原子力LINCコンプレックス全体に機械的な力を測定するために、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）-forceのバイオセンサーを使用するためのプロトコル

この手順の全体的な目標は、LINC複合体タンパク質であるnesprin-2G用に設計されたバイオセンサーを介して、生細胞のFRET顕微鏡を通じて、核骨格細胞骨格(LINC複合体)のリンカーにかかる力を決定することです。この方法は、生細胞の核内のタンパク質にかかる力や、これらの力がバリアント条件下でどのように変化するかなど、メカノトランスダクションの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、タンパク質や生細胞にかかる非常に小さなレベルの力を測定できることです。

一般的に、この方法に不慣れな人は、画像のキャプチャに苦労します。顕微鏡のレーザー出力とゲインを最適化して、すべての実験グループ間で良好な信号を受信することは困難です。まず、温度とCO2を調節する標準的な細胞培養インキュベーター内の6ウェル細胞培養皿で、NIH 3T3ファイバーブラスト細胞を70%から90%のコンフルエンスまで増殖させます。

細胞培養フードで培地を取り出し、約1ミリリットルの還元血清細胞培地で各ウェルをすすぎます。800マイクロリットルの還元血清細胞培地を各ウェルに加え、6ウェルチャンバーをインキュベーターに入れます。次いで、700マイクロリットルの還元血清細胞培地を、35マイクロリットルの脂質担体溶液を含むLと標識された1.5ミリリットルのチューブにピペットで注入し、リポミックスを形成する。

懸濁液をピペッティングで混合します。次に、還元された血清細胞培地の100マイクロリットルを、1〜6と標識された6本の1.5ミリリットルチューブのそれぞれにピペットで移管する。テキストプロトコルで説明されているように、nesprin tension sensor、nesprin headless zero force control、mTFP1、および venus の血漿 DNA をチューブ 1 から 6 にピペットで移します。

異なる種類のDNAをピペッティングする際には、ピペットチップを再利用しないでください。次いで、Lチューブから各標識チューブに100マイクロリットルのリポ混合液をピペットで移し、チューブ毎に清潔なピペットを用いて、ピペッティングを繰り返して混合する。懸濁液を10〜20分間インキュベートします。

次に、各標識チューブから200マイクロリットルを、調製した細胞を含む6ウェルチャンバーのウェルに加えます。各ウェルの上部に、対応するDNAを添加して標識します。次に、6ウェルチャンバーをインキュベーターに4〜6時間置きます。

インキュベーション後、培地を吸引し、1〜2ミリリットルの還元血清細胞培地を添加してすすぎます。還元された血清細胞培地を吸引し、各ウェルに2ミリリットルのトリプシンを加えてから、6ウェル皿をインキュベーターに5〜15分間入れます。細胞がインキュベーター内で分離している間に、6つのガラス底の観察皿に、リン酸緩衝生理食塩水に溶解した1ミリリットルあたり20マイクログラムの濃度のフィブロネクチンの層をコーティングします。

皿が細胞培養フードの表面をコーティングするのを待ちます。細胞が剥離したら、2ミリリットルのDMEMを追加してトリプシンを中和します。次に、各ウェルの内容物を標識された15ミリリットルの遠心分離管に移し、スイングローター遠心分離機で90倍gで5分間スピンダウンします。

上清を吸引し、ピペットを使用して各細胞ペレットを1, 000マイクロリットルのDMEMに再懸濁します。ガラス皿からフィブロネクチン混合物を吸引し、各細胞懸濁液の1, 000マイクロリットルを皿にピペットで移します。細胞がガラス皿の底に落ち着いたら、各ウェルにさらに1ミリリットルの培地を追加します。

細胞が細胞インキュベーター内で少なくとも18〜24時間センサーを付着させ、発現させる。トランスフェクション効率を確認するには、mTFP1では462ナノメートル、金星では525ナノメートルに近い励起周波数を備えた蛍光顕微鏡を使用します。mTFP1には492ナノメートル付近、金星には525ナノメートル付近を中心とする発光フィルターを使用します。

