Name: ACT-PRESTO：生体組織のクリアとボリュームイメージングのための免疫標識方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学ぶACT-PRESTO法による生体組織のクリアリングと免疫標識。マウス脳・腎臓・肝臓などの大きな試料を切断せずに三次元分子情報を可視化し、神経回路や発生過程の構造変化を解析できます。

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この研究は、韓国の科学・情報通信・未来計画省(NRF-2015M3C7A1028790)の資金提供を受けた国立研究財団(NRF)の脳研究プログラムの支援を受けました。

動物実験は、関連するすべての政府や機関の規制に準拠する必要があります。 試薬の調製<ol><li>ヒドロゲルモノマー溶液（A4P0）の場合：0.1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の450 mLにアクリルアミドの20グラムを追加し、0.1×PBSで500 mLに音量を調整します。 注意：アクリルアミドモノマーは有毒です。顔面シールド、白衣、手袋、およびクローズドつま先の靴を含め、個人用保護具とヒュームフード内のすべての手順を実行します。 <ol><li>ヒュームフードの下で50 mLのコニカルチューブ中のヒドロゲルモノマー溶液（A4P0）40mLのに2,2&#39;-アゾビス100mgの[2-（2-イミダゾリン-2-イル）プロパン]二塩酸塩を追加し、使用直前に。 </li></ol></li><li>電気泳動組織クリア（ETC）バッファに：ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）および脱イオンH 2 O（DH 2 O）の800 mLまでホウ酸12.37 gとを40g加えます。 NaOHでpHを8.5に調整し、に音量を調整追加の dH 2 Oで1 L 注意：SDSは、有害な化学物質です。そのため、注意してそれを扱います。 </li><li>立方マウント液にスクロース250gの尿素125gの、およびN、N、N 125gののdH 2 Oを150mLまで&#39;、N&#39; -tetrakis（2-ヒドロキシプロピル）エチレンジアミンを加え、体積をdH 2 Oで500 mLまで</li></ol> 2.サンプル調整および固定<ol><li>マウスの安楽死。 <ol><li>同じ注射器でアルファキサロン（1mg / kg）およびキシラジン（0.5ミリグラム/キログラム）を準備します。 </li><li>腹腔内にアルファキサロンおよびキシラジンの混合物を注入し、マウスのための3分間は無意識になることを許可。 </li><li>麻酔をかけたマウスはもはや先に進む前に、このようなテールピンチなどの疼痛刺激に応答するまで待ちません。 注意：動物を処理するための適切な施設のガイドラインに従ってください。 </li></ol></li><li>経の0.9％NaCl（pHが7.4から7.5）溶液100 mLでマウスを灌流1X PBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）を100mL（pH7.4）で14に続いて、放血するために、ヘパリン（100 U / ml）を含みます。 注意：PFA液は有毒です。 PFA溶液およびすべてのその後の取り扱いの調製はドラフト内および個人用保護具を用いて行われなければなりません。 </li><li> 、マウスの頭を切り落とし、皮膚を開き、小さなはさみを使用して、目の間の頭蓋骨を破ります。 </li><li>小さな、湾曲したピンセットを用いて頭蓋骨の部分を削除します。 </li><li>脳または所望の臓器を取り出します。 </li><li> 4℃で一晩ポストフィックス4％PFA溶液中の脳や臓器をインキュベートします。 注：特定の領域の組織をクリアするための特定の領域を分析または組織固定後の組織をトリミングします。 注意：PFA液は有毒です。 transcardial灌流およびそれ以降のすべてのマウス操作はドラフト内および個人用保護具を用いて行われなければなりません。 </li></ol> 3.ハイドロゲルモノマー輸液とポルymerization <ol><li>穏やかに振盪しながら12〜24時間、4℃でA4P0ヒドロゲルモノマー溶液中で固定した器官をインキュベートします。 </li><li>ヒドロゲル組織重合モノマーは、注入されました。 <ol><li>ヒドロゲルモノマー溶液の5 mLを10 mLの丸底チューブに試料を移します。パラフィルム付き丸底管の上部を包みます。 </li><li> 1分間液体窒素をバブリングすることによりハイドロゲルを注入した全マウスの脳試料を含む丸底チューブから酸素を除去。迅速かつ緊密にサンプルを含むチューブを閉じます。 </li></ol></li><li> 2時間水浴（37℃）にチューブを転送します。 </li><li>過剰なヒドロゲルを除去するために、0.1×PBSで簡単に重合したサンプルを洗ってください。 注意：ハイドロゲルモノマーは有毒です。 