Name: ひずみ促進アジド - アルキン環付加することにより、効率的で部位特異的抗体ラベリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学ぶ アジド含有アミノ酸を遺伝的に組み込み、SPAAC反応で抗体断片への部位特異的プローブ導入を行う方法。E. coliを用いた発現と精製、蛍光標識による解析技術を含む。タンパク質修飾研究に応用可能。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1.プラスミド構築<ol><li>彼の6タグを有する標的抗体遺伝子（のpBAD-HerFab-WT）を発現し、アンバーコドン（TAG）とロイシン-177のコドンに代わる発現プラスミド（のpBAD-HerFab-L177TAG）を構築27、使用して従来の部位特異的変異誘発技術。 材料の表を参照してください。 </li><li>進化したtRNA TyrおよびアミノアシルtRNA合成酵素（aaRS）ペアの遺伝子を含む別の発現プラスミド（pEVOL-AFRS）を構築します。 UAAsの効率的な取り込みのために、特別に設計されたプラスミドベクター、pEVOLを使用してください。詳細プラスミド情報およびクローニングプロトコルは、以前の報告書に記載されています。 28 </li><li>市販のプラスミド調製キットを用いて高品質のプラスミドDNAを得ました。 〜1.8の260/280比は、精製されたDNAに最適です。必要であれば、DNAの純度を確認するために1％アガロースゲル電気泳動を行います。 </li></ol><ol><li> エレクトロポレーション <ol><li> 20μL 大腸菌 DH10β株にpEVOL-AFRS 28とのpBAD-HerFab-L177TAGの各1μLのDNAを追加します。ピペットを用いて、穏やかに混合します。プラスミドは、一緒にまたは独立した反応で形質転換することができます。 </li><li> 0.1センチメートルキュベットについては、25μFと2.5 kVでのエレクトロポレーションの設定を行います。 </li><li>衝撃的なチャンバーのスライドにキュベットを挿入します。キュベットは、チャンバ電極としっかり接触するまでチャンバー内にスライドを押してください。 </li><li>エレクトロポレーションマシンのビープ音まで、パルスボタンを押すことで、一度パルス。 </li><li>カタボライト抑制（SOC）培地は、酵母エキス、10mMの塩化ナトリウム、2.5mMの塩化カリウム（w / v）のトリプトン、0.5％（w / v）の、10mMのMgCl 2を2重量％含有する1mLの超最適ブロス、及び20mMのグルコースを追加キュベットへの迅速かつ試験管に混合物を移します。振盪しながら37℃で1時間、細胞をインキュベートします。</li><li> （pEVOL-AFRSそれぞれのpBAD-HerFab-L177TAGを、選択するための35μgの/ mLクロラムフェニコールおよび100μg/ mLのアンピシリン）適切な抗生物質を含む寒天プレートLB培地（LB）のスプレッド形質転換された大腸菌細胞 。 12時間37℃で培養します。 </li></ol></li><li> 文化の準備 <ol><li>抗生物質を含有する5mLのLB培地に単一形質転換コロニーを接種します。振盪しながら37℃で12時間インキュベートします。 </li></ol></li></ol> HerFab-L177AFの3発現および精製<ol><li> HerFab-L177AFの発現 <ol><li>振盪しながら37℃でインキュベートし、アンピシリン（100μg/ ml）およびAF（1ミリモル）を含有する200mLのLB培地の中に初代培養物（5ml）に移します。 注：100mMのAFストック溶液（10mL）を100mM塩酸（10mLの最終体積）に206 mgのAFを溶解することによって調製しました。 </li><li> （16を1.6 Mアラビノースの2 mLを加え培養物が対数期（OD 550 = 0.8、OD =光学密度）に達するmMの最終濃度）。振盪しながら30℃で12時間インキュベートします。 </li><li> 5分間、11,000×gで遠心分離によって細胞を回収します。上清を捨て、-20℃でペレットを凍結します。 </li></ol></li><li> 細胞溶解 <ol><li> 30 mMトリス（pHは8.0）、1mMのEDTA、20％スクロース、および0.2 mg / mlでリゾチームを含む20mLのペリプラズム溶解用緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁し、そして37℃で1時間混合物をインキュベートします。 </li><li> 15分間4℃で18,000×gで細胞溶解物を遠心。上清を新しいチューブに移し、ペレットを捨てます。 </li></ol></li><li> Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィー <ol><li>各遠心分離管（200 mLの培養のための400μL樹脂）へのNi-NTA樹脂懸濁液を追加し、4℃で1時間穏やかに混合します。 </li><li>ポリプロピレンカラムにサスペンションを注ぎ、5 mLの洗浄府で樹脂を3回洗浄fferの50mMのNaH 2 PO 4（pH8.0）で、20 mMイミダゾール、および300 mMのNaClを含みます。 </li><li> 50mMのNaH 2 PO 4（pHは8.0）、250 mMイミダゾール、および300 mMのNaClを含有する300μLの溶出緩衝液を用いて目的とする抗体を溶出させます。 </li><li> Bradfordタンパク質アッセイ29によって、または280nmでの吸光度を測定することにより変異体タンパク質の濃度を決定します。吸光係数（2471 M -1 cm -1 で ）AF用を使用して、タンパク質の吸光係数の計算により280 nmでHerFab-L177AFの吸光係数（75866 M -1センチ-1）を計算します。 注：HerFabのアミノ酸配列は、NCBIのウェブサイトで見つけることができます（GI：783282791とGI：783282792）。 </li></ol></li></ol>ひずみ促進アジド - アルキン付加環を使用してアルキンプローブを用いて精製したHerFab-L177AFの4コンジュゲート（SPAAC） <ol><li> （H 2 Oで200のCy5.5-Azadibenzocyclooctyne（のCy5.5-ADIBO）の20μLを追加します。81; 10mMののNa 2 HPO 4（pH7.0）に100mMのNaClを含むリン酸緩衝液中HerFab-L177AFの10μL（最終濃度10μM）の溶液にM最終濃度）。 注：代替、ジフルオロシクロオクチン（DIFO）およびビシクロ[6.1.0]ノニン（BCN）誘導体も、同じアプリケーションで使用できます。 </li><li>歪み促進付加環化反応は、37℃で6時間進行させます。感光性プローブ（ 例えば、Cy5.5の）が使用される場合、アルミニウム箔で反応容器を覆います。 </li><li>ステップ5に従って標識HerFabを精製します。 </li></ol>標識HerFab 5.精製<ol><li>遠心分離フィルタースピンカラムにサンプルの500μLを追加します。 </li><li> 15分間、4℃、14,000×gでスピンカラムを遠心します。 </li><li>フロースルーを捨て、1.5 mlのマイクロ遠心チューブにスピンカラムから精製されたサンプルを転送します。 </li><li> 5.3 5.1-ステップに代わるものとして、purificaを行います同緩衝液に対して透析することによりる。 </li><li> 4℃で精製し、標識HerFabを保管してください。 </li></ol>標識HerFabの6 SDS-PAGE分析<ol><li> 106 mMトリス・塩酸、141 mMのトリス塩基（pHは8.5）、2％LDS、10％グリセロール、0.51 mMのEDTA、0.22 mMのSERVAブルーG250、および13μLに赤の0.175 mMのフェノールを含む5μLLDSタンパク質サンプルバッファーを追加します。 2μLのジチオスレイトール（DTT、100mMの最終濃度）の（ - ）の存在（+）または非存在下で標識されたHerFab（7.8μMまたは0.38ミリグラム/ mL）を精製しました。 10分間95℃で混合物をインキュベートします。 </li><li>電気泳動セルに4〜12％のBis-Tris SDS-PAGEゲルカセットを取り付け、バッファを実行して追加します。共役タンパク質試料と前染色分子量マーカーをロードします。 200 Vで35分間電気泳動を行います 注：蛍光体の光退色を最小限にするために全期間の間、暗闇の中での電気泳動セルを保管してください。 </li><li>電気泳動後、転送蛍光ゲルスキャナーにゲル、および適切な波長での蛍光発光をスキャン。 Cy5.5のために、スキャナソフトウェアでCy5のモードを使用します。 </li><li>市販のタンパク質染色でゲルを染色。 </li></ol>

