Name: インスリン依存性血管拡張や筋肉の血流を研究する生体顕微鏡観察とマウスの後肢の造影超音波検査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 学ぶマウス後肢の生体顕微鏡観察と造影超音波検査によるインスリン依存性血管拡張と筋肉血流の測定法。2型糖尿病と肥満におけるインスリン感受性と微小循環の関係を解明する。

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Ing に感謝いたします。本研究で用いた画像解析ソフトウェア (ImageGrabber) のプログラミングにダンカン ・ ヴァン ・ トヨタプリウス。この研究を提供するための資金調達からオランダ科学研究 (グラント 016.136.372) 機構のビディ助成金によって。

すべての動物実験は、ローカル動物のケアと倫理委員会で承認されています。応じて外因ランプの端までマウスで麻酔導入からプロトコル全体は、約 2 時間かかります。
1. 顕微鏡の準備
<ol><li>14 時間後 20-25 g の重量を量る男性マウスの鎮痛と麻酔作用やフェンタニル (0.31 mg/kg)、ミダゾラム (6.25 mg/kg)、アセプロマジン (6.25 mg/kg) (FMA 麻酔) の腹腔内注入断食を一晩の上に置きます、37 ° C の体温を維持する直腸温度管理された恒温加熱パッド</li>
	<li>アルコール ベースのソリューションを使用して数回機器操作テーブルを消毒します。</li>
	<li>27 G 針を付ける 10 cm 長いポリエチレン管 (PE 20)、4 ウェイ コネクタにチューブを取り付けます。尾静脈に針を挿入し、組織接着剤のゲルを使用してそれを固執します。このカニューレは、マイクロバブル、インスリン、グルコース、麻酔の注入に使用されます。 注: 追加するヘパリン (5 U/mL)、穿刺時に滅菌生理食塩水で尾静脈 (約 10 μ L) をフラッシュするプロセスは、詰まっているカニューレの可能性を低減できます。</li>
	<li>手術の手順、実験的プロトコルを通して基、33.75 μ L/kg/分の速度で尾静脈カニューレを介して FMA 麻酔の持続静脈内投与による麻酔を維持します。</li>
	<li>腹側にマウスを配置し、上部太ももの領域を公開する耐熱性のテープを使用して、足を修正します。太ももの内転筋コンパートメントで筋肉のストレッチを標準化するのに膝関節、股関節 (後肢の足が上向き)、40-60 ° の角度のわずかな exorotation を使用します。</li>
	<li>脚の付け根と二国間脱毛クリームを使用して太ももの上部エリアで髪を削除します。湿った綿棒を使ってすべての抜け毛を収集します。</li>
	<li>顕微鏡の下にマウスを置き、10 X 16 X の倍率を使用して次の手術の手順を実行します。</li>
	<li>腹部の曲率 (図 1) のすぐ外側鼠径靱帯に平行に走る皮はさみを使用して 2 cm の切開を行います。遠位ブルドッグ クランプ (図 1) を使用して切開部の遠位側にトラクションを適用します。これはウィンドウを必要に応じて調整し、(1.12 で説明) パラフィン オイルを保持するために役立ちます。</li>
	<li>腹壁から脂肪組織を解剖します。出血を避けるため、パッドを介して直接解剖ではなく壁から脂肪パッドを優しきます。遠位方向に脂肪質のパッドで穏やかなトラクションはプロセス (図 1) を容易にするため。</li>
	<li>大腿動脈を識別し、最初の主要な枝 (薄動脈と下腹壁動脈) の下にそれに従う (図 2)。薄動脈は大内転筋で実行されている大腿動脈の最初の主要な支店は、薄筋への深い実行されます。IVM の薄動脈が使用されます。</li>
	<li>透明深在筋膜、筋肉や血管をカバーを識別します。シャープな鉗子を使用して、上向きに筋を引くし、microscissor を使用してそれをカットします。</li>
	<li>薬用液体パラフィンのドロップ (200 μ L) で露出した筋肉をカバー (室温、または 37 ° C に加温) 準備されたティッシュが乾くを防ぐために。油滴が漏れ出ないことを確認します。ブルドッグ クランプを使用して血管を浴び、パラフィン オイルを保持するために小さな空洞を作成する切開の皮膚のひだを調整します。</li>
	<li>薄動脈がコンピューターの画面に縦書きになるように校正以前顕微鏡 (16 X 光学倍率) の下にマウスを配置します。顕微鏡カメラとコンピューターを付けるイメージ データ セットから血管の直径を抽出する解析システムです。直径は、容器の 2 つの内腔側の間の距離です。継続的な監視と動脈径の測定が望ましいです。</li>
