Name: マウス梁下ゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶマウス梁下ゾーンから成体神経幹細胞を単離・培養する方法。非接着性および接着性培養システムで細胞を増殖させ、神経再生治療への応用可能性を探索する実験手順を解説します。

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この作業は、韓国科学・情報通信・未来計画部(Grants NRF-2015M3C7A1028790)の資金提供を受けた国立研究財団(NRF)の脳研究プログラムと、保健福祉部の資金提供を受けた韓国健康産業開発院(KHIDI)を通じた韓国医療技術研究開発プロジェクトからの助成金によって支援されました。 韓国 (HI14C3347)。

材料および培養培地の調製<ol><li> SCZの解剖および解離のために、アルミホイルで脳マトリックス、両刃カミソリの刃、および鉗子をラップしてから、オートクレーブでそれらを滅菌します。 </li><li>全マウスの脳を洗浄するために、冷PBS緩衝液の50ミリリットルを準備します。 </li><li>解剖顕微鏡を設定し、脳（オートクレーブ処理ハサミやピンセット）の解剖とSCZ（1 mlシリンジ、30 G針、脳マトリックス、および細かい鉗子）を単離するために必要な手術器具を準備します。 </li><li> N2培地の調製： <ol><li> F-12 / DMEM（+ L-グルタミン、+炭酸水素ナトリウム）2％B27、1％N2サプリメント、および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを含む培地を準備します。 注：成長培地は、N2培地および成長因子（20 ngの/ mLの精製された上皮成長因子（EGF）および20 ng / mLの塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF2））からなります。 </li></ol></li><li>消化緩衝液を準備します（40単位/ mlのパパイン、2.4単位/ ml dispasE II、および2％のペニシリン - ストレプトマイシンPBS中）組織消化のために。 </li><li>コーティングプレートとカバースリップの調製： <ol><li> （; 0.01％PLO）とラミニン（DH 2 Oに溶解し10μg/ mlの）ポリ-L-オルニチンを準備します。免疫染色のために、単層または18ミリメートルカバースリップとしてSCZ-aNSCsのメンテナンスのためのコート6ウェルプレートに、4℃で一晩PLOでそれらをインキュベートします。そしてO.は、プレートとカバースリップは、最後の洗浄後に乾燥することができDH 2でそれらを3回洗浄します。 </li><li>次に、4℃で一晩ラミニンでプレートをインキュベート。そして、DH 2 Oでそれらを3回洗浄 注意：細胞付着に影響を与えるであろう、ラミニンを乾燥させないでください。 注：コーティング溶液を3回再利用することができます。 </li></ol></li></ol> 2.単離と大人SCZの解離<ol><li>文化の準備に先立ち、氷上で脳マトリックスと両刃カミソリを配置します。 脳マトリックスを凍結しないでください、理由BR注：アインは、それに添付可能性があります。 </li><li> CO 2窒息または頚椎脱臼により（8週齢）のマウスを生け贄に捧げます。 <ol><li> 70％エタノールを噴霧した後、鋭利なハサミで頭部を切断。ヘッドを固定化するために、しっかりと頭の両側を保持。尾 - 吻側方向に正中線でハサミで皮膚をカット。これは、頭蓋骨から皮膚の完全な除去を促進します。 </li><li>最初の（ラムダに後方）頭蓋骨の尾の部分を削除してから、背側正中線の位置で頭蓋骨と脳の間に鉗子を挿入します。左（または右）頭頂骨をつかみ、慎重にはがし。他の頭頂骨の除去のために、この手順を繰り返します。 注：視神経と脳から髄膜の除去の切断はそれが簡単に頭蓋骨から脳をデタッチすることを可能にします。 </li><li>冷PBS緩衝液（25ミリリットル）に脳を移し、余分な血液を除去するために、それを2回すすいでください。 </li></ol></li><li>氷とミリアンペアに脳マトリックスに脳を置きますKE冠状カットは1mm厚のスライスを得ることができます。 35mmのプラスチック製ペトリ皿に冷PBSに脳の後部に配置されSCZ領域を含む脳切片（1mm）で転送します。 注意：冠状切片の平行な面を得るために、脳の亀裂は、脳マトリックスの正中線に配置されることを確実にします。セクション内の不要な変動を回避することが重要です。 注：ブレグマ2〜3ミリの後部に脳スライスを入手。これは、SVZからSCZの分離を可能にします。 </li><li>低倍率で解剖顕微鏡下で、曲がった30G針6,9と皮質と海馬の白質領域からSCZをマイクロ解剖。そして、SCZ上記の皮質領域を削除します。冷PBSせずに氷の上で35ミリメートルのプラスチックペトリ皿にスライスから解剖SCZ領域を配置します。 注：成熟した神経細胞を含む余分な地域の汚染がaNSCsとニューロスフェア形成bの生存能力に影響を与える可能性がありますecause彼らはANSC培養条件下で細胞死を起こします。 </li><li>曲がった30 G針を使用して、すぐに小片に切開した組織を切ります。 注：長い時間がSCZ組織を切開するために必要とされている場合は、チョッピングの前に冷PBSで解剖した組織を浸します。 </li><li>再懸濁消化緩衝液1mlで刻んだ組織を、消化緩衝液2mlを含有する15mlチューブに組織を転送し、そして37℃の水浴中で30分間それをインキュベートします。 注：十分に混合するためにチューブを10分ごとに振ります。 </li></ol> 3.梁下ゾーン由来の成体神経幹細胞培養<ol><li>消化された組織を分離し、その後5分間、145×gでチューブを遠心分離する穏やかにチューブをタップします。消化緩衝液を洗い流し、ゆっくりP1000ピペットを用いて試料溶液を5回の最大をピペットするために予め温めておいたN2培地1mlで再懸濁消化された組織、上清を捨てます。 注：過粉砕狭いとピペットチップは、細胞の生存及びその後の成長を減少させることができます。 </li><li> 5分間、145×gでチューブを遠心。上清を廃棄した後、N2培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>非コート6ウェルプレート中のN2培地1mlを調製し、2mlの最終容量を作成するために懸濁された細胞を1ml加えます。 </li><li>各ウェルにEGF（20ng / ml）およびbFGFを（20 ngの/ ml）を加えます。穏やかに播種した細胞を添加した成長因子を混合するために手で6ウェル培養皿を振ります。 37℃、5％CO 2インキュベーター中で6ウェルプレートを保管してください。 </li><li> 8日間毎日各ウェルにEGF（20ng / ml）およびbFGFを（20 ngの/ ml）を加えます。すべての三日目は、培地のおおよそ2ミリリットルの容量を維持するために、N2培地200μlのを追加します。 </li></ol>ニューロスフェアとして、また単層培養へのNSCの4継代<ol><li>ニューロスフェアを収集し、新しい15ミリリットルコニカルチューブに移します。 注：ニューロスフェアの数（&gt;直径50μm）PERならびに単一マウス脳のSCZからは、SVZ（190.5±6.33）9のそれよりも少なかった64.3±7.31でした。 </li><li>単一細胞に神経球を解離し、37℃の水浴中で5分間解離緩衝液0.5 mlのニューロスフェアを培養します。一次ニューロスフェアは、単一の細胞に分離し、神経球または単層培養物のいくつかの継代にわたって維持することができます。 SCZ-aNSCsは、単層培養形式で&gt; 10回継代することができるので、単層としてSCZ-aNSCsを展開すると、神経球よりも優れているが、&lt;ニューロスフェア培養形式で5回：注意してください。 