、ハイドロゲルモノマーとの皮膚接触を避けるドラフト内で、フェースシールド、実験室のコート、手袋などの個人用保護具、とすべての手順を実行します。 注：重合組織4℃で2週間以上のアジ化ナトリウムを含む0.1×PBS中に保存することができます。 注意：アジ化ナトリウムは、高度かつ急性毒性です。顔面シールド、実験室のコート、手袋など、換気フード内および個人用保護具ですべての手順を実行します。 </li></ol> 4.電気泳動の組織のクリア（ETC） <ol><li>組織コンテナに重合したサンプルを移し、ETC室で組織コンテナを配置します。 </li><li>蠕動ポンプを使用して、ETC緩衝液でETC室を埋めます。 </li><li> ETCの条件を設定し、ETC.を実行します次の設定を使用します。 <ol><li>全体の臓器のためのETCの設定については、次の設定を使用します。（1.5アンペア）、温度（37℃）、時間（6.0時間）、ポンプ速度（30 rpm）を実行しています。 </li><li>時間（2.0時間）、ポンプ速度（30 rpm）を実行して、電流（1.5アンペア）、温度（37℃）：1〜2ミリメートルの厚さのマウスの脳切片のためのETCの設定については、次の設定を使用します。 </li></ol></li><li>転送トン彼は、0.1×PBSの45 mLを50 mLのコニカルチューブにサンプルをクリア。チューブが簡単に振られたときに気泡が見られなくなるまで0.1×PBSでクリアサンプル数回洗浄する（SDSの完全な除去を確認するため）。 </li></ol> ACT処理組織の5.免疫標識<ol><li>マウス全脳の場合：希釈1×PBS、6％ウシ血清アルブミン（BSA）、0.1％トリトンX-100、および0.01％アジ化ナトリウム（抗体希釈液）を含む抗体溶液を3 mLの量で試料をインキュベート穏やかな振とうしながら37℃で4日間、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）抗体のための1/500の要因。 2日目の終わりに抗体溶液を交換してください。 <ol><li> 3のために0.1×PBSの45 mLを50 mLのコニカルチューブにサンプルを洗う - 5時間とバッファごとに時間を変更します。 </li><li>穏やかな振とうしながら37℃で4日間、ロバ抗ウサギ488二次抗体のための1/500の希釈係数を有する抗体希釈液の3-mL容量でサンプルをインキュベートします。 REPL2日目に希釈した抗体溶液をエース。 </li></ol></li><li> 1〜2ミリメートルの厚さのスライスした脳組織の場合：37でのIV型コラーゲン抗体についての1/500の希釈係数を有する抗体希釈液の0.5〜1-mL容量で一晩または最大1日のサンプルをインキュベート穏やかな振とうしながら°C。 <ol><li> 1-2時間、0.1×PBSの12-mL容量で、15 mLコニカルチューブにサンプルを洗ってください。バッファごとに時間を変更します。 </li><li>抗ウサギ二次抗体で一晩または軽度に振とうしながら37℃で最大1日のCy3結合のための1/500の希釈係数を有する抗体希釈液の0.5〜1 mLの体積でサンプルをインキュベートします。 </li></ol></li><li> 3のために0.1×PBSでサンプルを洗う - 5時間。バッファごとに時間を変更します。 </li><li>撮影の前に、穏やかに振盪しながら室温で1時間CUBIC-マウントソリューションの適切な量のサンプルをインキュベートします。新鮮CUBIC-マウント溶液で交換し、さらに1時間インキュベートします。 注意： </b&gt;抗体の76型が31モノクローナル抗体14を含む、マウスACT-処理した組織でうまくいきました。前標識された組織は、ACT-処理組織における2つの蛍光色素の免疫標識と組み合わせることができます。 </li></ol>高密度組織の6免疫標識（さきがけ） <ol><li> C-PRESTO 注：C-PRESTOは、全精巣、腎臓全体、またはより大きな臓器の小さいセクションとして小型のサンプルに適しています。 <ol><li> 、1.5 mLチューブに試料を移しIV型コラーゲン抗体のための1/500の希釈率で抗体希釈溶液500μLを追加し、2時間600×gでチューブを遠心します。 </li><li> 30分間600×gで遠心分離することにより0.1×PBSで染色されたサンプルを洗ってください。 </li><li> 2時間600×gでCy3結合抗ウサギ二次抗体および遠心分離機のための1/500の希釈率で抗体希釈溶液500μLを追加します。 </li><li> 0で染色したサンプルを洗ってください。30分間、600×gでの遠心分離によってPBSを1倍。 </li></ol></li><li> S-PRESTO 注：S-PRESTOは、より大きな組織に適しています。 <ol><li>シリンジ（30-mL容量）を準備し、3方弁（ 図1A）に接続します。高圧力条件（ 図1B）のためにグルーガンでバルブを接着。 </li><li>閉弁位置に3方弁に接続されたシリンジにサンプルを転送します。 </li><li>コラーゲンIV型抗体のための1/500の希釈率で抗体希釈溶液の7mLの - 5を加えます。バルブを開くことにより、試料中に抗体溶液を離します。 </li><li>注入/撤退の動きのための十分な余地を提供するために、17-mLの位置に注射器のピストンを設定します。これは開弁位置で行うことができます。注射器の設定が終了した後、3ウェイバルブを閉じます。 </li><li>シリンジポンプでサンプルを含む注射器を置きます。 10ml /分の注入/撤退の体積、4-へシリンジポンプ条件を設定します連続サイクルモード（ 図1C）上の分休止時間。 注：それはターゲット・ボリューム（10 mL）を加え、その後短い休止（4分）後の流れの変化の方向に達するまでポンプが注ぎこみます。 </li><li>室温（ 図1F）で24時間- 3用シリンジポンプを実行します。 </li><li> 3ウェイバルブを開き、0.1×PBSで溶液を交換してください。 </li><li>シリンジポンプを使用して、各時間1時間0.1×PBSで2回染色したサンプルを洗ってください。 </li><li> Cy3結合抗ウサギ二次抗体（1/500の希釈率）を含む抗体希釈液を用いて変更し、3のためのシリンジポンプを実行する - 24時間。 </li><li> 3ウェイバルブを開き、0.1×PBSで溶液を交換してください。 </li></ol></li><li>撮影の前に、穏やかに振盪しながら室温で1時間CUBIC-マウントソリューションの適切な量で染色されたサンプルをインキュベートします。新鮮CUBIC-マウント溶液で交換し、さらに1時間インキュベートします。 </li></ol> 7. Imaging <ol><li>共焦点皿に標識された組織を置き、組織がカバーされるまでCUBIC-マウントソリューションを追加します。組織上のカバーガラスを配置します。 10X対物レンズの下の画像に組織14を共焦点顕微鏡を使用してください。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

組織への悪い固定またはヒドロゲルの浸漬は、タンパク質の損失と組織のクリア処理の間に組織の歪みを引き起こす可能性があります。穏やかに振盪しながら18時間 - 全体の成体マウスの脳は12のためのハイドロゲルモノマー溶液の20ミリリットルの最小容積に浸漬し、その後、一晩、4％パラホルムアルデヒド中でインキュベートされるべきです。脳スライスおよび脊髄などのヒト組織を含む大規模な組織では、ヒドロゲルモノマー溶液中で拡張浸漬時間が必要となります。組織固定とポリマー注入ステップが分離されているので、ACTプロトコルは、固定された組織のクリアに容易に適用可能です。組織クリアした後、ヒト組織は、いくつかの抗体でよく染色しました。 ACTクリア技術は、エタノールやメタノールなどのアルコール固定剤、と互換性がないことに注意してください。 組織ヒドロゲル重合工程は、クリア処理以下の良質な組織を生成するために重要です。なぜなら酸素は、アクリルアミドの重合を阻害し、それは、窒素ガス注入システム下組織を含む溶液を脱気することによって除去されるべきです。あるいはまた、脱酸素化は、23時間の加熱ブロックと真空チャンバーを使用して実行することができます。 クリア率は、ほとんどの成体マウスの組織を一晩ETCによってクリアすることができるなどの器官の大きさ、脂質またはECM線維性タンパク質の内容、固定の状態、を含む多数の要因に依存します。しかし、過剰清算および組織腫脹不要の危険性があります。このように、クリア時間の差が重要な考慮事項です。組織クリア条件は、経験的に決定されるべきです。重要なことには、ECMの内容がクリアされた組織の外観に影響を与え得ます。 ACTは、緻密なタンパク質繊維をクリアしていないため、組織の色は、あってもETCバッファ内のACTの後、白または不透明のまま。しかしながら、これらの器官は、RIマッチング溶液中に浸漬したときyが透明になりました。 組織腫脹率は、組織のECMの内容に依存するように表示され、脳などの柔らかい臓器は、高密度の臓器よりも大きな膨潤率を示します。増加した組織の腫れが組織決済手続きを支援するため、ACTは、日常的に、ほとんどの場合、蒸留水ベースのバッファを利用しています。組織の腫脹または過渡変形は、胚のような、望ましくない場合、いくつかのケースでは、緩衝液を含む0.1×PBSは、高分解能イメージングのために適用することができます。また、緩衝液中のより高い塩濃度は、組織の収縮を引き起こす可能性があることに留意すべきです。 ACTの方法は、マウス14の器官全体、さらには全身を明確にすることができます。しかし、透明な組織の深部組織のイメージングは​​、特殊な顕微鏡や目標が必要です。従って、1〜2mmの厚さの脳組織は、従来の共焦点顕微鏡で画像化するために最も効果的です。私たちの手で、ラベルの除去ACT-処理した組織からのエド抗体は、抗体依存性であり、そして異なる抗体標識のラウンドは推奨されません。このようなTHおよびGFAPなどのいくつかの抗体は、全脳免疫標識14のために特によく働きました。一方、例えばするTuj1またはマップMap2のようないくつかの抗体は、多くの場合、組織の表面のみが標識されます。