マイクロ電極アレイ上のネットワーク・アクティビティを測定するための人工多能性幹細胞の急速な神経分化

私たちは、興奮性皮質ニューロン¹²に人間の人工多能性幹細胞（hiPSCs）の、迅速な再現性、および効率的な分化を説明以前に公開されたプロトコルを変更して実施します。具体的には、私たちの修飾は、神経細胞の密度の制御を可能にし、ネットワークレベルでの電気生理学的特性を測定するために微小電極アレイ上で使用します。

このニューロン分化プロトコルの全体的な目標は、微小電極アレイ上で増殖するヒト誘発多能性幹細胞からニューロンネットワークを迅速かつ制御された方法で生成することです。この方法は、神経科学分野の重要な問題に対処するために使用できます。これは、神経障害の根底にある生物学的メカニズムを研究するために使用できますが、より基本的な神経生物学的な問題に対処するためにも使用できます。

この技術の主な利点は、誘導された多能性幹細胞が制御された方法でニューロンに迅速に分化することです。1日目に、DMEM/F12、CDS、およびE8培地を1%ペニシリンストレプトマイシンで室温まで温めます。次に、E8培地にドキシサイクリンを添加して最終濃度を1ミリリットルあたり4マイクログラムにし、次に混合物に岩石阻害剤を添加します。

RTTANGN2陽性の iPSC の使用済み培地を吸引し、1 ミリリットルの CDS を細胞に加えます。その後、加湿した摂氏37度のインキュベーターで細胞を3〜5分間インキュベートします。顕微鏡で、細胞が互いに分離しているかどうかを確認します。

次に、ウェルに2ミリリットルのDMEM / F12を追加します。1, 000マイクロリットルのピペットで細胞を穏やかに懸濁し、次いで15ミリリットルのチューブに移します。その後、7ミリリットルのDMEM/F12を細胞懸濁液に加え、細胞を200 x gで5分間回転させます。

5分後、上清を吸引し、準備したE8培地を2ミリリットル加えます。1, 000マイクロリットルのピペットの先端を15ミリリットルのチューブの側面に当て、細胞を穏やかに再懸濁することにより、hiPSCを解離します。顕微鏡下で、細胞が解離しているかどうかを確認します。

次に、血球計算盤を使用してミリリットルあたりの細胞数を決定します。6ウェルMEAについては、細胞を希釈して、10の7.5倍から5番目の細胞/ミリリットルの細胞懸濁液を得る。カバースリップについては、細胞を希釈して、1ミリリットルあたり10〜4番目の細胞の4倍の細胞懸濁液を得る。

カバースリップと6つのウェルMEAから希釈したラミニンを吸引します。6つのウェルMEAの場合、各ウェルの活性電極領域に100マイクロリットルの細胞懸濁液を添加して細胞をプレート化します。次に、24ウェルプレートの各ウェルに500マイクロリットルの細胞懸濁液を添加して、細胞をプレートします。

次に、6ウェルMEAまたは24ウェルプレートを加湿した摂氏37度のインキュベーターに入れます。2時間後、準備したE8培地500マイクロリットルを6つのウェルMEAの各ウェルに慎重に追加します。その後、6つのウェルMEAを加湿した摂氏37度のインキュベーターに一晩置きます。

3日目に、0.05%トリプシン-EDTAを室温まで温めます。DPBSおよびDMEM/F12を1%ペニシリンストレプトマイシンで摂氏37度まで温めます。.次に、ラットアストロサイト培養の使用済み培地を吸引します。

5ミリリットルのDPBSを加えて培養物を洗い、優しく振り回します。その後、DPBSを吸引し、0.05%トリプシン-EDTAを5ミリリットル追加します。トリプシン-EDTAを優しく振ります。

次に、加湿した摂氏37度のインキュベーターで細胞を5〜10分間インキュベートします。その後、顕微鏡で細胞が剥離しているかどうかを調べます。フラスコを数回叩いて、最後のセルを切り離します。

次に、フラスコに5ミリリットルのDMEM / F12を追加します。10ミリリットルのピペットでフラスコ内の細胞を優しく評価してみてください。その後、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに集めます。

チューブを200 x gで8分間回転させます。その後、スーパーナテントを吸引し、細胞を1ミリリットルのDMEM/F12に再懸濁します。血球計算盤を使用してミリリットルあたりの細胞数を決定します。

次に、4番目のアストロサイトに10の7.5倍を6つのウェルMEAの各ウェルに加えます。そして、24ウェルプレートの各ウェルに4番目のアストロサイトに10を2回加えます。加湿した摂氏37度のインキュベーターで細胞を一晩インキュベートします。

1、200倍の増幅でデータを取得し、MCSデータ収集カードを使用して10キロヘルツで信号をサンプリングします。MEAで培養したhiPSC由来ニューロンの電気生理学的活性を20分間記録します。記録中は、温度を摂氏37度に維持し、加湿ガスをMEAに一定にゆっくりと流すことで、媒体の蒸発とpHの変化を防ぎます。

その後、カスタムソフトウェアパケットを使用してデータを分析します。この図は、分化過程における神経細胞マーカーMAP2のシナプシンにおける発現変化を示しており、神経細胞の成熟を示しています。このグラフは、分化過程で増加した個々の細胞についてシナプシン発現が測定されていることを示しています。

分化の3週間後に細胞内で発現するシナプシンは、PSD-95と共局在し、機能的なシナプスの存在を示しています。ここでは、細胞の電気生理学的活性を測定するために、分化プロセスの異なる時点で全細胞パッチクランプを実行しました。細胞は、異なる時点で活動電位を生成することができました。

また、時間の経過とともにスパイクする細胞の割合が増加したことは、分化の初期段階でも、細胞の大部分が活動電位を生成することができることを示しています。パッチクランプは、細胞が受ける興奮性シナプス後電流を測定するためにも使用されました。細胞が受け取る入力の数は、分化プロセス中に増加しました。

興奮性シナプス後電流の周波数と振幅の両方が、分化プロセス中に増加しました。微小電極アレイ上で分化した細胞の電気生理活性を、分化プロセス中に測定しました。ここでは、分化過程で神経回路網の活動が増加し、23日後には同期的なイベントが見られました。

この手法を習得すると、3〜4週間以内に人工多能性幹細胞を機能的なニューロンネットワークに分化させるために使用できます。この手順を試みるときは、無菌状態で作業し、細胞を優しく扱うことを忘れないでください。この手順に続いて、薬理学的試験などの他の方法を使用して、患者の細胞株で観察された表現型を救うことができます。

その開発後、この技術は、神経科学分野の研究者が神経障害のネットワーク活動欠陥を公式に研究する道を開きました。このビデオを見れば、多能性幹細胞を迅速かつ制御された方法でニューロンに分化させ、誘導する方法を十分に理解できるはずです。