注意：SCZ-aNSCs強い凝集を示し、単一細胞にそれらを分離することは困難です。このように、ニューロスフェア培養形式は、ルーチン細胞増殖のために推奨されません。 </li><li>ゆっくり5分間145×gで上下P1000ピペットで5倍未満と遠心チューブを試料溶液をピペット。上清および再suコマンドを破棄N2培地1mlの神経球を過ごします。 注：細胞の生存及びその後の成長を減少させることができ、狭いピペットチップで粉砕にわたり。 </li><li>細胞懸濁液（10μl）を0.4％トリパンブルー溶液の1混合し、次いで血球上の生細胞の数を数える：細胞をカウントするには、1を作ります。 PLO /ラミニンで6ウェルプレートに塗布した後、各ウェルのためのN2培地2mlで2.5×10 5細胞/ mlで細胞をプレート。 注：細胞密度の変化は、それらの条件と分化能に影響を与えることができます。 </li><li> 5日間の増殖因子の毎日の治療とSCZ-aNSCs（2ミリリットル、20 ngの/ ml）を維持し、それらの通路それら。 </li></ol>梁下ゾーン由来の成体神経幹細胞の分化5. <ol><li> SCZ-aNSCsの分化のための成長因子を有する1ミリリットルN2（20 ngの/ ml）の中の1×10 5細胞/ mlとPLO /ラミニンでコーティングした18ミリメートルカバースリップ上にプレートaNSCs。 </li><li>次の日、細胞がしっかりとカバースリップに結合している場合には、増殖因子を除去するためにN 2で成長培地を交換します。 </li><li> 6日後、細胞破片を除去し、免疫染色のためにそれらを修正するためにPBS 1mlで分化した細胞を洗浄します。 注：BrdUを増殖細胞の新たに合成されたDNAに組み込むことができます。そのため、必要に応じて、BrdUを（10μg/ ml）を、細胞の固定前に細胞を生きて追加することができます。 </li></ol> 6.免疫染色成体神経幹細胞および分化した前駆細胞<ol><li>免疫染色のために、PBSで細胞を洗浄し、室温で20分間、4％PFAで固定し。 注意：PFAは非常に有毒です。皮膚や眼との接触を避けます。 </li><li> 、4％PFAを削除し、PBSで3回を固定した細胞を洗い流し、その後、4°Cuntil彼らは免疫染色のために必要とされるでそれらを格納します。 </li><li> 1×P溶液（3％ウシ血清アルブミン及び0.1％トリトンX-100を遮断してカバースリップ上で細胞をインキュベート室温で少なくとも30分間BS）。 </li><li>新鮮なブロッキング溶液中で一次抗体を準備し、4℃で一晩サンプルをインキュベートします。 <ol><li> aNSCsを免疫染色<ol><li>抗ネスチンおよび抗BrdU抗体を用いてaNSCsを染色。固定する前に、aNSCsへのBrdUの20μgのを追加し、2時間のためにそれらをインキュベートします。ブロッキング工程を実施する37°Cbeforeで20分間2 N HClを用いて変性ステップを実行します。 </li></ol></li><li>分化した前駆細胞を免疫染色： <ol><li>差別化前駆細胞を標識する抗O4、抗BIIIチューブリン、および抗グリア線維酸性タンパク質（GFAP）抗体を使用してください。 </li></ol></li></ol></li><li> PBSで試料を3回洗浄し、蛍光色素（1：500）にコンジュゲート二次抗体でそれらをインキュベートし、室温で30分間ブロッキング溶液中。その後、PBSで試料を3回洗浄します。 注：プライマリのホストと一致し使用した二次抗体抗体。 Hoechest33343（1：2,000）は、核染色のために使用されます。 </li><li>スライドガラスにマウントソリューションを追加し、取り付けを進めます。複数の波長で共焦点顕微鏡でサンプルを観察し、画像：FITC（488 nm）と、のCy3（543 nm）で、Cy5の（647 nm）であり、Hoechest33343（405 nm）を。 </li></ol>