	<li>光から頭の伝導を減らすために後肢から十分な距離を (最低 20 cm) に光源を配置します。</li>
	<li>Prewarmed 超音波伝達ゲルを上部の対側の後肢に適用します。大腿骨の長軸に垂直な超音波プローブを配置します。</li>
	<li>内転筋群の断面ビューを取得する超音波プローブの方向と角度を慎重に調整します。マウスに対する超音波プローブの位置を基準と応じて測定の同じ画像平面を保つために安定させるために注意してください。</li>
	<li>30 分間を安定させるマウスをしましょう。薄動脈の直径は基準径を記録する前に 10 分間安定しているはずです。</li>
</ol>2. ベースラインと応じて測定
<ol><li>ベースライン薄動脈径が、IVM に使用されるコンピューター プログラムによって保存されたことを確認します。</li>
	<li>コールター カウンター 2.5 倍の実験の前にちょうど 10 の9泡/mL の濃度を説明35カウントとマイクロバブルを事前に準備します。</li>
	<li>
気泡は超音波検査機のコントラスト モードでのみ表示できる、イメージに影響を与えるパラメーターを制御コントラスト データ収集 (に記載されている 2.3.1) と集録中に一貫して使用します。
	<ol>
<li>超音波検査機で次の設定を使用: コントラスト利得 35 デシベル。時間オフに補償を得るため線密度高;全体; する焦点ゾーンの数4% に動力を伝達します。標準; にビーム幅を送信します。4 SV ゲート感度を 1 にオフに永続化します。関心領域の中央に焦点ゾーンの場所をレベルします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>短いを保存 (5 s) クリップ。これは、バック グラウンド信号を計算するため使用されます。</li>
	<li>バイアルの均一懸濁に手でマイクロバブルを振る。5 μ L/分の速度で尾静脈カニューレを使用してマイクロバブルを注入を開始します。マイクロバブルの均一な懸濁液を維持するために振動渦 (毎分 200 x) に注入管を配置します。</li>
	<li>定常状態レベルに達するので、マイクロバブルの連続的な注入の 5 分を許可してください。マイクロバブル注入 (図 3 a) の開始後 5 分、10 分の超音波検査機で泡マイクロバブル破壊関数 (MBD) を使用しての時間強度曲線を取得するのに進みます。ベースライン血流データを取得するこれらの 2 つの測定の平均信号を取る。</li>
	<li>
ベースライン データを取得した後に、説明34として応じて外因クランプを起動します。インスリンとグルコース (および麻酔) を管理する (1.3 に配置) 尾カニューレを使用します。
	<ol>
<li>60 分使用インスリン持続注入 (7.5 mU/kg/分) に続いて 200 mU/kg インスリン ボーラスを導入することで 20% の可変注入に応じて状態を一言で言えば、誘導 D-グルコース euglycemia を維持するために。</li>
		<li>血糖値モニタリング デバイスと 5 分ごとの尾静脈から血糖値を評価し、5 mM 可変ブドウ糖点滴速度を調整することによって維持します。最後の 30 分間平均グルコース注入率を平均することによってインスリン感受性を決定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>薄動脈の直径が (10, 30, 60 分) で、例えばコンピューターのプログラムで応じて外因クランプの開始の目的の期間に記載されていることを確認します。</li>
	<li>25 分後やインスリン クランプの 55 分は、30 または 60 分、MBV をそれぞれ文書化する 2 番目の (応じて) CEUS 測定を開始します。2.4 および 2.5 に記載されている同じ手順に従います。デタッチし、マイクロバブルを注入する 4 ウェイ コネクタの麻酔ポートを使用します。マイクロバブル注入の終わりの後麻酔チューブを接続し直します。</li>
	<li>IVM とインスリン注入 CEUS 測定開始後 60 分の終了後、後で分析のため心臓穿刺処置によりマウスから血を撤回します。これはまたマウスを安楽死させます。慎重に薄と大腿動脈を分析し、さらに必要な実験のために保存 (例えば、西部のしみのため前のヴィヴォ圧力図法、免疫組織化学実験36,37、 38)。</li>
</ol>3. オフライン解析

