線状インベーゾームの形成および活性を研究するための2Dおよび3Dマトリックス

私たちのグループでは、細胞と細胞外マトリックスの相互作用に取り組んでいます。細胞は細胞外マトリックス要素を生成することができますが、分解することもできます。マトリックスの分解は、生理学的過程だけでなく、神経変性や細胞腫瘍の浸潤などの病理学的過程でも発生する可能性があります。

細胞レベルでは、マトリックスの分解に関与するアクチンベースの構造の存在に気づくことができます。そして、これらの構造は侵入体と呼ばれます。インバドソームは、正常細胞のポドソームと癌細胞のインバドポディアを含む一般的な用語です。

この侵入体の分解は、さまざまな形状、ドット、凝集体、ロゼットで自己組織化できます。そして、このインバドソームの活性は、MMP2やMT1-MMPなどのメタロプロテイナーゼによって駆動されます。これは、カップル、MMP2、MT1-MMPが1型コラーゲン線維によって活性化されることは長くはありません。

インバドソームの活性を研究するために、古典的なザイモグラフィーin-situアッセイが使用されました。しかし、インバドソームにおける1型コラーゲン線維の役割と影響を研究するために、私たちは新しいアッセイを作成することにしました。これを行うために、ゼラチンと1型コラーゲン線維からなる混合マトリックスを作成しました。

この映画の第1部では、Eloide Henrietがこの種のマトリックスを生成する方法を紹介します。第2部では、Zakaria Ezzoukhryが、侵入体の形態、形成、活性化における1型コラーゲン線維の影響を測定する方法を示します。そして最後のパートでは、Julie Di Marinoが3Dコラーゲン侵入アッセイをどのように適応させるかをご紹介します。

ゼラチンと1型コラーゲン原線維からなる混合マトリックスの作り方をお見せします。2種類の混合行列を行います。1つは、フルオレセインゼラチンと非フルオレセイン1型コラーゲンを使用してザイモグラフィーin-situアッセイを行うためのものです。

そしてもう一つは、非フルオレセインゼラチンと標識されたコラーゲン線維でコラーゲン線維を視覚化することを可能にします。ゼラチンマトリックスを調製するには、パラフィルムに20マイクロリットルのゼラチン液滴を分注します。各液滴をオートクレーブ処理したガラスカバースリップで覆います。

室温で20分間インキュベートし、光から保護します。ゼラチン固定のために、PBS中の0.5%グルタルアルデヒドの40マイクロリットルの液滴を分注します。鉗子を使用して、ゼラチンでコーティングされたカバースリップを各グルタルアルデヒド液滴に移します。

室温で40分間インキュベートし、光から保護します。マルチウェル細胞培養プレートを手に取り、各ウェルに500マイクロリットルの滅菌1X PBSを充填します。インキュベーション期間の終わりに、各カバースリップをゼラチン面を上にして各ウェルに入れます。

カバースリップを1X PBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。このステップでは、カバースリップを実験に使用したり、後で使用するために保管したりできます。1mlあたり0.4mgのコラーゲンをチューブにピペットで移します。

蛍光色素を最終濃度10μg/mLに添加し、溶液をチューブ内で混合し、室温で光から保護して5分間インキュベートします。1x DPBSで最終容量まで希釈し、マルチウェルプレートのゼラチンコーティングされたカバースリップの上に500マイクロリットルの溶液を加えます。

コラーゲン重合のために摂氏37度で4時間インキュベートします。インキュベーション後、余分なコラーゲンを取り除きます。最終容量500マイクロリットルの細胞を添加し、固定する前に細胞を摂氏37度でインキュベートします。

このタイプのマトリックスは、フィブロネクチン、ビトロネクチン、IV型コラーゲンなどの他のマトリックス要素で修飾できます。私のパートでは、インバドソームのマーカーであるTks5を使用して免疫蛍光法を行う方法と、コラーゲン1型コーティングされたカバースリップ上の線状インバドソームを定量する方法を紹介します。線状インバドソームに存在する細胞の数によって結果を提示することもできますが、各細胞の構造の数を示すこともできます。

カバースリップをPBS中の4%パラホルムアルデヒド500マイクロリットルで10分間固定します。1x PBSで2回洗浄し、0.2%Triton X-100を1x PBS溶液中で10分間細胞に透過処理します。パラフィルム片に1x PBS中の4%BSA中の一次抗体溶液の50マイクロリットルの液滴を分注します。