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著者は利益相反を宣言しません。

本論文では、成体マウスSCZからのNSCを生成し、様々なアプリケーションのためにそれらを維持するための詳細なプロトコルを記述します。 SCZ-のNSCを精製し、展開するために必要なin vitroの培養系を確立するための3つの重要なステップがあります。まず、SCZ領域が正確に他の潜在的な神経性領域（ 図1B）から解剖されていることを確認することが重要です。 SCZ領域を含む厚さと正確なセクションを1mm間隔脳マトリックスを用いて得られ、その後細かい針が他の皮質領域（ 図1A）からSCZの顕微解剖のために使用しました。ときに非NSCのような大脳皮質などの隣接組織から、負SCZ-NSCを16-18,22の生存率および球形成に影響を及ぼすSCZ-aNSCs、壊滅的な死が発生、と培養されます。尾SCZ（ブレグマ2-3ミリの後部）が明確なSCZ-aNSCsを生成するための最良の領域として確認されました。第二に、approp収穫と継代段階でriate酵素処理は細胞の高い収量を達成するために重要です。ディスパーゼIIおよびパパイン、トリプシンよ...

NSCは、自己再生と多系統分化の特徴を持っています。これらの特性を確認するために、ニューロスフェア培養システムが広く使用されてきました。ニューロスフィア培養システムは1990年代初頭に開発され、標準的な幹細胞培養システム1として機能しました。自己再生力に応じて、NSCは連続的に増殖し、懸濁培養で細胞塊を生成します。細胞の数とニューロスフェアのサイズは、NSCの増殖特性と密接に関連していると考えられています。単層培養は、NSCの維持と分化にも広く使用されています。ニューロスフェア培養と比較して、単層培養システムはNSCの均一な維持と拡大に優れています2。これら2つの十分に発達した培養システムは、in vitroでのaNSCの特性評価に貢献しています。 
NSCは、側脳室の脳室下ゾーン(SVZ)や海馬3-5の顆粒下ゾーン(SGZ)など、さまざまな脳領域に存在します。尾側皮質下白質の脳梁下領域(SCZ)は、新規の神経原性領域として認識されています6-8。最近、SCZ-aNSCが外傷性脳損傷の治療可能性を持っていることが報告されました9。他の神経原性領域と比較して、SCZは皮質下白質に沿って存在します。ヒトの脳では、皮質下白質はマウスの脳よりも大きな領域を占めている10。したがって、in vitro培養システムを用いてSCZ-aNSCの特性を理解することは、これらの細胞の神経再生への利用を促進するために重要です。活性または静止性のNSCを含む望ましくない領域による汚染の可能性を排除するためには、目的の脳領域を正確に解剖する必要があります。例えば、非神経原性領域のaNSCは、損傷した脳やin vitro培養中に活性化され、新たな神経細胞を産生することができる11。SCZからNSCを取得するために、SCZを含む脳スライスから細胞を採取しました。次に、細い針を用いてSCZ領域の慎重なマイクロダイセクションを行った。SCZからニューロスフェアを生成するために、マイクロ解剖したSCZ組織チャンクを単一細胞に解離し、上皮成長因子(EGF)および塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)の存在下で懸濁液として培養しました。SCZ-aNSCがニューロスフェアを形成した後、ニューロスフェアまたは単層として維持して拡張することもできます。この手順では、単層培養におけるNSCとその子孫の増殖および分化後のNSCを検出するためのさまざまなマーカーによる免疫染色プロセスも示しています。ここでは、SCZ-aNSC培養システムの視覚的なプロトコルを示します。このプロトコルには、SCZ領域のマイクロダイセクションと細胞の維持と継代に関する詳細な指示が含まれています。

