リンパ球における解糖およびミトコンドリア呼吸を分析するために最適化されたプロトコル

本手順の目的は、細胞外フラックスアッセイを用いて、リンパ球における解糖系およびミトコンドリア呼吸を正確に測定することです。この手法は、免疫細胞の活性化、分化、または疾患時にどのような代謝変化が起こるかなど、免疫代謝分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、一度に90サンプル以上の代謝プロファイルを効率的に、かつリアルタイムで分析できることです。

この方法はリンパ球の代謝に関する知見を提供できますが、機能への影響を最小限に抑えてプレートへの添加が必要な非接着細胞を含む他の細胞にも適用可能です。一般的に、この方法に不慣れな方は、リンパ球が脆弱であり、機能性と生存率を維持するために慎重な取り扱いが必要であるため、習得に苦労することがあります。実験の前日に、細胞外フラックスアナライザーのセンサーカートリッジを持ち上げ、ユーティリティプレートの各ウェルに200 µLのキャリブラント溶液を満たしてください。

次に、カートリッジをプレートに下ろし、センサーをキャリブラント溶液に浸し、二酸化炭素または窒素を含まない37 °Cのインキュベーターで一晩インキュベートします。翌朝、96ウェルアッセイプレートの各ウェルに25 µLの接着剤溶液をコートし、室温で20分間インキュベートします。インキュベーション終了後、接着剤を吸引し、各ウェルを200 µLの滅菌水で2回洗浄します。

プレートを自然乾燥させている間に、70 µmのセルストレーナーを50 mLコニカルチューブにセットし、採取した臓器をストレーナー上に移します。滅菌済み3 mLシリンジのプランジャーを使用して組織をストレーナー越しにすり潰します。その際、必要に応じてMSバッファーを添加し、磨砕プロセスを通じてフィルターと臓器を湿った状態に保ってください。次に、ストレーナーを5〜10 mLのMSバッファーで洗浄し、得られた細胞懸濁液を遠心分離します。

ペレットを5 mLのACK赤血球溶解バッファーで再懸濁させます。氷上で5分間静置した後、10～20 mLのMSバッファーを加えて希釈し、細胞を再度遠心分離します。遠心分離の終了後、15 mLコニカルチューブの上に30 µmのセルストレーナーを配置し、1 mLのMSバッファーでストレーナーをプライミングします。

細胞を5 mLの新鮮なMSバッファーに再懸濁し、細胞懸濁液をストレーナーでろ過して、溶血した赤血球の凝集物を取り除きます。新鮮なMSバッファーを4 mL加え、空の溶解チューブを洗浄し、その洗浄液をストレーナーに通します。細胞数を計測し、細胞外フラックスアッセイに適した数の脾細胞を分注します。

次に、両方の細胞セットをペレット化し、細胞外フラックスアッセイ用の脾細胞サンプルを、氷上で5 mLのRF 10培地を用いて再懸濁します。ビーズ分離用の細胞は、適切な量のビオチン抗体カクテル、抗ビオチンマイクロビーズ、およびMSバッファーを用いて再懸濁し、2～8 °Cで指定された時間インキュベートします。2回目のインキュベーション終了後、遠心分離により細胞を回収し、1 × 10⁸個の細胞あたり500 µLの新鮮なMSバッファーでペレットを再懸濁します。

次に、適切なカラムを分離用マグネットにセットし、3 mLのMSバッファーでカラムをプライミングし、フロースルーを捨てます。カラムの下に滅菌済みの15 mLコニカルチューブを配置し、細胞サンプルの全量をカラムにロードします。その後、細胞培養チューブを3 mLの新しいMSバッファーで洗浄し、洗浄液をコニカルチューブに回収します。

最後の溶出液を回収した後、チューブにMSバッファーを加えて最終容量を15 millilitersにし、ネガティブセレクションした細胞を遠心分離します。次に、氷上で5 millilitersの新鮮なRF 10培地を用いてペレットを再懸濁します。分離から3時間以内にすべての細胞サンプルを遠心分離し、ペレットを5 millilitersの適切なアッセイ培地に再懸濁してから、再度遠心分離を行います。

2回目の遠心分離後、新鮮なアッセイ培地を用いて、1ウェルあたり最終的に180 µLの細胞量となるよう、適切な実験濃度でペレットを再懸濁し、プレートの各ウェルに細胞懸濁液を180 µLずつ播種します。細胞を37 °Cで25分間インキュベートします。その後、プレートを遠心分離して細胞をウェルの底にしっかりと接着させ、プレートをインキュベーターに戻します。

30分後、マイクロピペットを用いて、37 °Cに調製した目的化合物を extracellular flux analyzer センサーカートリッジの適切なインジェクターポートに注入し、コントロールのバックグラウンド用および非実験用のポートには培地のみを注入します。注入したカートリッジをインキュベーターに戻し、extracellular flux アッセイプログラムを設定します。その後、カートリッジをロードしてプログラムを開始し、プロンプトに従い、キャリブレーション後にキャリブレーションプレートをアッセイプレートに交換してください。

細胞外フラックスアッセイの後、タンパク質量の測定に進みます。すべての細胞集団の90%以上が生存しており、リンパ球については98%から99%の純度が観察されました。各細胞型のコンフルエンスは、初期の播種密度と相関しています。

ライセート中のタンパク質濃度は播種密度と線形に相関しており、タンパク質濃度を用いて細胞外フラックスデータを正確に標準化できることが確認されました。細胞数が多いほど、測定される酸素消費率が高くなり、ミトコンドリア阻害剤に対する反応もより顕著になります。T細胞および脾細胞では、播種密度が高くても標準化後の酸素消費率の測定値は同等でしたが、B細胞では、1ウェルあたり5×10⁵個および1.25×10⁵個の細胞で同等の標準化酸素消費率が測定されました。

ミトコンドリア呼吸パラメータもまた、播種密度と線形に相関します。さらに、プロトンリークが低いことは、ベースライン呼吸の大部分がATP合成に利用されていることを示しています。播種密度が高くなると、細胞外酸性化速度が高まり、ミトコンドリア阻害剤に対する反応が大きくなります。

糖新生のパラメーターは細胞の播種密度と線形に相関しており、糖新生ストレスアッセイを成功させるには高い播種密度が最適であることが判明しています。グルコースはミトコンドリア呼吸をわずかに刺激しますが、これはオリゴマイシンによって抑制される一方で、2-DGは酸素消費量に有意な影響を与えません。この手法を習得すれば、適切に実施することで6時間から8時間で完了させることができます。

この手順を行う際は、細胞外フラックス解析の前に細胞を氷上で保持すること、および細胞数を正確に計測して播種することが重要です。この手順に続き、ミトコンドリア電位の測定やグルコース取り込みの測定などの他の手法を実施することで、細胞の代謝状態に関するさらなる疑問を解消させることができます。このビデオを視聴することで、リンパ球の分離方法および細胞外フラックスアッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。