Name: リンパ球における解糖およびミトコンドリア呼吸を分析するために最適化されたプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学ぶ リンパ球の解糖およびミトコンドリア呼吸を測定する方法。マウス脾細胞やT細胞・B細胞を用いた細胞外フラックスアッセイにより、免疫代謝のリアルタイム解析が可能になります。

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著者は、支援と議論をしてくださったMichael N. Sack博士(National Heart, Lung, and Blood Institute)、B細胞単離プロトコルの最適化についてAnn Kimさん、顕微鏡検査の手伝いをいただいたJoseph Brzostowski博士、そして使用した動物のメンテナンスについてMirna Peñaさんに感謝します。この研究は、国立衛生研究所、国立アレルギー感染症研究所、および国立心臓・肺・血液研究所の学内研究プログラムの支援を受けました。

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。この記事のオープンアクセス料金は、Agilent Technologies によって提供されました。

我々が開発したプロトコルは、その後、解糖およびミトコンドリア呼吸性能の違いを評価するために種々の濃度で細胞外フラックス分析に使用した純粋な、生存リンパ球サブセットの効率的な分離を可能にしました。このプロトコルは、リンパ球のために特別に設計されており、このような低い基礎代謝活性、脆弱性、低周波数とこれらの細胞型に関連する特別な考慮事項に対処して、できないことは、アッセイプレートに付着されます。そのため、以前に公開されたプロトコル11,12に比べて、私たちの方法は、免疫学の分野で働く研究者のためのより便利で、より良い最適化されたガイドを提供しています。純粋な、生存細胞集団を得る最適なコンフルエンスで細胞をプレーティングし、各ウェル中のタンパク質濃度に外フラックスアッセイ測定を標準化するなど、このプロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。 私播種した細胞のnitial数は両方の光学顕微鏡により可視化することができ、また、タンパク質濃度の測定を用いて定量します。細胞数及びタンパク質濃度の間の線形相関は、タンパク質濃度が実際に異なるウェル間の細胞数の変化の影響を標準化する方法として使用することができることを確認しました。 タンパク質濃度にECARとOCR結果を標準化することにより、我々は示された、より低い細胞コンフルエンスにもかかわらず、いくつかの5×10 2.5個の細胞/ウェルのデータの品質を損なうことなく、ほとんどのアッセイで使用することができるように。しかし、細胞タイプおよびアッセイ間で変動し使用することができる細胞の下限。例えば、わずか5×10 1.25ような細胞は、B細胞OCR測定のために使用することができるが、さらに2.5×10 5細胞/ウェルを、同じ細胞型の解糖系の性能を評価するのに十分ではなかったです。したがって、限り、細胞数は、制限要因ではないとしてオーバーでメッキ約5×10 5リンパ球に相当する90％のコンフルエンスで、/ウェル、好ましいです。異なるサイズ-、先に活性化され、部分的に分化などの細胞に使用リンパ球を-されたときにさらなる最適化が必要になることがあります。以前に初代培養リンパ球を使用した場合に加え、死亡または瀕死の細胞はまた、測定されたタンパク質レベルに寄与することができるので、細胞数の指標としてのタンパク質濃度の信頼性を減少させる別の処理条件との間の細胞生存率の変化、があるかもしれません。このような場合には、細胞外フラックスアッセイを行う前に、フローサイトメトリーにより生細胞を選別するために役に立つかもしれません。 新たに単離された、高度に実行可能なリンパ球集団を使用して、我々のアッセイでは、我々は両方のOCRとECAR測定のための信頼性の高い機能的なデータを得ました。全ての細胞型は、ミトコンドリアストレス試験において同様に挙動しながら、細胞型間の著しい差がありました解糖負荷試験で観察されました。例えば、ナイーブT細胞の解糖系の性能は、脾細胞またはB細胞と比較して低く、それは、オリゴマイシンの添加によって変化しませんでした。この観察は、我々のプロトコルの有効性を確認し、以前に発表された研究7,30に沿ったものです。 結論として、私たちの方法は、細胞外フラックスアナライザーを用いてリンパ球の代謝活性を試験する効率的かつ便利な方法を提供し、それは代謝活性化の際に、免疫細胞の変化、細胞の分化や原因を探求する免疫学的研究の広い範囲で有用であることができますこのような感染症、自己免疫および血液学的悪性腫瘍などの疾患の表現型に。