注: IVM と CEUS 測定解析をオフラインで実行して盲検治験責任医師によってする必要があります。CEUS は、一時的に MBD 関数を使用して高強度超音波による微小気泡の破壊によって大きな船から微小循環を区別するために可能性を提供しています。((A.u)、任意の単位で測定) 大きな船の信号が対応する血管内微小気泡速度のため微小循環のそれらより速く復元されます。
<ol><li>超音波マシンでオフライン ワークステーションまたはソフトウェアを使用して、分析を行う。</li>
	<li>利益率 (ROI) に微小循環を含めるの領域を描画します。大きい大腿血管 (図 3 a) を含める別の ROI を描画します。</li>
	<li>ソフトウェアの構築投資収益率コピー関数を使用して応じて、基準バック グラウンド測定用微小循環のとより大きな船・ ロワを重複してください。</li>
	<li>ベースラインからバック グラウンド測定と応じて測定値の輝度信号を減算します。</li>
	<li>大腿血管の輝度信号による微小循環の輝度信号を分割します。ベースラインと応じて MBVs を比較今すぐことができます。</li>
</ol>

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大きい動脈 (IVM を使用) と (CEUS 使用) 骨格筋の微小循環のインシュリンの血管操作を同時に推定する手法を開発しました。成功し、信頼性の高い測定の重要なステップは、: 1) 出血せず薄動脈を正しく公開します。2) 入浴動脈; パラフィン油の漏れを防止します。3) 投与による血管作動性化合物 (インスリン) および造影剤 (マイクロバブル) の特許静脈アクセス (尾静脈カニューレ) を持ちます。
筋障害の研究は肥満とインスリン抵抗性14,25,39,40のコンテキストで注目を得ています。肥満とインスリン抵抗性の血管機能の負の影響は、血管のツリーのさまざまなレベルで示されています。今後は、これらの変更を評価するために異なるアプローチが必要です。同じマウス IVM と CEUS テクニックの併用は、血管系のさまざまなレベルでのインスリンの効果を定量化するための強力なツールを提供します。IVM は、直接可視化と抵抗動脈の定量分析でき CEUS インスリンによる筋血流の変化の評価のため。
内転筋コンパートメントを勉強していくつかの利点があります。動脈は、容易にアクセス可能と切開の表面的な性質はそれに実験が完了したら 5.0 滅菌縫合で皮膚切開を閉じるすることが可能。動物は、0.1 mg/kg の用量で鎮痛剤として、実験後ブプレノルフィンを皮下注射され、暖かい環境でリカバリできます。マウスは、非常によく手順を容認し、我々 は動物の損失も 35 を超える動物は勉強で後肢の感染症を経験します。これは、フォロー アップすることができます。 または縦断的方法で動物を研究します。しかし、これらの実験に使用される動物は 1.8% 吸入イソフルラン麻酔マスクが 0.4 L/分で流れる酸素とのバランスを使用して麻酔されました。イソフルラン麻酔41,42と対照をなして FMA 麻酔は末梢のインスリン感受性を妨害しません。今後の予定は、マウスが FMA 麻酔から回復する方法も研究することです。
内転筋のコンパートメントは、ローカル仲介各種血管作動性化合物からも便利と下流の血管の効果を評価することができます。たとえば、標的組織にこれらの化合物の局所塗布は superfusion 技術28手術操作や周囲の血管43薬剤溶出カフスの注入を使用して実行可能です。さらに、薄動脈を分離し、圧力の第 1 報で勉強できます。当社グループは、他の人がこの動脈前のヴィヴォ36,37,38.に及ぼすインスリンと他の血管作動性物質を文書化する圧力の第 1 報を使用して相当な実験的証拠を集めています。
IVM の技術の使用に固有の制限は筋肉の手術博覧会、船舶を安定させるためにパラフィン油のアプリケーション。これらの操作に影響を与える動脈のネイティブ環境かどうかは不明です。ただし、図 3 aは、パラフィン オイルを浴びて薄動脈のベースラインの直径が大きく変化しないことを示しています。鉱物油が正常濃度条件44から組織を保護する、酸素の拡散を阻害することも示されています。さらに、油は動脈の基準径の変化を減らすのに役立ちます。だからこそ、パラフィン オイルを使用し、少なくとも 30 分間準備休ませて掲げました。注記のうち、オイル- またはないオイルの代わりにバッファーに格納された生理食塩水の使用は-非常に可変直径および容器 (データは示されていない) を圧迫することで結果。また、実験の最後に、パラフィン オイルを浴びて - 薄動脈を分離し、圧力の第 1 報でその反応をテスト前のヴィヴォ。パラフィン オイルを浴びて動脈反応同様にインスリンとアセチルコリン (血管拡張薬) で刺激したときの動脈を制御する (データは示されていない)。一貫性のあるインスリン依存性血管拡張反応は明らかに本 IVM プロトコルは、信頼性の高い結果を生成することを示します。
同じマウスの両方の技術を適用することの利点は、他の手法の 1 つの本質的な制限の一部を克服: 妨げられていない筋肉、体内CEUS 見積もり MBV が、個々 の船舶を見ることができない;IVM では MBV を推定できないとはいえ、個々 の船舶を見ることが可能。将来計画は、CEUS 対側の内転筋の挙睾筋の組み合わせでの IVM 顕微鏡を利用することです。この変更は、(使用 CEUS) MBV と直接光 (IVM を使用して) 毛細血管への推定を提供できます。プロトコルをさらに変更することができます。尾カニューレの使用 4 ウェイ コネクタは、5 ウェイ コネクタに切り替えることができます。これにより、我々 は (ポイント 2.9 で説明) 2 番目 CEUS 測定を実行しながら麻酔チューブをデタッチを避けることができます。我々 の経験では、マウスは現在のプロトコルを忍しました。このプロトコルを作ることができるもう一つの変更は、使用されるインスリン クランプ速度です。超生理的と考えられている 7.5 の mU/kg/分クランプ速度を使いました。研究によって低いインスリン クランプ率 (たとえば 3 mU/kg/min) を使用できます。
我々 は信頼性の高い説明プロトコルを発見した、注意を必要とする特定の制限があります。血管径の計測が最適でない場合があります。準備の手順を実行すると、モデルといくつかの経験が必要です。船の邪魔し、別の 30 分間、動脈の残りをさせる必要がある、直径を変更、新しいオイルを継ぎ足すことに、容器環境からパラフィン オイルが漏れていないことが重要です。また、パラフィン油の表面に (プロトコルの 1.14 の手順で説明) 光の反射が明るすぎる、動脈を表示するのには難しくありました。これはパラフィン油面と動脈と平行に斜めに光が落ちるように光源を指揮して相殺することができます。
結論として、本 IVM CEUS 技術の組み合わせの場合、血管系のさまざまなレベルでのインスリンの効果の違いを定量化することが可能になります。薄動脈の IVM CEUS を用いて下流の微小血管血流に貢献する上流の血管の変化への洞察力を提供します。我々 はより同じマウスにおける実験技術のいくつかの組み合わせは血管の機能を評価する支持者します。