<table><tbody><tr><td><ストロング>ミディアムコンポーネント</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>+L-グルタミン、+重炭酸ナトリウム</td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>N2 サプリメント</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 サプリメント</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Growth factor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Gibco</td><td>PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>バッファー</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>BIOSOLUTION</td><td>BP007a</td><td>1x 希釈液</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dissociattion バッファー</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ II</td><td>ロシュ</td><td>04-942-078-001</td><td></td></tr><tr><td>パパイン</td><td>ワージントン</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>アキュターゼ</td><td>ICT</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>Tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine鉗子</td><td>WPI</td><td>555229F</td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>ストルツ</td><td>E3321-C</td><td></td></tr><tr><td>脳マトリックス(1 mm)</td><td>RWD</td><td>68707</td><td></td></tr><tr><td>両刃カミソリ</td><td>DORCO</td><td>ST-300</td><td></td></tr><tr><td>30 G ニードル</td><td>SUNGSHIM</td><td>N1300</td><td></td></tr><tr><td>素材</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml チューブ</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>50 ml チューブ</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>35 mm ディッシュ</td><td>SPL</td><td>10035</td><td>ペトリ ディッシュ</td></tr><tr><td>100 mm ディッシュ</td><td>SPL</td><td>10090</td><td>ペトリ皿</td></tr><tr><td>カバー スリップ (18 mm)</td><td>Deckglaser</td><td>111580</td><td></td></tr><tr><td>12 ウェル ディッシュ</td><td>SPL</td><td>32012</td><td>非コーティング</td></tr><tr><td>6 ウェル ディッシュ</td><td>SPL</td><td>32006</td><td>非コーティング</td></tr> <tr><td> コーティング材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLO</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td>0.01%</td></tr> <tr><td>Laminin</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>一次抗体&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB353</td><td>マウス (1:1,000)</td></tr><tr><td>EGFR</td><td>Abcam</td><td>ab2430</td><td>ウサギ (1:1,000)</td></tr><tr><td>DCX</td><td>Santa Cruz</td><td>SC8066</td><td>ヤギ (1:500)</td></tr><tr><td>Tuj1</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td>ウサギ (1:2,000)</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Invitrogen</td><td>13-0300</td><td>ラット (1:1,000)</td></tr><tr><td>O4</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td>マウス (1:500)</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>ラット (1:500)</td></tr><tr><td>Secondary 抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>1:500</td></tr><tr><td>anti-mouse cy3</td><td>Jackson</td><td>715-165-151</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse 647</td><td>Jackson</td><td>715-606-150</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギ 488</td><td>アレクサ</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>反ウサギ cy3</td><td>ジャクソン</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>反ウサギ 647</td><td>ジャクソン</td><td>711-605-152</td><td></td></tr><tr><td>反ヤギ 488</td><td>アレクサ</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>反ヤギ cy3</td><td>ジャクソン</td><td>705-165-147</td><td></td></tr><tr><td>反ヤギ 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21447</td><td></td></tr><tr><td>抗ラット 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>抗ラット cy3</td><td>ジャクソン</td><td>712-166-150</td><td></td></tr><tr><td>抗ラット 647</td><td>ジャクソン</td><td>712-605-153</td><td></td></tr><tr><td>Immunostaining materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Millipore</td><td>82-100-6</td><td>3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>usb</td><td>22686</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>Biosesang</td><td>P2031</td><td></td></tr><tr><td>Hoechest33342</td><td>Life Technology</td><td>H3570</td><td>核染色用色素</td></tr></tbody></table>

マウス梁下ゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

成体神経幹細胞(aNSC)は、損傷した脳組織の再生に使用することができます。神経幹細胞は、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトの3種類の細胞に分化・増殖する可能性を秘めています。aNSC由来の領域を同定し、aNSCの特性を特徴づけることは、aNSCの潜在的な使用と神経再生におけるそれらの役割の解明にとって重要です。白質と海馬の間に位置する脳梁下帯(SCZ)は、最近、aNSCを含み、神経芽細胞を絶えず引き起こすことが報告されています。SCZからのaNSCの低率はニューロンに分化します。ほとんどの細胞は、オリゴデンドロサイトやアストロサイトなどのグリア細胞に分化します。これらの細胞は、外傷性皮質損傷の治療可能性を有することが示唆されています。このプロトコルでは、成体マウスの脳からSCZ-aNSCを生成するプロセスを詳細に説明しています。1 mm間隔の脳マトリックスを使用して、SCZを含む冠状スライスを取得し、脳全体からSCZを正確に解剖します。SCZセクションは、最初にニューロスフィア培養を受けます。十分に発達した培養システムにより、それらの特性の検証が可能になり、NSCの研究を増やすことができます。ニューロスフィア培養システムは、増殖を測定し、本物のNSCを収集するための有用なツールを提供します。単層培養は、増殖と分化をアッセイするためのin vitroシステムでもあります。重要なことに、この培養システムは、ニューロスフェア培養システムよりもNSCに対してより均質な環境を提供します。したがって、これらの培養システムは、個別の脳領域を使用して、aNSCとその治療用途への応用に関する知識を広げるのに役立ちます。