<ol><li>Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).</li>
<li>Wu, X., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+at+the+interface+of+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis at the interface of chemistry and biology.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).</li>
<li>Liu, C. C., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+new+chemistries+to+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Adding new chemistries to the genetic code.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).</li>
<li>Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+the+keto+functional+groupto+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli.</a> proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).</li>
<li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+p-azido-L-phenylalanine+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli.</a> J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li>
<li>Deiters, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+incorporation+of+an+alkyne+into+proteins+in+Esshcerichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).</li>
<li>Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+copper-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded copper-free click chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).</li>
<li>Seitchik, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+tetrazine+amino+acid+directs+rapid+site-specific+in+vivo+bioorthogonal+ligation+with+transcyclooctenes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).</li>
<li>Lee, Y. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+acrylamide+fuctionality%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded acrylamide fuctionality.</a> ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).</li>
<li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+norbornene+directs+site-specific+cellular+protein+labelling+via+a+rapid+bioorthogonal+raction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction.</a> Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).</li>
<li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+encoding+of+bicyclononynes+and+trans-cyclooctenes+for+site-specific+protein+labeling+in+vitro+and+in+live+mammalian+cells+via+rapid+fluorogenic+Diels-Alder+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).</li>
<li>Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Cu-free+click+chemistry+with+readily+synthesized+biarylazacyclooctynones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).</li>
<li>Debets, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azadibenzocyclooctynes+for+fast+and+efficient+enzyme+PEGylation+via+copper-free+%283+%2B+2%29+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition.</a> Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).</li>
<li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mechanism+to+mouse%3A+a+tale+of+two+bioorthogonal+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions.</a> Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).</li>
<li>Debets, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugation+with+strained+alkenes+and+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Bioconjugation with strained alkenes and alkynes.</a> Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).</li>
<li>Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-promoted+alkyne%E2%88%92azide+cycloadditions+%28SPAAC%29+reveal+new+features+of+glycoconjugate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis.</a> ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).</li>
<li>Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+functionalization+using+catalyst-free+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).</li>
<li>Yao, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorophore+targeting+to+cellular+proteins+via+enzymemediated+azide+ligation+and+strain-promoted+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).</li>
<li>Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+bioorthogonal+functionalities+into+proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells.</a> Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).</li>
<li>Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residue+choice+defines+efficiency+and+influence+of+bioorthogonal+protein+modification+via+genetically+encoded+strain+promoted+Click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry.</a> Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).</li>
<li>Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-drug+conjugates%3A+an+emerging+concept+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).</li>
<li>Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+staudinger+modification+of+proteins+containing+p-Azidophenylalanine%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine.</a> ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).</li>
<li>Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+and+efficient+method+for+the+site-specific+dual-labeling+of+proteins+for+single+molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).</li>
<li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+strategies+for+single-molecule+protein+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Click strategies for single-molecule protein fluorescence.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).</li>
<li>Jang, S., Sachin, K., Lee, hJ., Kim, D. W., Lee, hS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+method+for+protein+conjugation+by+copper-free+click+reaction+and+its+application+to+antibody-free+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis.</a> Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).</li>
<li>Kazane, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+antibody+multimers+through+peptide+nucleic+acid+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).</li>
<li>Ko, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+site-specific+antibody+labeling+by+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Korean+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Cho, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+extracellular+region+of+HER2+alone+and+in+complex+with+the+Herceptin+Fab%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab.</a> Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+%3A+Diverse+chemical+function+from+a+few+good+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