血糖値の上昇に対し、膵臓は血流がすぐに抵抗血管と毛細血管を介して、骨格筋などの標的臓器に分散にインスリンを分泌します。骨格筋は食後のグルコース取り込み1~ 80% を担当です。骨格筋の間質へのインスリンの配信は、律速段階のブドウ糖の処分2,3、4を促進インスリンの代謝活動に示されています。10-15 分以内は、インスリンは、毛細血管の血液量 (微小血管募集)、総血流量増加5,6前に発生する効果を増加します。微小血管募集栄養素 (とインスリン) の交換7,8で利用できる内皮表面領域を展開します。インスリンを介した血管募集の前に、独立して骨格筋糖取り込み8,9の変更に関連付けられています。インスリンの血管系に及ぼす影響は、'血管インスリン感受性」と呼ばれています。
インスリンを介した血管募集とインスリン依存性の血管拡張、肥満 Zucker ラット10,11で損なわれることが示されています。さらに、減らされた毛細血管密度と無駄のないマウスは、筋インスリン抵抗12を表示します。自分の影響力のある仕事、久保田らを示した血管内皮細胞におけるシグナル伝達障害のインスリン インスリン誘発微小採用で、約 4013によって骨格筋でのグルコース取り込みを減少の減少を引き起こした。血管機能のこれらの異常のみで発生しない筋肉、他の複数の組織や臓器、心臓などにも網膜や腎臓の14,,1516。これらの例と他の研究17,18,19,20インスリンの血管作用がインスリン抵抗性の (病態) 生理学で重要なメカニズムであることを示唆していると、合併症。
インスリンが微小血管の血液量 (MBV) 骨格筋5,6を増加する実質的な証拠がある、この問題が発生するメカニズムは完全に理解9ありません。内皮依存性血管拡張血管インスリン感度21,22,23血管系のさまざまなレベルでの多くの側面に不可欠です。血管のインスリン感受性でマニフェスト自体抵抗血管のインスリンによる弛緩、微小血管の灌流交換表面積7,24、増加する前毛細血管細動脈の緩和 25。
生体顕微鏡 (IVM) はさまざまなマウス28とハムスターの頬袋のマウス背部26、27のマウスおよびラットの腸間膜虚血肢のモデルの皮下脂肪のチャンバーを含むティッシュの準備で使用されています29. 造影超音波検査 (CEUS) は骨格筋31と同様、心臓30微小循環の評価ができる別のイメージング テクニック。Rheologically 赤血球として動作し血管の内腔内に完全に残る不活性ガス封入のマイクロバブルを使用しています。これらのマイクロバブルは、定常状態を達成するために一定の速度で静脈内に注入されます。高エネルギーの超音波を使用して、気泡を破壊すると、できます。マイクロバブルの補充速度領域 (ROI) では、流速 (MFV) を表します。コントラスト画像の全信号強度は、MBV を表します。CEUS は (人間) にも繰り返し実行することができ、(バレットらで説明したインスリン抵抗性の状態は、血管の機能不全の理解が進んだ32)。
現在の研究で筋灌流、IVM と CEUS の同時使用を規制を研究のための新しい技術について述べる。ここで、マウスの後肢筋内転筋コンパートメント内のインスリンの血管アクションに焦点を当てます。この区画は、代表的な筋肉ローカル糖代謝の研究を有効にするマウス最大の骨格筋肉グループのひとつです。この区画は、準備と動脈の可視化が容易にアクセスできる標準化された手術28IVM に最適です。また、私たち自身のグループとその他が、このコンパートメント33,34CEUS ことを示されています。
IVM と CEUS 術の利点は、大きい細動脈 (フィードまたは抵抗動脈) と同じ筋群における微小循環 (毛細血管ベッド) のレベルでのインスリンの効果を評価する可能性です。さらに、2 つのメソッドの同時アプリケーションは、抵抗血管の微小循環レベルでのインスリンの時空間行動に洞察力を提供します。これは IVM を組み合わせるし、CEUS 手法は他の血管生物学分野でも実装できます。たとえば、ノックアウト モデルを用いた様々 なタンパク質や血管内皮細胞に影響を与える特定の病態生理学的条件の役割を学ぶことができます。また、複数時点の時間と研究のコスト削減で 1 つのマウスで両方の方法を使用できます。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6</td>マウス <td>チャールズリバー</td><td></td><td>マウスは、自社</td></tr>製<tr><td>Vevo 2100高解像度超音波診断装置</td><td>VisualSonics inc.</td>で飼育しました。