未知の神経形成領域からaNSCsための培養システムを定義すると、これらの細胞を理解し、脳修復12におけるそれらの潜在的用途を開発するために不可欠です。異なる発生段階で、または異なる地域でのNSCが異なる3,4振る舞うことが知られています。最近、SCZ由来細胞は、SVZ由来細胞7-9と比較して、インビボおよび インビトロで神経分化のために差動電位を示すことが報告されました。従って、正確にそれぞれの神経原性領域を分離するために、SCZを含む脳切片を1mm脳マトリックス（ 図1A）を使用して解剖しました。増殖因子との培養の8日後、SCZ由来するaNSCs細胞はその後（ 図1B）を維持することができる、ニューロスフェアを形成することができます。 ニューロスフェアでNSCのサブセットは、SPO可...

成体神経幹細胞(aNSC)の増殖のための培養システムを確立することで、aNSCの検査と治療への応用が可能になります。脳梁下領域(SCZ)は、最近、成体マウスの新規神経芽細胞形成領域として認識されています。ここでは、SCZ-aNSCの単離、拡張、および分化の方法について説明します。

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

この成人神経細胞培養システムの全体的な目的は、脳弓下帯から成人神経幹細胞を単離し、非付着性および付着性培養システムで細胞を増殖させることです。本内容は、脳弓下帯のような小さな脳病変部位からの神経幹細胞の単離および培養など、成人神経幹細胞分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この手法の主な利点は、脳弓下帯から成人神経幹細胞を単離できる点にあります。手順は簡単ですが、正確さが求められます。まず、脳マトリックス、両刃のカミソリ、およびピンセットをオートクレーブで滅菌します。次に、マウス脳の洗浄に使用する冷PBSを50 milliliters準備します。次に、解剖顕微鏡をセットアップし、脳の解剖およびSCZの単離に必要な手術器具を準備します。2% B-27および1% N-2サプリメント、1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むF-12 DMEM培地を調製します。その後、組織消化用の消化バッファーを調製します。その後、0.01% Poly-L-Ornithineとラミニンを調製します。続いて、SCZ成人神経幹細胞を単層で維持するための小型プレート6枚、または免疫染色のための18 mmカバーガラスをコーティングします。その後、Poly-L-Ornithineとともに4°Cで一晩インキュベートします。その後、DH20で3回洗浄し、最後の洗浄後に乾燥させます。続いて、プレートをラミニンとともに4°Cで一晩インキュベートします。マウス脳を摘出した後、冷たいPBS緩衝液に移し、過剰な血液を除去するために2回すすぎます。次に、脳を氷上の脳マトリックスに設置し、冠状断で1 mm厚のスライスを作成します。その後、SCZ領域を含む脳の後方スライスを冷PBSに移します。低倍率の解剖顕微鏡下で、曲げた30ゲージの針を用いて、皮質の白質領域および海馬からSCZを微小解剖します。次に、SCZより上方の皮質領域を除去し、切り出したSCZを氷上の35 millimeter Petri dishに入れた冷PBSの中に置きます。脳の計測指標と曲げた30 gauge needleを使用することで、全組織からsubcallosal zoneの領域を正確に切り出すことができます。その後、PBSを除去し、切り出した組織を直ちに小さく刻みます。1 mLの消化バッファーで再懸濁します。その後、サンプルを2 mLの消化バッファーが入った15 mLチューブに移します。次に、37 °Cのウォーターバスで30分間インキュベートします。このステップでは、チューブを軽く叩いて消化した組織を分散させます。その後、チューブを145 x gで5分間遠心分離します。5分後、上清を捨て、あらかじめ温めておいたN-2 medium 1 milliliterで消化した組織を再懸濁して消化バッファーを洗い流し、サンプル溶液を最大5回ま