これは、スイッチ15のような他の方法によって改善されるかもしれません。別の潜在的な制限は、原因で組織クリアステップの間に膨潤・収縮組織のACT加工組織に微細なタンパク質構造を維持することは困難であるかもしれないということです。 PRESTO技術は、組織標識技術の広範囲に適用可能です。例えば、このようなSeeDB 4とiDISCO 7などの前標識された組織を使用して、組織の透明な方法で、緻密な組織の免疫標識は、週に数日より長いインキュベーション期間を必要とします。しかし、さきがけは数時間のインキュベーション時間を短縮することができる、電子1mm厚緻密な組織を持つ日以内に全体のプロセスの完了をnabling。 PRESTOは厚い深い標識、密な組織、あるいは未クリア厚い組織の有効性を高めることができます。 PRESTOテーブルトップ遠心分離機またはシリンジポンプを使用し、特別な装置を必要としないので、ルーチン実験室手順を用いてこの方法を実施することは比較的容易です。

神経科学における課題の一つは、神経回路配線と、無傷の脳組織内の個々の細胞の視覚化です。最近まで、このようにニューロン間の接続を実証するには、組織の1）連続切片を必要と。このような軸索やタンパク質などの具体的な目標、の2）分子の標識。計算登録または2Dシリアル画像1のアライメントを経由して脳全体の3D再構成によると、3）可視化。これらの手順は、手間がかかる多大な時間を必要とし、神経細胞のネットワークマッピングが極めて困難にし、切片およびラベリング中に情報を失うおそれがあります。しかし、切片なしで無傷の組織の可視化を可能にする多くの方法が開発されています。生物組織は、組織透明技術2-10により、光学的に透明にすることができます。主要な方法の一つは、順番に、無傷の組織と浸漬液との間の屈折率の差を低減することですこのように透明な組織をレンダリングし、深部構造の観察を可能にする、無傷の組織内での光散乱を低減することができます。浸漬溶液の種類によっては、脱水過程中に高速の蛍光クエンチングをもたらす疎水性を有しています。したがって、これらの方法は、時間11,12の長い期間にわたって蛍光イメージングと互換性がありません。代わりに疎水性試薬の、他の方法は、生体組織の4,6,8の構造情報と蛍光を維持SeeDB 4とのSca リットル電子 6、のような組織をクリアするための親水性試薬を使用しています。ただし、巨大分子は、抗体を含む、拡散のみによって無傷組織のコアに到達することはできません。したがって、稠密組織の深部領域における標的分子の前標識は技術的に困難です。 最近開発された組織クリア方法では、CLARITY 3、ハイドロゲル包埋生体組織の私アクリルアミド、および脂質で形成されるのは、溶液を含有ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）下で、電気泳動によって除去されます。次いで、試料を3散乱光を低減するために一致する屈折率を有する溶液中に浸漬されます。脂質除去システムは、後に高度なCLARITY 13とPACT（パッシブ明確にする技術）10に変更されました。重合後、アクリルアミド鎖はヒドロゲル組織を形成し、タンパク質と架橋します。脂質成分は、アクリルアミドと架橋することはできません。このように、脂質は、SDS含有緩衝液下での電気泳動によって除去することができます。脂質の活性排除を通じて、脳組織は、著しく透明9増加します。しかし、これらの方法は自由拡散によって深い標識の不可能に対処していません。この制限を克服するために、厚い組織の最も深い部分に試薬の能動輸送のための技術が必要とされます。 CLARITYは、組織の清算と深い組織を可能にするが可視化は、それが容易または高速処理ではありません。これは、全体のマウスの脳7,14をクリアするには数週間かかることがあります。組織の急速なクリアはライフサイエンス研究やボリューム診断のための基本的なまたは臨床検査室の設定に、このような方法の適用のために不可欠です。現在のプロトコルは、圧力補助型送達免疫染色によって生体組織クリアランスとそれに続くタンパク質検出のための単純化された方法を提供します。これは、画像化法との組み合わせを介して提出された大規模な3次元データ処理システムの高解像度ボリュームイメージングに適しています。

<table><tbody><tr><td>4%パラホルムアルデヒド</td><td>Lugen SCI&nbsp;</td><td>LGB-1175-4B</td><td>サンプル固定&nbsp;</td></tr><tr><td>アクリルアミド</td><td>Affymetrix</td><td>75820</td><td>ハイドロゲルモノマー溶液&nbsp;</td></tr><tr><td>2,2'-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]二塩酸塩</td>和<td>光純薬工業&nbsp;&nbsp;</td><td>VA-044</td><td>ハイドロゲルモノマー溶液&nbsp;</td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Affymetrix</td><td>76324</td><td>ETCバッファー</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td>Affymetrix</td><td>18220</td><td>ETCバッファー</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウムペレット</td><td>純正化学</td><td>工業 