<td></td><td></td></tr><tr><td>MS250 非線形トランスデューサ</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100ソフトウェア</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超音波ゲル(アクアソニック100、無色)</td><td>CSPメディカル</td><td>133-1009</td>超音波<td>波を送信するために使用される超音波ゲル</td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td>VWR国際</td><td>58815-234</td><td></td></tr><tr><td>加熱パッド&nbsp;</td><td>Pantlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フリースタイル プレシジョン Xceed&nbsp;</td><td>アボット</td><td></td><td>高インスリン血症-真血糖クランプ中の血糖値を測定するには</td></tr><tr><td>インスリン ノボラピッド</td><td>ノボ ノルディスク</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルコース モノハイドレート&nbsp;</td><td>メルクミリポア</td><td>1083421000</td><td></td></tr><tr><td>緩衝生理食塩水</td><td>B.ブラウン</td><td>152118062</td><td></td></tr><tr><td>PE-20医療用チューブ</td>ベ<td>クトン、ディキンソンアンドカンパニー</td><td>427405</td><td></td></tr><tr><td>ニードル、27ゲージ&nbsp;</td><td>ベクトン・ディキンソン &Co</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>医療用テープ</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超音波プローブホルダー</td><td></td><td></td><td>自社製</td></tr><tr><td>綿棒</td><td></td><td></td><td>複数相当</td></tr><tr><td>クリームデピレーター</td><td></td><td></td><td>複数相当</td></tr><tr><td>ゲル組織接着剤</td><td>Derma+flex</td><td>GA30005-2222</td><td></td></tr><tr><td>輸液ポンプ</td><td>ハーバード装置</td>ハーバー<td>ド装置PHD2000</td><td></td></tr><tr><td>小型の細いまっすぐなはさみ</td><td>ファインサイエンスツール(FST)</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>ファインサイエンスツール(FST)</td><td>12500-12</td><td></td></tr>細い<tr><td>先端のストレート鉗子</td>ファイン<td>サイエンスツール(FST)</td><td>11251-20</td><td></td></tr>実<tr><td>体顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>カメラ</td><td>Basler</td><td>scA1390-17gc</td><td></td></tr><tr><td>イメージグラバープログラム</td><td>自社</td><td></td>製 <td>画像取得システム</td></tr><tr><td>タイマー</td><td>VWR</td><td>33501-418</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、1mL</td><td>フィッシャー</td><td>14-817-25</td><td></td></tr><tr><td>光源、光ファイバー</td><td>ショット</td><td>KL1500</td><td>理想的には調整可能なアームを持っています</td></tr><tr><td>パラフィンオイル</td><td></td><td></td><td>複数相当</td></tr><tr><td>名称</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Microbubbles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850365C</td><td></td></tr><tr><td>ポリオキシエチレンステアレート&nbsp;</td><td>&nbsp;Sigma</td><td>p3440</td><td></td></tr><tr><td>パーフルオロブタンガス&nbsp;</td><td>F2 Chemicals</td><td>C4F10(g)</td><td></td></tr><tr><td>Decon FS200 超音波浴&nbsp;</td><td>デコン超音波株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バイアルミックス&nbsp;</td><td>Lantheus Medical Imaging</td><td>515370-0810</td><td></td></tr><tr><td>マルチサイザー コールター カウンター</td><td>ベックマン コールター インク</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

