ACT-PRESTO：生体組織のクリアとボリュームイメージングのための免疫標識方法

この手順の全体的な目標は、透明化された無傷の組織を取得し、免疫標識法を使用してその三次元分子情報を視覚化することです。この方法は、ニューロンの接続、分子分類、発生中の構造変化など、神経科学および発生生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、組織が切片化せずに大きな標本の細胞内レベルの分析を明確に可能にすることです。

この手順を開始するには、固定臓器をA4P0ハイドロゲルモノマー溶液で摂氏4度で12〜24時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。その後、5ミリリットルのヒドロゲルモノマー溶液を10ミリリットルの丸底チューブに加えます。次に、マウスの脳サンプルをそれに移し、チューブの上部をパラフィルムで包みます。

次に、ハイドロゲルを注入した脳サンプルで液体に窒素を1分間泡立てます。サンプルを含むチューブをすばやくしっかりと閉じます。チューブをウォーターバスに2時間移します。

その後、ハイドロゲルの粘度を確認し、重合したサンプルを0.1 X PBSで短時間洗浄して、余分なハイドロゲルを除去します。このステップでは、重合したサンプルを組織容器に移します。そして、ティッシュ容器をETCチャンバーに入れます。

次に、ペリスタルティックポンプを使用してETCチャンバーにETCバッファーを充填します。ETCの条件を設定し、ONにします。厚さ1〜2ミリメートルの脳のスライスは、2時間以内にクリアされます。

そして、5〜6時間以内に全脳が十分にクリアになります。その後、サンプルを45ミリリットルの0.1 X PBSを備えた50ミリリットルの円錐管に移します。チューブを短時間振ったときに気泡が見えなくなるまで、サンプルを0.1 X PBSで数回洗浄し、SDSが完全に除去されたことを確認します。

c-PRESTOを行うには、小さなサンプルを1.5ミリリットルのチューブに移します。コラーゲン4型抗体については、希釈係数1〜500の抗体希釈液500マイクロリットルを添加し、チューブを600倍gで2時間遠心分離します。その後、染色したサンプルを0.1 X PBSで600 gの遠心分離により30分間洗浄します。

次に、Cy3標識抗ウサギ二次抗体について、希釈係数1〜500の抗体希釈液500μLを添加し、600倍gで2時間遠心分離します。その後、染色したサンプルを0.1 X PBSで600回gの遠心分離により30分間洗浄します。より大きな組織に対してs-PRESTOを行うには、サンプルを閉じたバルブ位置の三方弁接続シリンジに移します。

コラーゲン4型抗体については、希釈係数1〜500の抗体希釈液を5〜7ミリリットル加えます。続いて、バルブを開いて抗体溶液をサンプルに加えます。次に、開いているバルブの位置で、シリンジピストンを17ミリリットルの位置にセットして、注入の引き出し動作に十分なスペースを確保します。

その後、シリンジの設定が終了したら、三方弁を閉じます。サンプルの入ったシリンジをシリンジポンプに置きます。シリンジポンプの条件を、注入回収量を毎分10ミリリットルに設定し、連続サイクルモードでの一時停止時間を4分に設定します。

その後、シリンジポンプを室温で3〜24時間運転します。その後、三方弁を開き、溶液を0.1 X PBSと交換します。染色したサンプルをシリンジポンプを使用して、0.1 X PBSで毎回1時間2回洗浄します。

次に、PBSをCy3標識抗ウサギ二次抗体を含む抗体希釈液に交換し、シリンジポンプを3〜24時間運転します。その後、三方弁を開き、溶液を0.1 X PBSと交換します。イメージングに先立ち、染色したサンプルを適量のキュービックマウント溶液に室温で1時間、穏やかに振とうしながらインキュベー

1時間後、溶液を新しいキュービックマウント溶液と交換し、さらに1時間インキュベートします。抗体は拡散によって高密度組織に浸透できないため、PRESTO免疫標識法は高分子を積極的に注入し、試薬を高密度組織に送達するように設計されています。標準的なテーブルトップ遠心分離機を使用して遠心力を加えることで、抗体の送達が著しく容易になりました。

シリンジポンプで対流を当てることで、抗体の浸透性も向上しました。s-PRESTOでは、シリンジポンプを使用して抗体を送達しました。腎臓や肝臓などのマウスの臓器には、コラーゲン4型を標識しました。

従来の方法と比較して、cまたはs-PRESTOを3時間使用することで、ラベリングの深さが格段に向上します。腎臓と肝臓では、z軸の深さはPRESTOサンプルで300〜350マイクロメートル以上に達しますが、対照サンプルはわずか40〜50マイクロメートルの深さで標識されています。一度習得すると、これらのテクニックは、適切に実行されれば、組織に対して1日で明確に行うことができます。

この手順を試行する際には、組織固定の時間を明確に保つことが重要です ヒドロゲルモノマーエマルジョン そして電気泳動組織。この手順に続いて、免疫標識などの他の方法を実行して、細胞ダイナミクスの分析や複数の臓器にわたるニューロンソケットの特定などの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、医学の分野の研究者が病気の診断を探求する道を開きました。

このビデオを見れば、ハイドロゲルの包埋と組織重合の方法について十分に理解できるはずです。ハイドロゲルモノマー溶液での作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には常に予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。