トランスフェクションが完了してから約18〜24時間後に、倒立蛍光顕微鏡を使用して、蛍光細胞の数と視野内の細胞の総数を比較することにより、トランスフェクションの効率を調べます。トランスフェクション後48時間以内に生細胞をイメージングできない場合は、細胞を4%パラホルムアルデヒドに5分間固定します。細胞がセンサーを発現するのを24〜48時間待ってから固定します。

セルをPBSに保存し、48時間後に表示します。細胞培養フードで、細胞培地を10%ウシ胎児血清を添加したイメージング培地と交換します。観察皿を温度制御された共焦点顕微鏡ステージに置きます。

mTFP1トランスフェクション細胞を装着したガラス製鑑賞皿を、倍率60倍、開口数1.4で油対物レンズの上に置きます。広視野蛍光モードでmTFP1発現細胞を同定します。視野内に蛍光セルがある状態で、スペクトル検出モードを選択し、スペクトル画像をキャプチャします。

458ナノメートルを超えるすべての周波数を10ナノメートル刻みで含めます。細胞上の明るい蛍光領域を選択します。蛍光 ROI 平均を正規化された強度としてスペクトル データベースに追加するには、[スペクトルをデータベースに保存

レーザー出力とゲインを最適化して、良好な信号対雑音比が達成されるようにします。設定は機器によって異なります。静脈発現細胞についてもこのプロセスを繰り返し、スペクトルモードを維持します。

励起周波数は458ナノメートルではなく、488ナノメートルを使用してください。必要に応じて電力設定を調整しますが、放射周波数は変更しないでください。半径約 20 ピクセルの明るい蛍光 ROI を選択します。

蛍光 ROI 平均を正規化された強度としてスペクトル データベースに追加するには、[スペクトルをデータベースに保存] をクリックします。非混合画像をキャプチャするには、まずキャプチャモードをスペクトルアンミキシングに切り替えます。venusとmTFP1のスペクトルフィンガープリントをアンミキシングチャンネルに追加します。

励起レーザーを458ナノメートルのアルゴン源に戻します。ネスプリンテンションセンサーを置きます viewディッシュを60Xオイル対物レンズの上に置きます。十分に明るい発現を持つ蛍光細胞に焦点をあてた後、ゲインとレーザー出力を調整して、S/N比を最適化します。

ネスプリン張力センサーセルの画像を15〜20枚以上、比較的類似した明るさで撮影し、ピクセルの飽和が過度にならないようにします。nesprinヘッドレスセルで、同一のイメージングパラメータを使用して画像キャプチャプロセスを繰り返します。脂質媒介キャリアを用いてネスプリン張力センサーでトランスフェクションした3T3線維芽細胞の代表的な10倍拡大画像を以下に示します。

通常、特定の視野でトランスフェクトされる細胞はごく一部です。ここに示されているのは、スペクトル的に非混合の金星チャネルとmTFPチャネルでネスプリン-TSを発現する2つの3T3原子核の代表的なペアです。2 つのチャネルのマージされたカラー イメージが右端のパネルに表示されます。

これは、パターン化された基質とパターン化されていない基質上の安定発現MDCK細胞からのネスプリン-TSマスク核の代表的なサンプルです。比率画像は、金星チャネルをmTFPチャネルで割った比率として定義され、相対的な定量的な力の比較に使用できます。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約8時間で完了します。

この手順を試行する際は、トランスフェクション中にDNAチューブを慎重に標識し、スペクトル結果画像をキャプチャする際にイメージングパラメータを一定に保つことを忘れないでください。このビデオを見れば、ネスプリンテンションセンサーで細胞をトランスフェクションする方法や、テンションセンサーの力と相関するスペクトル分解された画像をコンピューターのFRETインデックスに取り込む方法についてよく理解できるはずです。この場合、ネスプリンにはFRETセンサーが使用されますが、測定力が必要な細胞内の他のタンパク質にも適用できます。