インスリン依存性血管拡張や筋肉の血流を研究する生体顕微鏡観察とマウスの後肢の造影超音波検査

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

インスリンの血管アクションがインスリン感受性の調節に貢献することが実証されています。筋肉の血流のインシュリンの効果は、栄養素やホルモンのインシュリン敏感なティッシュへの配信食後を調節します。ここで生体顕微鏡 (IVM) と筋肉抵抗血管を同時に可視化するマウスの後肢筋内転筋コンパートメントおよび血流の造影超音波 (CEUS) を組み合わせるためのテクニックについて述べる、微小循環体内。同時に血管のツリーの複数のレベルでのインスリンの効果の評価は、インスリンの複数の血管作動性効果と筋血流との関係を研究することが重要です。本研究では実験はマウスで行われました。まず、麻酔、血管作動性化合物、超音波造影剤 (脂質でカプセル化されたマイクロバブル) の注入の尾静脈カニューレが挿入されます。第二に、小切開は内転筋コンパートメントの動脈のツリーを公開する鼠径部で行われました。超音波プローブに断面で筋肉を表示する対側上後肢で配置します。血管径の評価基準パラメーターを評価するために、マイクロバブル、筋血流と血管の血液量 (MBV) を推定する一定の速度で注入してその後。前に、応じて外因クランプの間に適用されると、IVM と CEUS の組み合わせは動脈径、微小血管筋灌流と全身のインスリン感受性インスリン誘発性変化の評価を許可します。さらに、微小循環の反応およびインスリン抵抗性動脈の時間的関係を定量化することができます。フォロー アップすることが可能、マウス縦の時間だ、血管や全身のインスリン感受性の変化を研究するための貴重なツールとなって

応じて外因クランプ (インスリン感受性) の中にグルコース注入率は 180.21 であった ± 19.81 µmol/kg/分船を安定させるために内転筋コンパートメントにパラフィン油のローカル アプリケーションは、ベースラインの平均直径を変更していません。動脈 (μ μ m ± 17.9 68.8; 対 29.0 ± 73.6p = 0.58) が、変化を減らす助け動物テスト (図 4 a)。インスリン一貫して薄動脈径 (14.58 ± 6.2% 増 60 分;N = 9) 大幅に異なるだった (p &lt; 0.0001) 生理食塩水注入による径変化から (-6.3 ± 4.9%;N = 6)。かなりインスリン依存性の血管拡張をした 10 分 (10.09 ± 5.1%;p = 0.002) し、30 分後、その緩慢な定員の約 95% に達した。
CEUS でインスリン一貫して筋 MBV (図 5 a) 33.5% 増 (± 31.04%、N = 7; p = 0.0009) 生理食塩水注入と比較されたとき (-10.63 ± 27.87%、N = 6) (図 5 b)。表示されるデータは、筋大腿血管に分割した MBV の信号強度です。これは、実験的変化 (データは示されていない) の別のマウスと異なる測定の間減少します。大腿血管の信号強度はマイクロバブル循環 (図 3) の濃度を直線的に対応しています。マイクロバブル使用 (図 3 D) の濃度の違いを理論的に大腿血管の信号を補正を修正します。データは、平均 ± 標準偏差、このセクションに掲載されています。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig1.jpg"> 図 1:、後肢の内転筋コンパートメントの手術博覧会。(A) を切開で、脚の付け根、鼠径靭帯の方向に平行。(B) 遠位方向 (黒矢印) に脂肪のパッドで穏やかなトラクション結合組織の脂肪パッドと腹壁の間 (*) が表示されます。(C) 皮膚切開のひだは、血管を浴び、パラフィン オイルを保持するために小さいキャビティを作成するブルドッグのクランプを使用して調整できます。校正の顕微鏡を使用して準備された薄動脈を表示した後、(D) 超音波プローブは対側の上部の後肢に配置されます。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig2.jpg"> 図 2:マウスの後肢の生体顕微鏡観察します。大腿動脈 (A) (B) 下腹壁動脈と内転筋群 (D) 経由で実行される薄動脈 (C) を生じさせる。薄動脈は、校正された顕微鏡を用いた IVM に使用されます。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig3.jpg"> 図 3:信号筋肉血管の血液量と大腿血管の造影超音波の強度。(A) 男性マウスの上側後肢でマイクロバブル持続注入中に画像表示デジタル イメージング プラットフォームのモード非線形コントラストのビュー。右側のパネル: 2 ・ ロワは、MBV の筋肉と大腿の血管を表すに描かれています。内転筋コンパートメントの表面的な部分のみ信号として投資収益率で強度は深さの減少します。左側のパネル: 筋肉 MBV ROI から時間強度曲線。垂直線は、高エネルギーの波とマイクロバブル (MBD) の破壊を表しています。直後、MBD に造影剤が徐々 に気泡を埋めるために開始する画像の面で存在しません。10-15 秒後コントラスト強調のピークに達しています。(B・D)2.5 x 109泡/mL の注入率が倍増した定常信号に達した後 (5, 10, 20 μ L/分)。信号強度から筋肉 MBV (B)、大腿血管 (C) 並列循環のマイクロバブル濃度の倍増します。(D) 訂正筋肉 MBV のため大腿血管の信号は異なるマイクロバブル濃度による信号強度変動を削除します (N = 9; - エラーバーは標準偏差を表す)。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig4.jpg"> 図 4:薄動脈の生体顕微鏡測定。(A) パラフィン油が安定した平均基準径 (68.8 ツオ対 73.6 μ m を維持しながら (油を適用した後は、パラフィン vs 17.9 μ m なし 29.0 μ m) の異なる動物の薄動脈の変化を低減p = 0.58)。(B) 動脈直径ベースライン時とインスリンまたは生理食塩水の輸液の 60 分後。60 分注入は一貫して薄動脈を拡張後インスリン (p &lt; 0.0001) 生理食塩水輸液と比較した場合。(C) インスリン依存性血管拡張反応は注入開始後 10 分で発生します (p = 0.002) 30 分誤差範囲を表す標準偏差での最大値の 95% に達すると独立スチューデントの T 検定は統計情報に使用されます。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig5.jpg"> 図 5:マウスの後肢筋内転筋コンパートメントの造影超音波による微小血管の血液体積測定。(A) インスリンは、インスリン注入開始後 MBV 30 分で一貫して増加につながった。(B)、応じてとベースライン測定 (MBV 変更) の違いは、インスリンを介した血管募集として示されます。インスリン誘発 33.5% (± 31.04%, p = 0.016;N = 7) 生理食塩水輸液と比較して血管の募集 (-10.63 ± 27.87%、N = 6)。誤差範囲を表す標準偏差;独立スチューデントの T 検定は統計情報に使用されます。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