1310-73-2</td><td>ETCバッファー</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>サンタクルーズバイオテクノロジー</td><td>sc-2323A</td><td>免疫標識</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T8787</td><td>免疫標識</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>免疫標識</td></tr><tr><td>チロシンヒドロキシラーゼ (TH)</td><td>ミリポア</td><td>AB152</td><td>抗体/免疫標識</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Cy3 ロバ抗ウサギIgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>二次抗体/免疫標識</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ロバ抗ウサギIgG (H+L)</td><td>Life Technologies - 分子プローブ</td><td>A21206</td><td>二次抗体/免疫標識</td></tr><tr><td>共焦点ディッシュ</td><td>SPL ライフサイエンス</td><td>101350</td><td>イメージング</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>SP8</td><td>イメージング</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>純生化学</td><td>31365-0301</td><td>キュービックマウントソリューション&nbsp;</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Affymetrix</td><td>23036</td><td>CUBICマウントソリューション&nbsp;</td></tr><tr><td><>N,N,N',N'-tetrakis(2-hydroxypropyl)エチレンジアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>122262</td><td>CUBICマウント溶液&nbsp;</td></tr><tr><td>ECTチャンバー</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10101</td><td>ETCシステム</td></tr><tr><td>ECTチャンバーコントローラー</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10201</td><td>ETCシステム</td></tr><tr><td>温度プローブ</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12101</td><td>ETCシステム</td></tr><tr><td>ペリスタティックポンプ</td><td>保定長精密ポンプ Co., Ltd</td><td>YZ1515X</td><td>ETCシステム</td></tr><tr><td>バッファーリザーバー</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10401</td><td>ETCシステム</td></tr><tr><td>ティッシュ容器&nbsp;</td><td>ロゴス・バイオシステムズ(株)</td><td>C12001</td><td>ETCシステム</td></tr><tr><td>ティッシュ容器1個用コンテナホルダー</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12002</td><td>ETCシステム</td></tr><tr><td>マウス脳スライスホルダー</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12004</td><td>ETCシステム</td></tr><tr><td>全ラットブレインホルダー</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12007</td><td>ETCシステム</td></tr><tr><td>蠕動ポンプチューブ</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12104</td><td>ETCシステム</td></tr><tr><td>卓上型遠心分離機</td><td>韓一科学工業(株</td>) <td>MICRO 