タンパク質への非天然アミノ酸の遺伝的組込みは、タンパク質修飾のために使用される他の方法に比べていくつかの利点を有しています。 1-3重要な利点の一つは、タンパク質の任意の種類への一般的な適用です。原理的には、標的タンパク質とタンパク質の標的部位を選択するには制限がありません。しかし、UAAと構造的または機能的に重要な残基の置換​​は、標的タンパク質の構造および機能を変更することをもたらすことができます。一般的に、溶媒に露出されており、他の残基と相互作用しない残基はUAAsの取り込みのために選択されています。したがって、高解像度の結晶構造からの構造情報はUAAの取り込みのための最適の部位を選択するために使用されています。 30 UAAsの取り込みは技術的に容易であり、シンプルな突然変異誘発を必要とするため、複数のサイトが容易に標的タンパク質の所望の機能に最適な残留物を選択するためにスクリーニングすることができます。&lt;/ P&gt; このプロトコルでは、AFは、遺伝子、抗体フラグメントに組み込まれ、そして変異体フラグメントは、部位特異的SPAA...

大腸菌 におけるP -methoxyphenylalanineの遺伝的取り込みが報告されて以来、1、100以上の非天然アミノ酸（UAAs）が正常に様々なタンパク質に組み込まれています。 1-3これらのUAAsの中で、バイオ直交官能基を含むアミノ酸は、広く研究さと最大の割合を表してきました。 UAAsで使用されるバイオ直交官能基は、ケトン、4アジド、5アルキン、6シクロオクチン、7テトラジン、8α、β不飽和アミド、9ノルボルネン、10 transcyclooctene、11およびビシクロ[6.1.0] -nonyneが含まれます。各官能基は、その長所と短所を持っている11が、アジド含有アミノ酸は、最も広範にタンパク質結合に使用されてきました。 P -Azidophenylalanine（AF）、アジド含有アミノ酸の一つは、容易に入手可能であり、その取り込みefficiencyが優れています。このアミノ酸を含有する変異体タンパク質は、銅触媒による付加環化によって、またはSPAACによってcyclooctynesとアルキンと反応させることができます。 12月20日 最近、バイオ医薬品は、製薬業界で大きな注目を集めています。抗体-薬物複合体（ADC）が原因で、ヒトの癌21の治療のための標的治療のためのそれらの能力に有利である治療用抗体のクラスであり、 他の疾患。 50以上のADCは現在臨床試験中であり、その数は急速に増加しています。 ADCの開発では、多くの要因が有効性を最大化し、副作用を最小限にするために考慮される必要があります。これらの要因の中でも、抗体と薬物との間に共有結合を形成するための効率的かつ部位特異的コンジュゲーション反応は重要です。コンジュゲーション反応における所望の効率及び特異性にバイオ直交官能基と結合することによって達成することができます具体的に抗体に組み込まれる非天然アミノ酸。ここで22-26、我々は、部位特異的に組み込むためのプロトコルを報告します 抗体断片にAFとは、生化学的プローブと変異型抗体断片を結合します。