インスリン依存性血管拡張筋の血流を調節するなり、微小血管表面積 (微小血管募集) 溶質の交換に使用できる血液と組織の間質の間。生体顕微鏡を組み合わせたと造影超音波検査は同時に大きな船と微小循環でインスリンの作用を評価するために提示体内。

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

この造影超音波検査と生体内顕微鏡法を組み合わせた全体的な目標は、筋肉抵抗性動脈の視覚化と、生体内での骨格筋の微小循環灌流の研究を同時に行うことです。この方法は、2型糖尿病と肥満の分野におけるインスリン感受性と臓器血流の調節に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。施術当日は、アルコール系溶液で手術部位や機器を消毒した後、10cmのPE20チューブに27ゲージの針を装着し、チューブを4方向コネクタに取り付けます。麻酔をかけたCD57 BL6雄マウスで絶食した20〜25グラムの尾静脈に針を挿入します。そして、組織接着ジェルを使用して針を皮膚組織に固定します。マウスを仰臥位に置き、耐熱性テープを使用して足を固定し、大腿上部を露出させます。股関節のわずかな外旋を使用して、膝を40〜60度の角度で後肢の前足に向け、大腿部の内転筋コンパートメントでの筋肉のストレッチを標準化します。脱毛クリームを使用して、鼠径部と大腿上部の部分の毛を両側から取り除き、湿った綿棒で抜け毛をすべて集めます。次に、マウスを10〜16倍の倍率で実体顕微鏡下に置き、鼠径靭帯に平行に2センチメートルの切開を行います(腹部の湾曲のすぐ外側)。皮膚切開部の配置を練習することが重要ですが、これは大腿周囲が漏れないように十分に小さく、血管系が見えるほど大きくカットする必要があります。ブルドッグクランプを使用して、切開部の遠位側に牽引力を加え、次に脂肪組織を腹壁から離剖し、出血を避けるためにパッドを直接解剖するのではなく、脂肪パッドを壁から遠位方向に穏やかに分離します。大腿動脈を特定し、血管をたどって上腹部動脈と下腹部動脈、筋肉と血管を覆う透明な深部筋膜まで下がります。鋭利な鉗子を使用して、筋膜を上に引っ張り、マイクロハサミで組織を切断します。次に、組織が乾燥するのを防ぐためにパラフィンオイルの200マイクロリットル滴で露出した筋肉を覆い、ブルドッグクランプを使用して切開部のこの皮膚のひだを配置し、血管を浸すオイルを保持するための小さな空洞を作ります。次に、グラシリス動脈がコンピューター画面上で16倍の倍率で垂直になるようにマウスを調整し、後肢から少なくとも20センチメートルのところに光源を配置して、光からの熱伝導を減らします。予め温めた超音波形質導入ゲルを上部対側後肢に塗布し、超音波プローブを大腿骨の長軸に垂直に配置します。超音波プローブの角度と方向を慎重に調整して、内転筋群の断面図を取得し、プローブの位置を安定させてベースライン測定と高インスリン測定で同じイメージング平面を維持するように注意します。超音波プローブの配置は、基礎測定と高インスリン血症測定のためにプローブを同じ位置に置いたマウスのすべてで、上後肢の同じ部分が研究されるように標準化する必要があります。超音波プローブを適切に配置し、測定のためにグラシリス動脈を成功裏に準備した後、マウスを30分間安定させます。30分間の安定化期間の後、ベースライン測定を行って続行します。グラシリス動脈のベースライン直径を測定して保存します。マイクロバブルは超音波装置のコントラストモードでしか見ることができないため、マイクロバブル評価のためにイメージングシステムに適切なパラメータを設定してください。焦点ゾーンの位置を関心領域の中心に水平にし、背景信号の計算用に 5 秒間のクリップを保存します。