抗原に対する免疫応答は、免疫活性化と免疫抑制との間にしっかりと規制のバランスです。免疫抑制は、単にこれらのイベントを阻害し、したがって、不要な免疫応答1-6を防止するのに重要であるのに対し、免疫活性化は、刺激に応答して急速な細胞増殖および遊走、ならびにサイトカイン産生、抗体分泌の増加食作用を駆動します。最近の研究は、直接リンクは、免疫細胞の活性化状態及び様々な代謝経路7の活性の間に存在することを示しています。免疫細胞は、オンとオフのエネルギー産生経路を切り替えることにより、休止および活性化状態の間でシフトすることができます。また、別の免疫細胞タイプの活性化の間に、それらの増加したエネルギー需要を燃料に異なる代謝戦略を使用し得ることが観察されています。例えば、Tリンパ球の活性化はほぼ完全解糖状態8に細胞を指示しながら</su&gt; pは、活性化Bリンパ球は、解糖および酸化的リン酸化9,10のバランスを使用します。これらの研究は、細胞の代謝に対する免疫細胞活性化の影響を調査することの重要性を指摘します。 リアルタイムでは、酸素消費速度（OCR）および細胞外酸性化率（ECAR）の同時測定は、酸化的リン酸化及び解糖の指標として、経路11から13を製造するエネルギーの状態に対処するための一般的な戦略です。これを達成するために、そのようなシーホースXF 96のような細胞外フラックス分析器は、日常的に使用されます。このような機器は急速に細胞タイプで、または異なる刺激条件にOCRとECARの変化を比較することができます。これまでに、免疫細胞を含む様々な細胞型は、これらのデバイスを使用して研究されています。しかし、特に免疫細胞のために設計され最適化されたプロトコルは使用できません。 免疫細胞、特にリンパ球は、OTとは異なりますいくつかの重要な方法で彼女の細胞型。リンパ球は、ex vivoでの条件14-16で長期間生存していない脆弱な細胞です。これは、例えば、細胞外フラックス解析において使用されるような必須栄養素を欠く次善の増殖培地中で培養しても大きな問題です。マクロファージおよび多くの細胞株とは異なり、リンパ球は、プラスチック表面に付着しません。したがって、ストレスを発生させることなく、分析プレートに添付することが重要です。最後に、いくつかのリンパ球亜集団は非常にまれであってもよく、必要に応じ、最適な量でそれらを収穫することは17-19挑戦的であるかもしれません。 ここでは、具体的には、リンパ球のために開発された最適化されたプロトコルを提供します。 、我々はdifferenにその休止状態の解糖および酸化的リン酸化の特性を示す20ノードマウスの脾臓およびリンパ節から単離した脾臓細胞、Bリンパ球およびナイーブCD4 + Tリンパ球を使用してT細胞密度。データは、細胞数に直接比例した端アッセイ細胞溶解物のタンパク質濃度を測定することにより、各ウェルについての最初の細胞数の違いを説明するために正規化しました。私たちのプロトコルは、細胞外フラックスアッセイのための実行可能なリンパ球の迅速な単離のためのガイドラインを提供するだけでなく、それはまた、データの品質を損なうことなく、次善の細胞濃度での作業を可能にします。

