免疫応答の生体内多光子イメージングのためのマウスの耳の皮膚に虚血再灌流傷害を誘導します

この実験の全体的な目標は、マウスの耳の皮膚の生体内多光子イメージングを通じて、免疫細胞が虚血再灌流にどのように応答するかを理解することです。この方法は、免疫学および皮膚科学の分野における非常に重要な問題のいくつかに対処し、免疫細胞の動的な挙動を理解するのに役立ちます。この技術の主な利点は、炎症状態または安静時の皮膚の細胞活動を研究するための堅牢なイメージングモデルを提供することです。

この方法は虚血性再灌流障害に関する洞察を提供するかもしれませんが、これは感染症だけでなく過敏反応などの他のシステムにも適用できます。この手順を開始するには、マウスを加熱パッドに置き、準備手順全体を通して体温を摂氏37度に保ちます。つま先のつま先つまみ反射がないことで麻酔の深さを確認します。

次に、麻酔下での乾燥を防ぐために、動物の目に眼科用潤滑剤を塗布します。その後、背耳の上部3分の2に脱毛クリームを慎重に塗り、2〜3分間待ちます。次に、濡れたコットンチップアプリケーターを使用して、しっかりと、しかし優しくクリームを取り除きます。

次に、ネオジム磁石を使用してマウスの耳の皮膚に虚血を誘発します。これを行うには、まず磁石を個々のプラスチックガイドに挿入します。1つの磁石を、端のみが2番目の腹側磁石と接触するように配置します。2番目の腹側磁石は、耳を磁石の上に平らに置いた状態で耳の腹側の下に配置する必要があります。

準備ができたら、磁石を慎重に集めます。虚血が1.5時間続いた後、プラスチックガイドを使用して磁石を互いにねじって取り外し、再灌流を行います。磁石を取り外した直後に、Evans Blueまたは選択した別の血管標識剤を静脈内投与します。.

このステップでは、マスキングテープを2枚カットします。接着剤の側面をくっつけ、その幅に沿って約1ミリメートルの接着剤を残します。次に、マスキングテープを2つにカットして、耳のプラットフォームのスリット内に収まるようにします。

このマスキングテープは、粘着面が上を向くようにスリットの半分ほど挿入します。その後、画像化する耳がマスキングテープストリップの隣に来るように、マウスを加熱パッドに置きます。PBSで湿らせたコットンチップアプリケーターを2つ使用して、耳を粘着ストリップにそっと押し付けます。

ストリップをガイドとして使用して、マウスの耳をスリットに通すと同時に、マウスをステージに近づけます。耳の皮膚は非常に壊れやすいため、この手順は、準備による怪我を避けるために非常に慎重に行う必要があります。粘着テープを剥がすには、まずPBSを一滴加えてテープの粘着性を下げます。

次に、細いペイントブラシを使用して、マウスの耳をマスキングテープからできるだけ優しく分離します。湿った綿の先端アプリケーターを耳の上でそっと転がして、耳を耳のプラットフォームに対して平らにします。その後、カバーガラスの下にPBSを一滴垂らし、耳の上にそっと置きます。

その後、直腸温プローブを挿入し、製造元の指示に従ってワイヤーを加熱システムに接続します。画像を取得するには、動物を多光子顕微鏡の下に置きます。大規模なEvans Blueの漏出を特徴とする虚血の端に近接しているイメージング領域から始めます。

この概略図は、磁石の位置を示しています。これらの2枚の写真は、磁石クランプ後の虚血前および虚血後の耳を示しています。この耳の概略図では、磁石が配置された場所に対して画像化された領域を示しています。

この最大投影のタイムラプスシーケンスは、1.5時間の虚血後のLysM-eGFPMアルビノマウス耳皮膚の再灌流に応答した好中球浸潤を示しています。以前の時点では、エバンスブルー信号の欠如は、虚血後の一時的な血管閉塞を示しています。一度習得すると、イメージング用の虚血性再灌流耳の準備は、適切に行われれば30分以内に行うことができます。

この手順を実行する間、麻酔の深さとマウスの温度を常に確認することが重要です。この手順に続いて、マウスの耳の皮膚のマウス全体の染色などの他の方法を実行して、細胞の局在を全体的に把握することができます。このプロトコルの開発後、免疫学および皮膚科学の分野の研究者がマウスの耳の皮膚の自然免疫を探求する道を開きました。

これらのビデオを見た後、虚血性再灌流障害を研究するためのマウス耳の皮膚イメージングモデルを確立する方法を十分に理解しているはずです。多光顕微鏡での作業は危険な場合があることを忘れないでください。また、レーザー安全トレーニングなどの予防措置を講じる必要があります。