12</td><td>c-PRESTO</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>保定長精密ポンプ(株</td>) <td>LSP02-1B</td><td>s-PRESTO</td></tr><tr><td>シリンジ(30mL)</td><td>韓国ワクチン(株)</td><td>KV-S30</td><td>s-さきがけ</td></tr>3<tr><td>方向活栓</td><td>(株)ヒョプソンメディカル</td><td>HS-T-01N</td><td>s-さきがけ</td></tr></tbody></table>

act-presto：生体組織のクリアとボリュームイメージングのための免疫標識方法

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

細胞レベルでの臓器の詳細な組織または全身の同定および探査は、生物学における基本的な課題です。移行方法は、三次元画像を得るために時間と労力のかなりの量を必要とし、無傷の組織、免疫標識、およびプロセスの各段階における情報の損失を生成する撮像直列切片組織を切片を含みます。無傷の組織内の高分解能イメージングのための最近開発された手法では、分子の特徴付けは、タンパク質の標識に制限されています。しかし、臓器をクリアするための現在利用可能なプロトコルは、それが困難な実験室での組織のクリア技術を実装すること、かなり長い処理時間を必要とします。我々は最近、迅速かつ再現性の高いプロトコルは、ACT-PRESTO ransfer トン （A ctive C larity トン echnique- のp ressure rの高揚電子の fficientとsテーブルと呼ばれる確立しました数時間以内に組織クリアランスを可能にする入出力 rgansへの巨大分子）、の。また、ACT-PRESTOは、従来の方法で迅速な免疫標識を可能にし、圧力または対流の流れを適用することにより、高密度に形成され、厚さの試験片の深い層への抗体の浸透を加速させます。私たちは、電気泳動を用いて脂質を除去することによってクリアする方法を組織し、準備する方法を説明し、方法圧力補助送達によって免疫染色します。プロトコルの迅速性と一貫性は、3D組織学的研究とボリュームベースの診断のパフォーマンスを促進します。

ACT-組織のクリア 組織のクリアに影響を与える1つの重要な要因は、組織固定です。 PFA固定およびアクリルアミドの注入は、このプロトコルで別個のステップです。組織注入ヒドロゲルは、内因性高分子と架橋されているが、組織ヒドロゲル重合工程の後、フリーA4P0溶液は、重合されていません。したがって、ゲルが組織（ 図2A）の外側を形成するべきではありません。 CLARITYプロトコルに比べてタンパク質とアクリルアミドとの間に以下の架橋におけるACT手順の結果。したがって、組織ヒドロゲル試料は、より多孔質です。この機能は、脂質の高速抽出と高分子の拡散を可能にします。 1〜2ミリメートルの厚さのマウスの脳の切片を、十分に1内にクリアされた- 2時間（ 図2B）、および5 - ETCの6時間は、cのために十分でした全マウスの脳（ 図2C）のlearance。ヒドロゲル媒介組織のクリアがETC工程後の組織の拡大を誘導したが、組織は、屈折率が一致した溶液中での元のサイズに戻りました。 ACT手順において形成された組織ヒドロゲル試料は高度に多孔質であるため、低分子化合物および高分子を効率的に浸透する可能性があり、（ 図3）容易に拡散します。チロシンヒドロキシラーゼ（TH）およびコラーゲンIV型抗体で1 mmの脳切片を2時間インキュベートした後、二次抗体とその後の2時間のインキュベーションが500μmの深さでのドーパミン作動性ニューロンを標識するのに十分であった（ 図3） 。 PRESTO-組織免疫標識 高密度の器官は、一般に組織への抗体の浸透に影響するECM繊維の高濃度を有します。したがって、抗体はpenetインキュベーションの12時間後に、このような腎臓組織などの密な組織で唯一の20〜30ミクロンの深さに評価しました。この制限を克服するために、我々は深い組織への試薬の提供を可能にアクティブな巨大分子の浸透方法を設計、すなわちPRESTO（器官への巨大分子の圧力に関連する効率的かつ安定した転送）（ 図4）。抗体溶液、卓上遠心分離機（遠心PRESTO、C-PRESTO）深部組織に大幅に改善された抗体の配信（ 図5）と遠心力（600 XG）を適用してACT-処理さ腎組織の静的インキュベーションと比較すると。我々は緻密な組織へのc-PRESTOの手順を適用すると、3時間のインキュベーションは、300μmの深部構造に250-をラベルするのに十分でした。重大な組織の損傷なしで組織の歪みを改善するために、我々はまた、シリンジポンプ（シリンジPRESTO、S-PRESTO）で対流を提供する機械を設計しました。