<table><tbody><tr><td>PBS (pH 7.2)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>20012-050</td><td>MACS緩衝液を作るには</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td>MACS緩衝液を作るには</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA、pH 8</td><td>Quality Biological</td><td>10128-446</td><td>MACS緩衝液を自動作るために</td></tr><tr><td>MACSすすぎ液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>PBS + EDTAの代わりにMS緩衝液を作るために。autoMACS Pro セパレータでも使用されます。</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11875-093</td><td>フェノールレッドとL-グルタミンを含む</td></tr><tr>ウ<td>シ胎児血清</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>10437-028</td><td>熱不活性化のために、冷凍ストックボトルを37°Cで解凍します。Cウォーターバスと56°Cで不活性化。Cで30分間。保存用の熱不活化血清(例:、50 mlコニカルチューブ内)を分注し、-20°Cで凍結します。必要になるまでC.&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (Pen Strep)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15140-122</td><td>Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (500 ml 培地を作成する場合は、合計 12 ml Pen Strep/L-Glut を作ります); アリコートを -20 °C に保ちます。メディアを作成する準備ができるまでC。</td></tr><tr><td>L-グルタミン 200 mM (L-Glut)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>25030-081</td><td>RF10 およびストレス試験媒体の成分</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム 100 mM</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td>RF10 およびストレス試験媒体の成分</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td>RF10</td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液の成分 (100x)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11140-050</td><td>RF10</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール (55 mM)</td> のコンポーネント<td>Gibco-ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>RF10</td></tr><tr><td>Falcon 70 &mu;m セルストレーナー</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>87712</td><td>細胞単離に使用</td></tr><tr><td>Monoject 3 ml シリンジ、ルアーロックチップ</td><td>Covidien</td><td>8881513934</td><td>細胞単離に使用</td></tr><tr><td>Falcon 15 ml 円錐形遠心チューブ&nbsp;</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>細胞単離に使用</td></tr><tr><td>Falcon 50 ml 円錐形遠心チューブ&nbsp;</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>細胞単離に使用</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>細胞単離に使用</td></tr><tr><td>CellTrics 30 &mu;m細胞フィルター、滅菌済み、シングルパック</td><td>Partec CellTrics</td><td>04-004-2326</td><td>細胞分離</td></tr><tr><td>に使用 B細胞分離キット、マウス</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-862</td><td>細胞分離に使用</td></tr><tr><td>Na&iuml;ve CD4+ T細胞分離キット、マウス</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-453</td><td>細胞分離に使用</td></tr><tr><td>LSカラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>細胞分離に使用</td></tr><tr><td>MidiMACSセパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>分離用マグネット</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>マグネット</td></tr><tr><td>用ホルダーautoMACSリンスソリューション</td><td></td><td>130-091-222</td><td>autoMACSプロセパレーターautoMACS</td></tr><tr><td>プロセパレーター機器</td>ミル<td>テニーバイオテック</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>2-デオキシ-D-グルコース(2-DG)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D8375-5G</td><td></td></tr><tr><td>セルタ</td><td>ックコーニング</td><td>354240</td><td>セル接着剤用すすぎ液。各ロットは異なるため、濃度に注意してください(パッケージは1 mgです)。</td></tr><tr><td>オリゴマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>2,4-ジノトロフェノール (2,4-DNP)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D198501</td><td></td></tr><tr><td>アンチマイシンA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td>100xカクテルとして提供され、RIPAと組み合わせて溶解用の1x溶液を形成します。</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td>製造元の指示に従って</td></tr>ください <tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>101085-004</td><td>アッセイプレート、カートリッジ、化合物をアッセイカートリッジに移すためのローディングガイド、およびキャリブラント溶液が含まれています。</td></tr><tr><td>タツノオトシゴXFの基盤の中型の</td><td>タツノオトシゴの生物科学</td><td>102353-100</td><td>を調製するのに使用されて 負荷試験媒体</td></tr><tr><td>タツノオトシゴXFe96細胞外磁束の検光子</td><td>タツノオトシゴの生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericupの生殖不能の真空フィルター ユニット、0.22 &mu;m</td><td>EMD Millipore-Fisher Scientific</td><td>SCGPU10RE</td><td>フィルターメディアの滅菌に使用されます。</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>487031</td><td>0.1 Mに溶解し、Cell-Takの希釈に使用しました。</td></tr></tbody></table>

