ひずみ促進アジド - アルキン環付加することにより、効率的で部位特異的抗体ラベリング

この手順の全体的な目標は、アジド含有アミノ酸を遺伝的に組み込むことにより、抗体フラグメントに化学プローブを部位特異的に導入することです。この方法は、タンパク質修飾、工学、標識などのケミカルバイオロジー分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、簡単な混合で標的プローブまたはブロスをタンパク質または抗体に部位特異的に導入できることです。

プラスミドを構築した後、1マイクロリットルあたり8細胞の2倍10倍の濃度で大腸菌DH10-β株の20マイクロリットルにそれぞれ1マイクロリットルを1.5ミリリットルの遠心分離チューブに加えます。ピペットを使用して溶液を穏やかに混合します。次に、20マイクロリットルの混合溶液をきれいなキュベットに入れます。

エレクトロポレーションマシンを25マイクロファラッドと2.5キロボルトに設定します。次に、キュベットをショッキングチャンバーのスライドに挿入します。キュベットがチャンバー電極にしっかりと接触するまで、スライドをチャンバーに押し込みます。

エレクトロポレーションマシンがビープ音を鳴らすまで、パルスボタンを1回押します。この後、1ミリリットルのSOC培地をキュベットにすばやく追加します。次に、混合物を試験管に移します。

37°Cで振とうしながら1時間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、形質転換した大腸菌細胞を、適切な抗生物質を含む溶解ブロス寒天プレートに広げます。プレートを摂氏37度で12時間インキュベー

プレートインキュベーションが完了したら、抗生物質を含む5ミリリットルのLB培地に単一の形質転換コロニーを接種します。摂氏37度で12時間振とうしながらインキュベートします。次に、一次培養物を1ミリリットルあたり100マイクログラムのアンピシリンと1ミリモルAFを含む200ミリリットルのLB培地に移します。37°Cで振とうしながら少なくとも3時間インキュベートします。

培養物が550ナノメートルで0.8の光学密度に達したときに、1.6モルのアラビノースを2ミリリットル追加します。その後、摂氏30度で12時間振とうしながらインキュベートします。インキュベーションが完了したら、11, 000倍gで5分間遠心分離して細胞を回収します。

上澄みを捨て、ペレットをマイナス20°Cで凍結します。細胞を溶解する準備ができたら、新鮮な遠心チューブ内の20ミリリットルのパラプラズム溶解バッファーにペレットを再懸濁します。混合物を摂氏37度で1時間インキュベートします。

次に、細胞溶解物を18,000倍gで4°Cで15分間遠心分離する。上清を新しいチューブに移し、ペレットを捨てます。次に、400マイクロリットルのNi-NTA樹脂懸濁液を追加します。

ローテーターを使用して、チューブを摂氏4度で1時間静かに攪拌します。混合が完了したら、懸濁液をポリプロピレンカラムに注ぎます。レジンを5ミリリットルのウォッシュバッファーで3回洗浄します。

300 μLの溶出バッファーで標的抗体を溶出します。この後、テキストプロトコルに概説されているように、変異タンパク質の濃度を決定します。まず、10ミリモルのリン酸二塩基性ナトリウムと100ミリモルの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液に、HerFab-L177AFの10マイクロリットル溶液を10マイクロリットルを新鮮な遠心分離チューブに加えます。

次に、Cy 5.5アザジベンゾシクロオクチンの200マイクロモル溶液を20マイクロリットル水に加えます。この後、反応容器をアルミホイルで覆います。染色促進環状化反応を摂氏37度で6時間進行させます。

反応が完了したら、30マイクロリットルのサンプルと450マイクロリットルのリン酸緩衝液を加えて、遠心フィルタースピンカラムで遊離Cy 5.5色素を洗浄します。スピンカラムを14, 000倍gで摂氏4度で15分間遠心分離します。フロースルーを廃棄し、精製したサンプルを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。

精製したラベル付きHerFabは、分析の準備ができていない限り、摂氏4度で保存してください。まず、13マイクロリットルの7.8マイクロモル精製HerFabを新しいチューブに加えます。次に、5マイクロリットルのLDSタンパク質サンプルバッファーを追加します。

混合物を摂氏95度で10分間インキュベートします。インキュベーション後、4〜12%Bis-Tris SDS-PAGEゲルカセットを電気泳動セルに取り付けます。ランニングバッファを追加します。

次に、標識タンパク質サンプルを染色済み分子量メーカーにロードします。200ボルトで35分間ゲル電気泳動を行います。電気泳動が完了したら、ゲルをゲルドキュメンテーションおよび分析システムに移します。

Cy 5.5をスキャンし、市販のタンパク質染色剤でゲルを染色します。この研究では、抗体フラグメントHer-Fabは、アジド含有アミノ酸をフラグメントに組み込み、次いで変異抗体フラグメントを歪んだシクロオクチンと反応させることによって、部位特異的に結合しています。SDS-PAGE解析は、アジド含有アミノ酸の有無にかかわらず発現する変異タンパク質に対して行われます。

見てわかるように、完全長抗体断片は、アミノ酸の存在下でのみ得られた。このアミノ酸を含む抗体は、Cy 5.5結合アザジベンゾシクロオクチン誘導体Cy 5.5との反応による結合を評価し、SDS-PAGEで分析します。蛍光画像は、変異抗体フラグメントとCy 5.5との結合を示していますが、コントロールでは標識は観察されませんでした。

適切に発現し、アセチルフェニルアラニンでタンパク質を精製すると、タンパク質は株を含むプローブで効率的に標識できます 標識反応は追加の試薬を必要としないため、プローブをタンパク質と混合するだけでプローブを標的タンパク質に導入できます。このビデオを見れば、アジド含有アミノ酸を遺伝的に組み込むことにより、抗体フラグメントに化学プローブを部位特異的に導入する方法を十分に理解できるはずです。