<table><tbody><tr><td colspan="4">1.プラスミド構造</ストロング></td></tr><tr><td>プラスミドpBAD_HerFab_L177TAG</td><td></td><td></td><td>オプションで、アンバーストップコドン(TAG)を所望の位置に含みます。Ko, W. et al. 株促進アジド-アルキン環化付加反応による効率的で部位特異的な抗体標識.BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)</td></tr><tr><td>plasmid pEvol-AFRS</td><td></td><td></td><td>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G.An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)</td></tr><tr><td>DH10B</td><td>Invitrogen</td><td>C6400-03</td><td>Expression Host</td></tr><tr><td>Plasmid Mini-prep kit</td><td>Nucleogen</td><td>5112</td><td>200/pack</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Intron biotechnology</td><td>32034</td><td>500&nbsp;g</td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>アルファ Aesar</td><td>L07482</td><td>1 g</td></tr><tr><td>LB ブロス</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>500&nbsp;g</td></tr><tr><td colspan="4">2.培養準備<</td></tr><tr>td colspan="4">2.1 エレクトロポレーション</td></tr><tr><td>マイクロパルサー</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>マイクロパルサーキュベット</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2089</td><td>0.1&nbsp;cm 電極ギャップ、パッケージ 50</td></tr><tr><td>アンピシリン ナトリウム</td><td>和光</td><td>018-10372</td><td>25 g</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>アルファ Aesar</td><td>B20841 25</td><td>g</td></tr><tr><td>寒天</td><td>SAMCHUN</td><td>214230</td><td>500 g</td></tr><tr><td>SOC 培地</td><td>Sigma</td><td>S1797</td><td>100 mL</td></tr><tr><td colspan="4">3.HerFab-L177AF<</td></tr><tr>td colspan="4">3.1 Herfab-L177AF</td></tr><tr><td>p-azido-L-phenylalanine (AF)</td><td>Bachem</td><td>F-3075.0001</td><td>1 g</td></tr><tr><td>L(+)-アラビノース、99%</td><td>Acros</td><td>104981000</td><td>100 g</td></tr><tr><td>塩酸、35~37%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0256</td><td>500 mL</td></tr><tr><td colspan="4"> の発現と精製3.2 Cell Lysis</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1351</td><td>500 g</td></tr><tr><td>EDTA二ナトリウム塩二水和物, 99.5%</td><td>SAMCHUN</td><td>E0064</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>シグマ</td><td>S9378</td><td>500 g</td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>Siyaku</td><td>126-0671</td><td>1 g</td></tr><tr><td colspan="4">3.3 Ni-NTA アフィニティークロマトグラフィー</td></tr><tr><td>Ni-NTA樹脂</td><td>キアゲン</td><td>30210</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>ポリプロピレンカラム</td><td>キアゲン</td><td>34924</td><td>50/パック 容量 1 mL</td></tr><tr><td>イミダゾール 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>I0578</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性 98%</td><td>サムチュン</td><td>S0919</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム 99%</td><td>サムチュン</td><td>S2907</td><td>1 kg</td></tr><tr><td colspan="4"><ストロング>4。Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC)Cy5.5-ADIBOを用いた精製HerFab-L177AFとアルキンプローブの結合</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>FutureChem</td><td>FC-6119</td><td>1 mg</td></tr><tr><td colspan="4">5.ラベル付きHerFab</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL遠心</td><td>フィルターMILLIPORE</td><td>UFC500396</td><td>96/pack, 500 &#956の精製;L 容量</td></tr><tr><td colspan="4">6.標識HerFabおよび蛍光ゲルのSDS-PAGE分析 スキャン</td></tr><tr><td>1,4-ジチオ-DL-スレイトール、DTT、99.5%</td><td>Sigma</td><td>10708984001</td><td>10 g</td></tr><tr><td>NuPAGE LDSサンプルバッファー、4x</td><td>Thermofisher</td><td>NP0007</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>MESランニングバッファー</td><td>Thermofisher</td><td>NP0002</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Nupage Novex 4-12% SDS PAGEゲル</td><td>Thermofisher</td><td>NO0321</td><td>12ウェル</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Typhoon 9210 可変モードイメージャー</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ひずみ促進アジド - アルキン環付加することにより、効率的で部位特異的抗体ラベリング

