具体的にはヒト細胞における選択的スプライシングを操作するために工学人工要因

このプロトコルの全体的な目標は、特定のターゲットの選択的スプライシングを特異的に操作できる人工スプライシング因子を設計することです。この方法は、がん細胞における代替スプライシングの制御や誤制御など、RNAプロセシングの分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、その柔軟性です。

私たちは、任意の遺伝子における異なるタイプの代替スプライシングを促進または阻害する人工因子を設計することができます。この手順を実証するのは、私の研究室の研究員であるHuan-Huanと、私の研究室のポスドクであるQianyunです。野生型PUF DNAは、カスタマイズされたPUFドメインスキャフォールドを生成するためのテンプレートとして使用されます。

各位置で異なるRNAヌクレオチドを特異的に認識するPUF配列を含むPCRプライマーを使用してください。PUFリピートごとに、4つの異なるプライマーを使用して、各位置で異なる塩基を認識します。ラウンド1のPCRでは、示されているプライマーペアを使用して、4つのPUFリピート、ユニバーサルブリッジフラグメント、およびキャップフラグメントのコード配列を生成します。

ラウンド2では、最後のステップで生成したPCR産物をテンプレートとして使用し、示されているプライマーの組み合わせを使用して、RNA認識コードR-oneからR-four、およびR-fiveからR-eightのコード配列を生成します。ラウンド3では、ラウンド2とブリッジ4から5の製品をテンプレートとして使用し、R-oneフォワードプライマーとR-eightリバースプライマーを使用して、キャップなしでR-oneからR-eightのコーディングシーケンスを生成します。ラウンド4 PCRでは、R-oneからR-eight、5プライムエンドキャップ、3プライムエンドキャップをテンプレートとして使用して、完全なPUFドメインのコーディングシーケンスを生成します。

HEK-293T細胞のトランスフェクションを開始するには、ボトルを穏やかに反転させてリポソームトランスフェクション試薬を混合します。次に、トランスフェクションごとに2マイクロリットルのリポソームトランスフェクション試薬を50マイクロリットルの還元血清培地で希釈します。穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートします。

次に、04 マイクログラムのグリシンリッチドメイン発現ベクターと0.2マイクログラムのモジュール式スプライシングレポータープラスミドを、滅菌チューブ内の50マイクロリットルの還元血清培地に希釈します。次に、0.4マイクログラムのRSエフェクタードメイン発現ベクターと0.2マイクログラムのPGZ-threeレポータープラスミドを50マイクロリットルの還元血清培地で希釈します。最後に、0.4 マイクログラムの PGL-RS-PUF 発現ベクターと 0.2 マイクログラムの PEZ-1B または PEZ-2F レポータープラスミドを、滅菌チューブ内の 50 マイクロリットルの還元血清培地に希釈します。

室温で5分間インキュベートした後、希釈したリポソームトランスフェクション試薬を希釈したプラスミド混合物と穏やかに混合します。最終混合物を室温で20分間インキュベートします。次に、発現ベクターを含むトランスフェクション混合物をHEK-293細胞を播種した24ウェルプレートの各ウェルに加え、加湿インキュベーターで摂氏37度、二酸化炭素5%の加湿インキュベーターで少なくとも12時間インキュベー

12時間のインキュベーション後、トランスフェクションした細胞をトリプシン処理と遠心分離により回収します。遠心分離後、培地を廃棄し、チューブあたり0.5ミリリットルのRNA抽出バッファーを追加します。各サンプルに 0.5 ミリリットルの RNA 抽出バッファーあたり 0.1 ミリリットルのクロロホルムを添加します。

インキュベーション後、チューブを12,000倍Gおよび摂氏4度で15分間遠心分離する。次に、水性ベースを新しいチューブに移します。最初の均質化に使用したRNA抽出バッファー0.5ミリリットルあたり0.25ミリリットルのイソプロパノールを添加します。

