットワーク活動をhiPSC由来の神経回路網16と分化誘導後の23日間に示されています。から記録された活動各ウェル（10 kHzでのサンプリングレート）は、異なる色（記録の20分の5分が示されている）で示されています。 N.発射速度16と分化誘導後23 D。 O.破裂率16および分化誘導後23 D。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 結果を考えると、得られたhiPSC由来のニューロンの質は、細胞の神経生理学的プロフィールを作成することによって評価することができます。すなわち、3〜4週間の分化の開始後、ニューロンの形態、シナプシン-1/2の発現および電気生理学を評価することが可能です。その時点で、hiPSC由来のニューロンは、免疫細胞化学を行う際に、MAP2であることが、シナプシン/ PSD-95陽性の神経細胞様の形態を示すことが期待され、およびexhibiにトン自発的な電気生理学的活性（両方の単一セルおよびネットワークレベルで）。

私たちは、興奮性皮質ニューロン12に人間の人工多能性幹細胞（hiPSCs）の、迅速な再現性、および効率的な分化を説明以前に公開されたプロトコルを変更して実施します。具体的には、私たちの修飾は、神経細胞の密度の制御を可能にし、ネットワークレベルでの電気生理学的特性を測定するために微小電極アレイ上で使用します。

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

このニューロン分化プロトコルの全体的な目標は、微小電極アレイ上で増殖するヒト誘発多能性幹細胞からニューロンネットワークを迅速かつ制御された方法で生成することです。この方法は、神経科学分野の重要な問題に対処するために使用できます。これは、神経障害の根底にある生物学的メカニズムを研究するために使用できますが、より基本的な神経生物学的な問題に対処するためにも使用できます。この技術の主な利点は、誘導された多能性幹細胞が制御された方法でニューロンに迅速に分化することです。1日目に、DMEM/F12、CDS、およびE8培地を1%ペニシリンストレプトマイシンで室温まで温めます。次に、E8培地にドキシサイクリンを添加して最終濃度を1ミリリットルあたり4マイクログラムにし、次に混合物に岩石阻害剤を添加します。RTTANGN2陽性の iPSC の使用済み培地を吸引し、1 ミリリットルの CDS を細胞に加えます。その後、加湿した摂氏37度のインキュベーターで細胞を3〜5分間インキュベートします。顕微鏡で、細胞が互いに分離しているかどうかを確認します。次に、ウェルに2ミリリットルのDMEM / F12を追加します。1, 000マイクロリットルのピペットで細胞を穏やかに懸濁し、次いで15ミリリットルのチューブに移します。その後、7ミリリットルのDMEM/F12を細胞懸濁液に加え、細胞を200 x gで5分間回転させます。5分後、上清を吸引し、準備したE8培地を2ミリリットル加えます。1, 000マイクロリットルのピペットの先端を15ミリリットルのチューブの側面に当て、細胞を穏やかに再懸濁することにより、hiPSCを解離します。顕微鏡下で、細胞が解離しているかどうかを確認します。次に、血球計算盤を使用してミリリットルあたりの細胞数を決定します。6ウェルMEAについては、細胞を希釈して、10の7.5倍から5番目の細胞/ミリリットルの細胞懸濁液を得る。カバースリップについては、細胞を希釈して、1ミリリットルあたり10〜4番目の細胞の4倍の細胞懸濁液を得る。カバースリップと6つのウェルMEAから希釈したラミニンを吸引します。6つのウェルMEAの場合、各ウェルの活性電極領域に100マイクロリットルの細胞懸濁液を添加して細胞をプレート化します。次に、24ウェルプレートの各ウェルに500マイクロリットルの細胞懸濁液を添加して、細胞をプレートします。次に、6ウェルMEAまたは24ウェルプレートを加湿した摂氏37度のインキュベーターに入れます。2時間後、準備したE8培地500マイクロリットルを6つのウェルMEAの各ウェルに慎重に追加します。その後、6つのウェルMEAを加湿した摂氏37度のインキュベーターに一晩置きます。3日目に、0.05%トリプシン-EDTAを室温まで温めます。DPBSおよびDMEM/F12を1%ペニシリンストレプトマイシンで摂氏37度まで温めます。.次に、ラットアストロサイト培養の使用済み培地を吸引します。5ミリリットルのDPBSを加えて培養物を洗い、優しく振り回します。その後、DPBSを吸引し、0.05%トリプシン-EDTAを5ミリリットル追加します。トリプシン-EDTAを優しく振ります。次に、加湿した摂氏37度のインキュベーターで細胞を5〜10分間インキュベートします。その後、顕微鏡で細胞が剥離しているかどうかを調べます。フラスコを数回叩いて、最後のセルを切り離します。次に、フラスコに5ミリリットルのDMEM / F12を追加します。10ミリリットルのピペットでフラスコ内の細胞を優しく評価してみてください。その後、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに集めます。チューブを200 x gで8分間回転させます。その後、スーパーナテントを吸引し、細胞を1ミリリットルのDMEM/F12に再懸濁します。血球計算盤を使用してミリリットルあたりの細胞数を決定します。次に、4番目のアストロサイトに10の7.5倍を6つのウェルMEAの各ウェルに加えます。そして、24ウェルプレートの各ウェルに4番目のアストロサイトに10を2回加えます。加湿した摂氏37度のインキュベーターで細胞を一晩インキュベートします。1、200倍の増幅でデータを取得し、MCSデータ収集カードを使用して10キロヘルツで信号をサンプリングします。MEAで培養したhiPSC由来ニューロンの電気生理学的活性を20分間記録します。記録中は、温度を摂氏37度に維持し、加湿ガスをMEAに一定にゆっくりと流すことで、媒体の蒸発とpHの変化を防ぎます。その後、カスタムソフトウェアパケットを使用してデータを分析します。この図は、分化過程における神経細胞マーカーMAP2のシナプシンにおける発現変化を示しており、神経細胞の成熟を示しています。このグラフは、分化過程で増加した個々の細胞についてシナプシン発現が測定されていることを示しています。分化の3週間後に細胞内で発現するシナプシンは、PSD-95と共局在し、機能的なシナプスの存在を示しています。ここでは、細胞の電気生理学的活性を測定するために、分化プロセスの異なる時点で全細胞パッチクランプを実行しました。細胞は、異なる時点で活動電位を生成することができました。また、時間の経過とともにスパイクする細胞の割合が増加したことは、分化の初期段階でも、細胞の大部分が活動電位を生成することができることを示しています。パッチクランプは、細胞が受ける興奮性シナプス後電流を測定するためにも使用されました。細胞が受け取る入力の数は、分化プロセス中に増加しました。興奮性シナプス後電流の周波数と振幅の両方が、分化プロセス中に増加しました。微小電極アレイ上で分化した細胞の電気生理活性を、分化プロセス中に測定しました。ここでは、分化過程で神経回路網の活動が増加し、23日後には同期的なイベントが見られました。この手法を習得すると、3〜4週間以内に人工多能性幹細胞を機能的なニューロンネットワークに分化させるために使用できます。この手順を試みるときは、無菌状態で作業し、細胞を優しく扱うことを忘れないでください。この手順に続いて、薬理学的試験などの他の方法を使用して、患者の細胞株で観察された表現型を救うことができます。その開発後、この技術は、神経科学分野の研究者が神経障害のネットワーク活動欠陥を公式に研究する道を開きました。このビデオを見れば、多能性幹細胞を迅速かつ制御された方法でニューロンに分化させ、誘導する方法を十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

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