このプロセスは、同様に、抗体のPEを向上します受動拡散（ 図5）に比べnetration。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig1.jpg"> S-PRESTO装置の図1.準備。 A.シリンジ（30mL）および三方活栓。 B.三方活栓に接続し、シリンジに接着。 C.試料及び抗体溶液を含むシリンジ、シリンジポンプ上に配置されたシリンジ。 D.シリンジポンプや作業条件設定。 E.ポンプは、試料に標識試薬を含む溶液を注入します。指定されたボリュームは、ポンピング方向の変化に達し、時間の指定期間後の溶液を撤回した場合。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> マウスの脳の図2. ACT組織クリア。 A.重合後、自由A4P0ソリューションが重合されていません。組織注入されたヒドロゲルは、内因性高分子と架橋することによってゲル化されています。厚さ2mmの脳切片へのB. 1-は1のためにクリアされた- 2時間、およびソリューションを-matching屈折率（RI）の拡大とサイズの回復の程度を記録しました。 C.は、全マウスの脳の厚さは約0.8 cmで、かつ5 - ETCの6時間は、完全に透明な脳に十分でした。 ETCの3時間後に、非クリア組織のかなりの量が存在しました。 ETCの6時間では、しかし、脳全体のクリアが発生していました。 ETCバッファ内のACT後の組織の色は白または不透明です。 RI調整することで、組織が透明になります。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">彼女をクリックしてください</a>eは、この図の拡大版を表示します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig3.jpg"> ACT-クリアマウスの脳組織図3.免疫標識。コラーゲンIV型およびチロシンヒドロキシラーゼ（TH）に対する抗体で染色した中脳の一部に対する抗体で染色したマウス脳皮質を示すACT-処理1mmのマウス脳切片の写真。スケールバーは100μm。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig4.jpg"> 図4.さきがけ免疫標識方法。抗体は、拡散により緻密な組織に浸透することはできません。さきがけ免疫標識法が積極的に高分子を注入すると、中に試薬を提供するように設計されました緻密な組織。標準的な卓上型遠心分離機（遠心PRESTO、C-PRESTO）を使用して、遠心力の適用は著しく抗体の送達を容易にしました。シリンジポンプ（シリンジPRESTO、S-PRESTO）改善された抗体の浸透と対流をアプリング。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig5.jpg"> ACT-クリア緻密な組織の5さきがけ免疫標識図。 C-PRESTOの場合、組織は一次および二次抗体の浸透を促進するために、標準的な卓上型遠心機を用いて3時間600×gで遠心分離しました。 S-PRESTOために、シリンジポンプは、抗体を送達するために使用されました。例えば、腎臓および肝臓などのマウスの器官は、IV型コラーゲンで標識しました。従来の方法の3時間と比較してC-またはs-PRESTOは著しく、標識の深さを向上させます。コントロールサンプルは、わずか40の深さで標識されているが、さきがけサンプル（右）で350ミクロンまたはより深い - - 50ミクロン（左）、腎臓および肝臓では、Z軸の深さが300に達します。 3次元再構成画像は、共焦点顕微鏡を用いて得ました。スケールバーは100μm。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

ACT-PRESTO（器官への巨大分子のアクティブな明快技術-圧力関連の効率的かつ安定した転送）は、受動拡散または圧力補助送達によるクリア組織への、迅速、効率的な、しかし、安価な組織清算および迅速な抗体の浸透を可能にします。この方法を使用して、組織の広い範囲は、クリア複数の抗体によって免疫標識、および体積画像化することができます。

ACT-PRESTO：生体組織のクリアとボリュームイメージングのための免疫標識方法

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