各カバースリップを液滴の上に置きます。光から保護した室温で40分間インキュベートします。カバースリップを1x PBSで2回洗浄し、光から保護された二次抗体、コロイジン、ヘキスト色素でカバースリップを30分間インキュベー

インキュベーション後、1x PBSで2回洗浄し、続いて蒸留水で塩分を除去します。カバースリップを重合封入剤でスライドガラスに取り付けます。イメージングする前に、スライドを室温で一晩乾かします。

画像解析のためには、共焦点顕微鏡を用いてアクチンとTks5の画像を順次取得します。細胞あたりの線状インバドソームのサイズと数を定量化するには、ImageJソフトウェアと付属のマクロを使用します。まず、ImageJでマクロを実行し、アクチンイメージを開きます。

その後、Tks5画像を開きます。しきい値を設定し、マクロを適用します。分析結果は 2 つのテーブルに表示されます。

細胞あたりの線形インバドソームの数と、セル内の線形インバドソームが使用する面積の割合などの他の情報は、サマリーテーブルに表示されます。各直鎖状インバドソームのサイズは、結果表に表示されます。画像の定量化後、細胞あたりの構造数を示すことで結果を提示することができます。

そこで私のパートでは、線状インバドソームの存在を3Dで実証する方法を適応させます。私たちは、コラーゲン1線維のみで構成されるゲルを実現し、このアッセイはコラーゲン1コンテキストでの細胞浸潤を評価するために使用されます。氷上で1型コラーゲン溶液を最終濃度2mg/mLで調製します。

蛍光色素を1ミリリットルあたり1マイクログラムの最終濃度で加えます。溶液を混合し、光から保護されて氷上で5分間インキュベートします。その後、氷冷した10x PBSを50マイクロリットル加えます。

次に、6.25マイクロリットルの氷冷した1モルの水酸化ナトリウムを追加します。滅菌水を加えて正しい濃度にし、溶液を混合します。ボイデンチャンバーインサートをマルチウェル細胞培養皿に入れます。

各インサートに100マイクロリットルのコラーゲン溶液を1液ずつ加えます。コラーゲンゲルを重合するには、皿を摂氏37度で1時間インキュベートします。血清が豊富な細胞培養培地を各ウェルに加え、インサートを培地に入れます。

コラーゲンゲルの上に無血清培地で30, 000個の細胞を播種します。細胞を固定するには、空のウェルに4%パラホルムアルデヒド溶液を追加します。コラーゲンゲルに触れずに、細胞培地をインサートから取り出します。

インサートを4%パラホルムアルデヒド溶液を含むウェルに入れ、コラーゲンゲルの上に4%パラホルムアルデヒド溶液を追加します。室温で30分間インキュベートします。固定後、4%パラホルムアルデヒド溶液を取り出し、1x PBSで洗浄します。

洗濯後、コラーゲンジェルは透明になるはずです。これで、インサートは免疫蛍光染色の準備が整いました。まず、インサートを排水します。

次に、インサートをマルチウェルプレートの新しいウェルに配置します。細胞を透過処理するには、1X PBS中の0.2%Triton X-100の溶液をコラーゲンゲルの上に30分間加えます。インサートを排水します。

1X PBSで洗浄し、コラーゲンゲルの上に一次抗体溶液を1時間、光から保護して加えます。一次抗体溶液を取り出し、1X PBSで洗浄し、コラーゲンゲルを二次抗体溶液と1.5時間インキュベートします。二次抗体溶液を1X PBSで洗浄します。

コラーゲンゲルを埋込用に調製するには、メスでインサート膜を切断します。メンブレンに付着したコラーゲンジェルをガラス底の皿に入れます。ジェルの上部が皿の底に接触していることが重要です。

封入剤と上部に顕微鏡観察用のカバースリップを追加します。このアッセイにより、コラーゲン1ゲル中の細胞浸潤におけるDDR1受容体の重要な役割を実証しました。このアッセイは、細胞浸潤に対する薬物の影響を評価するためにも使用できます。

私たちの異なる研究では、その生理学的確認に細胞外マトリックスの新しい要素を追加するだけで、ここでは1型コラーゲンフィブリルが、侵入体の形態、分子組成、および活性を変更できることを示しました。そこで、この動画で紹介したさまざまなアッセイを用いて、新しい構造の存在、つまり線状インバドソームと名付けたインバドソームの新しい組織の存在を実証しました。複雑でより生理学的なマトリックスを生成することで、細胞の追加、移動、および浸潤に関与する新しい経路の特定が可能になります。