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

その構造と機能を研究するためにタンパク質に化学プローブを導入するために利用可能な多くの化学ツールは現在ありません。有用な方法は、遺伝的にバイオ直交官能基を有する非天然アミノ酸を導入することによって、タンパク質結合です。このレポートには、サイト固有の抗体結合のための詳細なプロトコルを記述しています。プロトコルは、アジド含有アミノ酸の遺伝的取り込み、および歪み促進アジド - アルキン付加環（SPAAC）によって結合反応のための実験の詳細が含まれています。この株促進反応は、生理的pHおよび温度で反応する分子を単純に混合することによって進行し、例えば、銅（I）イオンと銅キレートリガンドなどの追加の試薬を必要としません。したがって、この方法は、一般的なタンパク質の結合および抗体薬物複合体（ADCの）の開発に有用であろう。

本研究では、抗体断片は、部位特異的フラグメントにアジド含有アミノ酸を組み込んでいると歪みシクロオクチン（ 図1）を用いて変異体抗体断片を反応させることにより、フルオロフォアとコンジュゲートしました。 HerFabはAFがアジド含有アミノ酸として組み込んだ標的抗体フラグメントとして選択しました。 AFとの交換のためHerFab中の残留物を選択するには、HerFabのX線結晶構造を分析しました。残留物のための30の重要な要件は、効率的な結合反応のためにその結合親和性と溶媒接近の低下を最小限に抑えるために、抗体結合部位から十分な距離を含みます。残渣を十分に抗体の外部に露出し、2免疫グロブリンドメインの界面近傍に位置しているので、位置177のロイシンは、抗体結合部位から離れている、まともな候補者でした。 コンテンツ"FO：キープtogether.withinページ=" 1 "&gt;最初は、彼の6タグのC末端とHerFabのための発現プラスミドを構築し、アンバーコドンは、サイトによって、AFの導...

ここでは、アジド含有アミノ酸を遺伝的に取り込み、続いてアジドを分子プローブとカップリングすることにより、抗体フラグメントに化学プローブを部位特異的に導入するプロトコールを提示します。これは、ひずみ促進型アジド-アルキン環化付加(SPAAC)によるものです。