この手順の全体的な目標は、透明化された無傷の組織を取得し、免疫標識法を使用してその三次元分子情報を視覚化することです。この方法は、ニューロンの接続、分子分類、発生中の構造変化など、神経科学および発生生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、組織が切片化せずに大きな標本の細胞内レベルの分析を明確に可能にすることです。この手順を開始するには、固定臓器をA4P0ハイドロゲルモノマー溶液で摂氏4度で12〜24時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。その後、5ミリリットルのヒドロゲルモノマー溶液を10ミリリットルの丸底チューブに加えます。次に、マウスの脳サンプルをそれに移し、チューブの上部をパラフィルムで包みます。次に、ハイドロゲルを注入した脳サンプルで液体に窒素を1分間泡立てます。サンプルを含むチューブをすばやくしっかりと閉じます。チューブをウォーターバスに2時間移します。その後、ハイドロゲルの粘度を確認し、重合したサンプルを0.1 X PBSで短時間洗浄して、余分なハイドロゲルを除去します。このステップでは、重合したサンプルを組織容器に移します。そして、ティッシュ容器をETCチャンバーに入れます。次に、ペリスタルティックポンプを使用してETCチャンバーにETCバッファーを充填します。ETCの条件を設定し、ONにします。厚さ1〜2ミリメートルの脳のスライスは、2時間以内にクリアされます。そして、5〜6時間以内に全脳が十分にクリアになります。その後、サンプルを45ミリリットルの0.1 X PBSを備えた50ミリリットルの円錐管に移します。チューブを短時間振ったときに気泡が見えなくなるまで、サンプルを0.1 X PBSで数回洗浄し、SDSが完全に除去されたことを確認します。c-PRESTOを行うには、小さなサンプルを1.5ミリリットルのチューブに移します。コラーゲン4型抗体については、希釈係数1〜500の抗体希釈液500マイクロリットルを添加し、チューブを600倍gで2時間遠心分離します。その後、染色したサンプルを0.1 X PBSで600 gの遠心分離により30分間洗浄します。次に、Cy3標識抗ウサギ二次抗体について、希釈係数1〜500の抗体希釈液500μLを添加し、600倍gで2時間遠心分離します。その後、染色したサンプルを0.1 X PBSで600回gの遠心分離により30分間洗浄します。より大きな組織に対してs-PRESTOを行うには、サンプルを閉じたバルブ位置の三方弁接続シリンジに移します。コラーゲン4型抗体については、希釈係数1〜500の抗体希釈液を5〜7ミリリットル加えます。続いて、バルブを開いて抗体溶液をサンプルに加えます。次に、開いているバルブの位置で、シリンジピストンを17ミリリットルの位置にセットして、注入の引き出し動作に十分なスペースを確保します。その後、シリンジの設定が終了したら、三方弁を閉じます。サンプルの入ったシリンジをシリンジポンプに置きます。シリンジポンプの条件を、注入回収量を毎分10ミリリットルに設定し、連続サイクルモードでの一時停止時間を4分に設定します。その後、シリンジポンプを室温で3〜24時間運転します。その後、三方弁を開き、溶液を0.1 X PBSと交換します。染色したサンプルをシリンジポンプを使用して、0.1 X PBSで毎回1時間2回洗浄します。次に、PBSをCy3標識抗ウサギ二次抗体を含む抗体希釈液に交換し、シリンジポンプを3〜24時間運転します。その後、三方弁を開き、溶液を0.1 X PBSと交換します。イメージングに先立ち、染色したサンプルを適量のキュービックマウント溶液に室温で1時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。1時間後、溶液を新しいキュービックマウント溶液と交換し、さらに1時間インキュベートします。抗体は拡散によって高密度組織に浸透できないため、PRESTO免疫標識法は高分子を積極的に注入し、試薬を高密度組織に送達するように設計されています。標準的なテーブルトップ遠心分離機を使用して遠心力を加えることで、抗体の送達が著しく容易になりました。シリンジポンプで対流を当てることで、抗体の浸透性も向上しました。s-PRESTOでは、シリンジポンプを使用して抗体を送達しました。腎臓や肝臓などのマウスの臓器には、コラーゲン4型を標識しました。従来の方法と比較して、cまたはs-PRESTOを3時間使用することで、ラベリングの深さが格段に向上します。腎臓と肝臓では、z軸の深さはPRESTOサンプルで300〜350マイクロメートル以上に達しますが、対照サンプルはわずか40〜50マイクロメートルの深さで標識されています。一度習得すると、これらのテクニックは、適切に実行されれば、組織に対して1日で明確に行うことができます。この手順を試行する際には、組織固定の時間を明確に保つことが重要です ヒドロゲルモノマーエマルジョン そして電気泳動組織。この手順に続いて、免疫標識などの他の方法を実行して、細胞ダイナミクスの分析や複数の臓器にわたるニューロンソケットの特定などの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、医学の分野の研究者が病気の診断を探求する道を開きました。このビデオを見れば、ハイドロゲルの包埋と組織重合の方法について十分に理解できるはずです。ハイドロゲルモノマー溶液での作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には常に予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

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