リンパ球における解糖およびミトコンドリア呼吸を分析するために最適化されたプロトコル

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

リンパ球は、順番に急速な細胞増殖、遊走及び分化、およびサイトカイン産生をもたらす細胞内シグナル伝達経路を活性化することにより、種々の刺激に応答します。これらの事象の全てをしっかり細胞のエネルギー状態にリンクされ、したがって、エネルギー産生経路を研究することは、これらの細胞の全体的な機能に関する手がかりを与えることができます。細胞外フラックス分析器は、多くの細胞型における解糖およびミトコンドリア呼吸の性能を評価するために一般的に使用される装置です。このシステムは、いくつか公表された報告で免疫細胞を研究するために使用されてきた、まだ特にリンパ球用に最適化された包括的なプロトコルが欠けています。リンパ球は、ex vivoでの条件に乏しい生き残る脆弱な細胞です。しばしばリンパ球サブセットはまれであり、かつ低細胞数での作業は避けられません。したがって、これらの困難に対処する実験戦略が必要とされます。ここでは、プロトコルを提供しますそれは、リンパ組織から生存可能なリンパ球の迅速な単離を可能にし、細胞外フラックスアナライザーでそれらの代謝状態の分析のため。さらに、我々は、異なる細胞密度で、いくつかのリンパ球サブタイプの代謝活性を比較した実験の結果を提供します。これらの観察は、我々のプロトコルも低い細胞濃度で一貫性のある、よく標準化された結果を達成するために使用することができ、したがって、それは、免疫細胞における代謝イベントの特性に着目し、将来の研究において広範な用途を有し得ることを示唆しています。

代謝の研究は、免疫学の研究にますます関連性を持つようになっています。ここでは、マウス脾細胞、Tリンパ球、Bリンパ球における解糖系とミトコンドリア呼吸を測定するための最適化された方法を紹介します。