マイクロバブルを1ミリリットルあたり10〜9バブルの濃度の2.5倍にアドレスし、マイクロバブルの入ったバイアルを手動で振とうして均一な懸濁液を得る。尾静脈カニューレを介して毎分5マイクロリットルの速度でマイクロバブルの注入を開始し、注入チューブを振動する渦上に保持して、マイクロバブルの均一な懸濁液を維持します。5分間の連続注入後、マイクロバブル破壊機能を使用して、マイクロバブル注入開始時の5分と10分での気泡の時間強度曲線を生成します。尾静脈からの血糖値を5分ごとに評価します。ベースライン データを取得した後、尾カニューレを使用して高インスリン血症-正常血糖クランプを開始し、1 キログラムあたり 200 ミリユニットのインスリン ボーラスを投与します。毎分7.5ミリユニット/キログラムのインスリン注入を60分間連続的に維持します。.連続的な血糖値モニタリングは、前に示したように尾端から採取した血液滴で実行する必要があります。20%DEグルコースの可変注入を使用して、高血糖を維持します。.イメージングソフトウェアを使用して、高インスリン血症性正常血糖クランプの開始後、目的の時点でグラシリス動脈の直径を測定します。25 分後および / または 55 分後、2 回目の高インスリン血症造影超音波検査測定を開始し、麻酔ポートを使用してマイクロバブルを注入するために、それぞれ 30 分および / または 60 分で微小血管の血液量を監視します。これらのデータから明らかなように、パラフィンオイルを内転筋コンパートメントに局所的に塗布すると、動脈の平均ベースライン直径を変えることなく血管が安定し、試験した動物間のばらつきが減少します。インスリン注入は、生理食塩水注入によって誘発される直径の変化と比較して、グラシルス動脈の直径を一貫して増加させ、10 分後にはインスリン誘発性血管拡張が明らかになり、30 分後には最大拡張容量が約 95% になります。造影超音波検査を使用すると、インスリンは生理食塩水注入と比較して、筋肉微小血管の血液量を一貫して増加させます。大腿骨血管内の信号強度は、循環中のマイクロバブルの濃度に直線的に対応し、大腿骨血管の信号の調整により、使用されるマイクロバブルの濃度の違いを理論的に補正します。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2時間で完了できます。この手順を試みる際には、新たに調製した試薬とマイクロバブルを使用し、実験測定を行う前にマウスを連続麻酔で30分間安定させることを忘れないでください。この手順に続いて、新しい血管作用成分が血管系に及ぼす影響は何かなど、追加の質問に答えるために新薬をテストできます。その開発後、この技術は、血管生物学の分野の科学者が新しい治療法の影響とノルコマウスへの関心の変化を評価するための道を開きました。このビデオを見れば、生体内顕微鏡法と造影超音波検査を使用して、筋肉抵抗性動脈の直径を同時に研究する方法と、生体内でマウスの後肢の灌流を評価する方法について十分に理解できるはずです。

combined-intravital-microscopy-contrast-enhanced-ultrasonography

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Medicine

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学ぶマウス後肢の生体顕微鏡観察と造影超音波検査によるインスリン依存性血管拡張と筋肉血流の測定法。2型糖尿病と肥満におけるインスリン感受性と微小循環の関係を解明する。

インスリン依存性血管拡張や筋肉の血流を研究する生体顕微鏡観察とマウスの後肢の造影超音波検査

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