ボルテックスで混合し、室温で10分間インキュベートします。以前と同様に遠心分離後、通常、RNA沈殿物はチューブの底に見えます。上清を捨て、RNA抽出バッファー0.5ミリリットルあたり0.5ミリリットルの75%エタノールでRNAペレットを洗浄します。

、摂氏4度で5分間Gの7,500倍で遠心分離します。スピン後、上清を取り除き、RNAペレットを風乾します。RNAを50マイクロリットルのRNaseフリー水に溶解します。

次に、各50マイクロリットルのRNA溶液に、1マイクロリットルのDNase-oneあたり5ユニットの2マイクロリットル、7マイクロリットルの10Xバッファー、および11マイクロリットルの水を追加します。インキュベーション後、溶液を摂氏70度に15分間加熱して、DNaseを不活性化します。逆転写酵素反応を行って各サンプルからcDNAを合成した後、標識PCR反応の本体の成分を画面に示されている順序でPCRチューブに加えます。

サンプルごとに1つの反応を準備します。サーマルサイクラーでRT-PCRプログラムを実行します。最後に、TBEバッファーを含む10%ポリアクリルアミドゲルを介した電気泳動によりPCR産物を分離します。

蛍光スキャナーを使用して製品を視覚化し、デンシトメトリーソフトウェアを使用してスプライシングされた各アイソフォームの量を測定します。アポトーシスを測定するための免疫蛍光アッセイでは、前述したようにグリシンリッチドメイン発現プラスミドを含むトランスフェクションミックスを調製し、ポリリジンコーティングされたガラスカバー上に増殖したHeLa細胞を6ウェルプレートに入れます。トランスフェクションの24時間後、カバースリップ上の細胞を1ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドで1x PBS溶液で室温で20分間固定します。

次に、カバースリップ上の細胞を2ミリリットルの1x PBSで5分間静かに洗います。次に、0.2%Triton X-100を1x PBS溶液中で10分間細胞に透過処理します。前回と同様に1x PBSで3回洗浄した後、1x PBS中の3%ウシ血清アルブミンによる非特異的結合を10分間ブロックします。

フラッグ抗体をPBS中の3%BSAで1,000に希釈し、希釈したフラッグ抗体の30マイクロリットルをパラフィルムシートにピペットで移します。鉗子を使用してカバースリップを取り外します。ラボ用ワイプで余分なバッファーを慎重に乾かし、カバースリップをセル側を下にしてフラッグ防止溶液の上に置きます。

室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、約500マイクロリットルの1x PBSをカバースリップの細胞側に加え、溶液の上に浮かぶまで加えます。ウェルに1x PBSを入れた6ウェルプレートに戻します。

前回と同様に、パラフィルム上で二次抗体と15分間インキュベートします。前回と同様に洗浄した後、DAPI入り封入剤を用いてカバースリップを顕微鏡スライドに埋込みします。蛍光顕微鏡で細胞を可視化し、デジタルカメラで撮影します。

免疫蛍光顕微鏡を用いたところ、Gly-PUF-531を発現する多くの細胞は核DNAが断片化しており、アポトーシスを起こしていることが示されました。対照として、Gly-PUF野生型を発現する細胞は、Gly-PUF-531トランスフェクト細胞と比較して、断片化された核DNAが少なかった。ここでは、DAPI染色細胞と融合した抗フラグ抗体を用いた免疫蛍光顕微鏡により、Gly-PUF-531が主にトランスフェクション細胞の核に局在していることが示されています。

Gly-PUF野生型は、トランスフェクションされた細胞の核にも局在しており、完全にスプライシングされたmRNAが細胞質に輸送されると、これらのESFが標的から解離することを示唆しています。核DNAが断片化されたアポトーシス細胞の割合は、無作為に選択された蛍光顕微鏡画像のフィールドから測定されました。一度習得すると、RNA結合特異性を持つPUFスキャフォールドの構築は、適切に実行されれば2日で行うことができます。

このビデオを見れば、人工因子をエンジニアリングしてヒト細胞の選択的スプライシングを特異的に操作する方法を十分に理解できるはずです。