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

この手順の全体的な目標は、アジド含有アミノ酸を遺伝的に組み込むことにより、抗体フラグメントに化学プローブを部位特異的に導入することです。この方法は、タンパク質修飾、工学、標識などのケミカルバイオロジー分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、簡単な混合で標的プローブまたはブロスをタンパク質または抗体に部位特異的に導入できることです。プラスミドを構築した後、1マイクロリットルあたり8細胞の2倍10倍の濃度で大腸菌DH10-β株の20マイクロリットルにそれぞれ1マイクロリットルを1.5ミリリットルの遠心分離チューブに加えます。ピペットを使用して溶液を穏やかに混合します。次に、20マイクロリットルの混合溶液をきれいなキュベットに入れます。エレクトロポレーションマシンを25マイクロファラッドと2.5キロボルトに設定します。次に、キュベットをショッキングチャンバーのスライドに挿入します。キュベットがチャンバー電極にしっかりと接触するまで、スライドをチャンバーに押し込みます。エレクトロポレーションマシンがビープ音を鳴らすまで、パルスボタンを1回押します。この後、1ミリリットルのSOC培地をキュベットにすばやく追加します。次に、混合物を試験管に移します。37°Cで振とうしながら1時間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、形質転換した大腸菌細胞を、適切な抗生物質を含む溶解ブロス寒天プレートに広げます。プレートを摂氏37度で12時間インキュベートします。プレートインキュベーションが完了したら、抗生物質を含む5ミリリットルのLB培地に単一の形質転換コロニーを接種します。摂氏37度で12時間振とうしながらインキュベートします。次に、一次培養物を1ミリリットルあたり100マイクログラムのアンピシリンと1ミリモルAFを含む200ミリリットルのLB培地に移します。37°Cで振とうしながら少なくとも3時間インキュベートします。培養物が550ナノメートルで0.8の光学密度に達したときに、1.6モルのアラビノースを2ミリリットル追加します。その後、摂氏30度で12時間振とうしながらインキュベートします。インキュベーションが完了したら、11, 000倍gで5分間遠心分離して細胞を回収します。上澄みを捨て、ペレットをマイナス20°Cで凍結します。細胞を溶解する準備ができたら、新鮮な遠心チューブ内の20ミリリットルのパラプラズム溶解バッファーにペレットを再懸濁します。混合物を摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、細胞溶解物を18,000倍gで4°Cで15分間遠心分離する。上清を新しいチューブに移し、ペレットを捨てます。次に、400マイクロリットルのNi-NTA樹脂懸濁液を追加します。ローテーターを使用して、チューブを摂氏4度で1時間静かに攪拌します。混合が完了したら、懸濁液をポリプロピレンカラムに注ぎます。レジンを5ミリリットルのウォッシュバッファーで3回洗浄します。300 μLの溶出バッファーで標的抗体を溶出します。この後、テキストプロトコルに概説されているように、変異タンパク質の濃度を決定します。まず、10ミリモルのリン酸二塩基性ナトリウムと100ミリモルの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液に、HerFab-L177AFの10マイクロリットル溶液を10マイクロリットルを新鮮な遠心分離チューブに加えます。次に、Cy 5.5アザジベンゾシクロオクチンの200マイクロモル溶液を20マイクロリットル水に加えます。この後、反応容器をアルミホイルで覆います。染色促進環状化反応を摂氏37度で6時間進行させます。反応が完了したら、30マイクロリットルのサンプルと450マイクロリットルのリン酸緩衝液を加えて、遠心フィルタースピンカラムで遊離Cy 5.5色素を洗浄します。スピンカラムを14, 000倍gで摂氏4度で15分間遠心分離します。フロースルーを廃棄し、精製したサンプルを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。精製したラベル付きHerFabは、分析の準備ができていない限り、摂氏4度で保存してください。まず、13マイクロリットルの7.8マイクロモル精製HerFabを新しいチューブに加えます。次に、5マイクロリットルのLDSタンパク質サンプルバッファーを追加します。混合物を摂氏95度で10分間インキュベートします。インキュベーション後、4〜12%Bis-Tris SDS-PAGEゲルカセットを電気泳動セルに取り付けます。ランニングバッファを追加します。次に、標識タンパク質サンプルを染色済み分子量メーカーにロードします。200ボルトで35分間ゲル電気泳動を行います。電気泳動が完了したら、ゲルをゲルドキュメンテーションおよび分析システムに移します。Cy 5.5をスキャンし、市販のタンパク質染色剤でゲルを染色します。この研究では、抗体フラグメントHer-Fabは、アジド含有アミノ酸をフラグメントに組み込み、次いで変異抗体フラグメントを歪んだシクロオクチンと反応させることによって、部位特異的に結合しています。SDS-PAGE解析は、アジド含有アミノ酸の有無にかかわらず発現する変異タンパク質に対して行われます。見てわかるように、完全長抗体断片は、アミノ酸の存在下でのみ得られた。このアミノ酸を含む抗体は、Cy 5.5結合アザジベンゾシクロオクチン誘導体Cy 5.5との反応による結合を評価し、SDS-PAGEで分析します。蛍光画像は、変異抗体フラグメントとCy 5.5との結合を示していますが、コントロールでは標識は観察されませんでした。適切に発現し、アセチルフェニルアラニンでタンパク質を精製すると、タンパク質は株を含むプローブで効率的に標識できます 標識反応は追加の試薬を必要としないため、プローブをタンパク質と混合するだけでプローブを標的タンパク質に導入できます。このビデオを見れば、アジド含有アミノ酸を遺伝的に組み込むことにより、抗体フラグメントに化学プローブを部位特異的に導入する方法を十分に理解できるはずです。

efficient-site-specific-antibody-labeling-strain-promoted-azide

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

アデノウイルス粒子は、非天然アミノ酸類似体azidohomoalanineまたはアジド糖のいずれかを含むように設計されています...