isolation-culture-adult-neural-stem-cells-from-mouse-subcallosal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、マウス胎児の開発皮質からneuroprecursorsの単離に使用方法を説明します。皮質組織を解剖、子宮から胚を取り外す手順、および分離された大脳皮質を消化することが示されている。...

マウス神経幹細胞の前駆体の文化

このビデオプロトコルは、成体マウスの脳室周囲領域からの神経幹細胞を生成し、拡大するニューロスアッセイ法を示し、一方は再現性のニューロスフェア培養を達成できるように技術的な洞察を提供しています。...

ニューロスフェアのアッセイを使用して成体マウス神経幹細胞の単離と拡大

このビデオプロトコルは、胚14日目マウスの脳の神経節隆起から神経幹細胞の単離と拡大のためのニューロスアッセイのアプリケーションを示しています。...

ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

このビデオは、マウスの脳のサブカロサルゾーンから神経幹細胞を分離して培養するプロセスを示しています。これには、組織を解剖し、酵素で解離し、分化因子で培養して成熟した神経細胞に成長させることが含まれます。...

マウスの脳梁下ゾーンからの成体神経幹細胞の単離と培養

このビデオは、成体マウスの脳から側脳室壁を分離し、酵素組織の解離を行って単一細胞を得るための詳細なプロトコルを示しています。次に、これらの細胞を特定の培養条件にさらして、神経幹細胞の増殖を選択的に増強し、オリゴデンドロサイトとアストロサイトの共培養への分化を促進します。...

成体マウス神経幹細胞からのオリゴデンドロサイトとアストロサイトの混合培養物の取得

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出生後マウス小脳からの幹細胞の単離と神経細胞への分化

成人脳から採取した神経幹細胞は神経系の発達の基礎研究から再生医療の潜在的な臨床応用を探索範囲の用途に利用が増加している。これは実験的な成果を鳴らす重要なこれらの細胞を成長させるために使用される分離と培養条件に厳密な制御を行う。...

大人の齧歯類の脳の従来の従来にない地域から神経幹細胞を増殖させる

ここでは、脳室下帯と個々の成体マウスの歯状回から、付着性単層またはニューロスフェアのいずれかとして、神経前駆細胞培養を同時に生成するための詳細なプロトコルを記述します。...

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私たちは、成体マウスの脳の脳室下ゾーン(SVZ)から神経幹細胞(NSC)とその子孫を単離するための蛍光活性化細胞選別(FACS)ベースの方法を報告します。蛍光ユビキチン化細胞周期インジケーター(FUCCI)トランスジェニックマウスに適用することで、ライブイメージングによる細胞周期の進行を研究することができます。...

セル成体マウス脳室下帯から神経幹細胞および前駆細胞の選別とその細胞周期ダイナミクスのライブイメージング

E13マウス胚神経節隆起から顕微鏡下神経幹細胞の分離法を紹介します。...

マウス萌芽期の神経幹細胞の分離と培養

ここでは、成体マウス脳室下ゾーンから単離された拡大神経幹細胞(NSC)における遺伝子導入効率を高めるように設計されたヌクレオフェクションシステムについて説明します。この知見は、この方法が神経幹細胞における遺伝子摂動を大幅に改善し、従来のトランスフェクションプロトコルの有効性を上回り、細胞の生存率を向上させることを示しています。...

成体マウス脳室下領域からの神経幹細胞の単離、増殖、およびヌクレオフェクション

学ぶマウス梁下ゾーンから成体神経幹細胞を単離・培養する方法。非接着性および接着性培養システムで細胞を増殖させ、神経再生治療への応用可能性を探索する実験手順を解説します。

マウス梁下ゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

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