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

本手順の目的は、細胞外フラックスアッセイを用いて、リンパ球における解糖系およびミトコンドリア呼吸を正確に測定することです。この手法は、免疫細胞の活性化、分化、または疾患時にどのような代謝変化が起こるかなど、免疫代謝分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、一度に90サンプル以上の代謝プロファイルを効率的に、かつリアルタイムで分析できることです。この方法はリンパ球の代謝に関する知見を提供できますが、機能への影響を最小限に抑えてプレートへの添加が必要な非接着細胞を含む他の細胞にも適用可能です。一般的に、この方法に不慣れな方は、リンパ球が脆弱であり、機能性と生存率を維持するために慎重な取り扱いが必要であるため、習得に苦労することがあります。実験の前日に、細胞外フラックスアナライザーのセンサーカートリッジを持ち上げ、ユーティリティプレートの各ウェルに200 µLのキャリブラント溶液を満たしてください。次に、カートリッジをプレートに下ろし、センサーをキャリブラント溶液に浸し、二酸化炭素または窒素を含まない37 °Cのインキュベーターで一晩インキュベートします。翌朝、96ウェルアッセイプレートの各ウェルに25 µLの接着剤溶液をコートし、室温で20分間インキュベートします。インキュベーション終了後、接着剤を吸引し、各ウェルを200 µLの滅菌水で2回洗浄します。プレートを自然乾燥させている間に、70 µmのセルストレーナーを50 mLコニカルチューブにセットし、採取した臓器をストレーナー上に移します。滅菌済み3 mLシリンジのプランジャーを使用して組織をストレーナー越しにすり潰します。その際、必要に応じてMSバッファーを添加し、磨砕プロセスを通じてフィルターと臓器を湿った状態に保ってください。次に、ストレーナーを5〜10 mLのMSバッファーで洗浄し、得られた細胞懸濁液を遠心分離します。ペレットを5 mLのACK赤血球溶解バッファーで再懸濁させます。氷上で5分間静置した後、10～20 mLのMSバッファーを加えて希釈し、細胞を再度遠心分離します。遠心分離の終了後、15 mLコニカルチューブの上に30 µmのセルストレーナーを配置し、1 mLのMSバッファーでストレーナーをプライミングします。細胞を5 mLの新鮮なMSバッファーに再懸濁し、細胞懸濁液をストレーナーでろ過して、溶血した赤血球の凝集物を取り除きます。新鮮なMSバッファーを4 mL加え、空の溶解チューブを洗浄し、その洗浄液をストレーナーに通します。細胞数を計測し、細胞外フラックスアッセイに適した数の脾細胞を分注します。次に、両方の細胞セットをペレット化し、細胞外フラックスアッセイ用の脾細胞サンプルを、氷上で5 mLのRF 10培地を用いて再懸濁します。ビーズ分離用の細胞は、適切な量のビオチン抗体カクテル、抗ビオチンマイクロビーズ、およびMSバッファーを用いて再懸濁し、2～8 °Cで指定された時間インキュベートします。2回目のインキュベーション終了後、遠心分離により細胞を回収し、1 × 10⁸個の細胞あたり500 µLの新鮮なMSバッファーでペレットを再懸濁します。次に、適切なカラムを分離用マグネットにセットし、3 mLのMSバッファーでカラムをプライミングし、フロースルーを捨てます。カラムの下に滅菌済みの15 mLコニカルチューブを配置し、細胞サンプルの全量をカラムにロードします。その後、細胞培養チューブを3 mLの新しいMSバッファーで洗浄し、洗浄液をコニカルチューブに回収します。最後の溶出液を回収した後、チューブにMSバッファーを加えて最終容量を15 millilitersにし、ネガティブセレクションした細胞を遠心分離します。次に、氷上で5 millilitersの新鮮なRF 10培地を用いてペレットを再懸濁します。分離から3時間以内にすべての細胞サンプルを遠心分離し、ペレットを5 millilitersの適切なアッセイ培地に再懸濁してから、再度遠心分離を行います。2回目の遠心分離後、新鮮なアッセイ培地を用いて、1ウェルあたり最終的に180 µLの細胞量となるよう、適切な実験濃度でペレットを再懸濁し、プレートの各ウェルに細胞懸濁液を180 µLずつ播種します。細胞を37 °Cで25分間インキュベートします。その後、プレートを遠心分離して細胞をウェルの底にしっかりと接着させ、プレートをインキュベーターに戻します。30分後、マイクロピペットを用いて、37 °Cに調製した目的化合物を extracellular flux analyzer センサーカートリッジの適切なインジェクターポートに注入し、コントロールのバックグラウンド用および非実験用のポートには培地のみを注入します。注入したカートリッジをインキュベーターに戻し、extracellular flux アッセイプログラムを設定します。その後、カートリッジをロードしてプログラムを開始し、プロンプトに従い、キャリブレーション後にキャリブレーションプレートをアッセイプレートに交換してください。細胞外フラックスアッセイの後、タンパク質量の測定に進みます。すべての細胞集団の90%以上が生存しており、リンパ球については98%から99%の純度が観察されました。各細胞型のコンフルエンスは、初期の播種密度と相関しています。ライセート中のタンパク質濃度は播種密度と線形に相関しており、タンパク質濃度を用いて細胞外フラックスデータを正確に標準化できることが確認されました。細胞数が多いほど、測定される酸素消費率が高くなり、ミトコンドリア阻害剤に対する反応もより顕著になります。T細胞および脾細胞では、播種密度が高くても標準化後の酸素消費率の測定値は同等でしたが、B細胞では、1ウェルあたり5×10⁵個および1.25×10⁵個の細胞で同等の標準化酸素消費率が測定されました。ミトコンドリア呼吸パラメータもまた、播種密度と線形に相関します。さらに、プロトンリークが低いことは、ベースライン呼吸の大部分がATP合成に利用されていることを示しています。播種密度が高くなると、細胞外酸性化速度が高まり、ミトコンドリア阻害剤に対する反応が大きくなります。糖新生のパラメーターは細胞の播種密度と線形に相関しており、糖新生ストレスアッセイを成功させるには高い播種密度が最適であることが判明しています。グルコースはミトコンドリア呼吸をわずかに刺激しますが、これはオリゴマイシンによって抑制される一方で、2-DGは酸素消費量に有意な影響を与えません。この手法を習得すれば、適切に実施することで6時間から8時間で完了させることができます。この手順を行う際は、細胞外フラックス解析の前に細胞を氷上で保持すること、および細胞数を正確に計測して播種することが重要です。この手順に続き、ミトコンドリア電位の測定やグルコース取り込みの測定などの他の手法を実施することで、細胞の代謝状態に関するさらなる疑問を解消させることができます。このビデオを視聴することで、リンパ球の分離方法および細胞外フラックスアッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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リンパ球における解糖およびミトコンドリア呼吸を分析するために最適化されたプロトコル

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