Bioorthogonalクリックケミストリーを介したウイルス表面の化学選択的修飾

我々のGPCRの様​​々な標的位置に非天然アミノ酸p-アジド-L-フェニルアラニンを遺伝的に符号化し、異なる用途におけるアジド基の汎用性を示している。これらは、GPCRのリガンド結合ポケットに残基を同定するために目標と光架橋技術、およびペプチドエピトープタグまたは蛍光プローブでのGPCRの部位特異的バイオ直交修飾を含む。...

遺伝的にコードされた分子プローブは、Gタンパク質共役受容体を研究する

DNA及びタンパク質は、配列特異的親和性またはDNAまたはタンパク質トランスフェラーゼおよび合成補因子類似体を用いた蛍光レポーター基で標識される。酵素の補因子特異​​性に応じて、アジリジンまたは二活性化補助因子アナログは、一次元または二段階標識のために用いられる。...

メチルトランスフェラーゼと補因子類似体核酸およびタンパク質の配列特異的標識化

光安定性シアニン色素は、エネルギー移動によるハイブリダイゼーションを監視するためにオリゴヌクレオチドに結合します。...

光安定シアニン色素を用いた波長シフトDNAハイブリダイゼーションプローブの合成

ここでは、光親和性標識を使用して低分子結合タンパク質を同定する方法を説明します。この技術の利点は、標的タンパク質の結合および共有結合標識が生細胞環境内で行われるため、細胞溶解時に天然タンパク質の構造および結合条件を破壊するリスクが排除されることです。...

ライブセル光親和性標識によって、ネイティブの細胞環境における小分子結合タンパク質の同定

125 I標識アジドの合成と銅のないクリック反応を用いて、dibenzocyclooctyne（DBCO） -基コンジュゲート、13-nmサイズの金ナノ粒子の放射性標識のための詳細な手順が記載されています。...

使用した金ナノ粒子の効率的な放射性標識のために最適化されたプロトコル<sup&gt; 125</sup&gt; I標識アジド補綴グループ

安易な蛍光アッセイであるアミノ アミノアシル tRNA-合成酵素/tRNA ペア哺乳類細胞で発現したタンパク質に非正規のアミノ酸 (ncAAs) を組み込むことの効率を評価する. します。サイトと bioorthogonal GPCR の生きているセルのラベルを連結する光橋マッピングを含む ncAAs の G タンパク質共役受容体 (Gpcr)...

光橋マッピングおよび生きている哺乳類細胞における Bioorthogonal 化学の Gpcr にプローブを化学物質の遺伝的結合の最適化

抗体にリジンのシクロプロペン誘導体を組み込むことにより、抗体と薬物抱合体を生成する tetrazine...

高速 Bioorthogonal 反応により抱合体の新世代抗体医薬の非標準アミノ酸の遺伝的符号化

このプロトコルではポッド、phenyoxadiazolyl メチル スルホンに基づく生体分子、特に抗体のチオールに貨物のサイト選択的添付試薬の合成について述べる。また、合成とポッド...

合成と化反応のサイト選択的に作成するためのチオール反応性の試薬の変更 Immunoconjugates

蛍光タグ付き抗生物質は抗菌性の複数の側面を研究するために使用することができる強力なツールです。この記事では、蛍光タグ付き抗生物質の調製と細菌における抗生物質耐性を研究するアプリケーションについて説明します。プローブは、分光光度測定、フローサイトメトリー、顕微鏡法によって細菌耐性(例えば、流出)のメカニズムを研究するために使用することができる。...

蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌耐性の可視化

学ぶ アジド含有アミノ酸を遺伝的に組み込み、SPAAC反応で抗体断片への部位特異的プローブ導入を行う方法。E. coliを用いた発現と精製、蛍光標識による解析技術を含む。タンパク質修飾研究に応用可能。

ひずみ促進アジド - アルキン環付加することにより、効率的で部位特異的抗体ラベリング

さらに動画を探す