Name: 具体的にはヒト細胞における選択的スプライシングを操作するために工学人工要因 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 学ぶ人工スプライシング因子の設計法。ヒト細胞における選択的スプライシングを操作し、RNA代謝と遺伝子発現制御の研究に応用可能。がん細胞でのスプライシング制御メカニズム解明に貢献する柔軟なバイオエンジニアリング技術です。

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この作品は、NIH助成金R01-CA158283とNSFCによってサポートされていましたZWYWへの補助金31400726は若い千の才能プログラムと中国の国家自然科学基金（補助金31471235と81422038）によって運営されています。 XYは、中国のポスドク科学財団（2015M571612）によって運営されています。

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<li>Shapiro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+EMT-Driven+Alternative+Splicing+Program+Occurs+in+Human+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer.</a> PLoS Genet. 7 (8), 1002218(2011).</li>
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<li>Karni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+encoding+the+splicing+factor+SF2%2FASF+is+a+proto-oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).</li>
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著者は、開示することは何もありません。

このレポートは、標的遺伝子の選択的スプライシングを操作できる人工的なスプライシング因子の設計と建設のための詳細な説明を提供します。この方法は、カスタマイズされた特異性を有するRNA結合足場を製造するために繰り返すPUFのユニークなRNA結合モードを利用します。それは、どちらかの活性化やスプライシングを抑制するために使用することができます。 このプロトコルにおける重要なステップでのESFの特異性を規定するreprogramed PUFドメインの生成です。 PCRステッチプロトコルが開発され、PUF足場の急速な生成のために最適化されています。 1：1：その成功の鍵は、1に異なる重複テンプレートの比率を調整することです。未精製の製品は、最後のラウンドからのプライマーの汚染を持っている可能性があるため、各ラウンド後のPCR産物の精製は、も重要です。もう一つの重要なステップは、半定量的RT-PCRを用いて、スプライシング比を分析することです。一般的に、あまりにも男PCR反応を飽和させる可能性があるので、増幅サイクルは避けるべきである。スプライシングレポーターの共発現を用いた我々の実験では、2...

ほとんどのヒト遺伝子は、選択的スプライシング（AS）が大きくゲノム1,2の符号化の複雑さを増加している別個の活動で複数のアイソフォームを生成するために受けます。 ASは、遺伝子機能を調節するための主要なメカニズムを提供し、それはしっかり異なる細胞及び発達段階3において、多様な経路を介して調節される、4。スプライシング誤は、ヒト疾患5、6、7、8の一般的な原因であるので、スプライシング規制を標的とすることは、魅力的な治療の経路となってきています。 主にスプライシング規制によって制御されているような代替エキソンのスプライシングエンハンサーまたはサイレンサーとして機能するプレmRNA中（のSRE）は、シス -Elements、スプライシング調節の簡易モデルによります。目ESEのSREは、具体的には、種々のトランス -actingタンパク質因子促進またはスプライシング反応3,9を抑制（ すなわち、スプライシング因子）を募集します。ほとんどのトランス -actingのスプライシング因子は、スプライシングを制御するためにその標的とエフェクタードメインを認識するために別の配列特異的RNA結合ドメインを持っています。最もよく知られた例は、エキソン包含10を促進するN末端RNA認識エキソンスプライシングエンハンサーと結合モチーフさ（Rrms）、およびC末端RSドメインを含むセリン/アルギニンリッチ（SR）タンパク質ファミリーのメンバーであります。逆に、のhnRNP A1は、RRMドメインを介しエキソンスプライシングサイレンサーに結合し、C末端グリシンリッチドメイン11を介しエキソン包含を阻害します。そのようなモジュラー構成を使用して、研究者らは、異なるeffecと特異的RNA結合ドメイン（RBD）を組み合わせることにより、人工的なスプライシング因子を設計することができなければなりませんスプライシングを活性化または阻害するドメインを含む。 そのような設計の鍵は、プログラム可能なRNA結合特異性を有する所定の標的を認識するRBDを使用することであり、これはTALEドメインのDNA結合様式に類似している。しかしながら、ほとんどの天然スプライシング因子は、弱い親和性で短いRNAエレメントを認識し、したがって予測RNA-タンパク質認識「コード」 12を欠くRRMまたはKホモロジー（KH）ドメインを含む。 PUFリピートタンパク質（ すなわち 、PUFドメイン）のRBDは、異なるRNA標的を特異的に認識するためのPUFドメインの再設計を可能にする独自のRNA認識モードを有する13,14。カノニカルPUFドメインは3つのα-ヘリックスの8つのリピートを含み、それぞれ8-nt RNA標的の単一塩基を認識する。第2のα-ヘリックスのある位置にあるアミノ酸の側鎖は、tのワトソン - クリック端と特異的な水素結合を形成するそのRNA塩基は、各リピートのRNA結合特異性を決定する（ 図1A ）。 PUF反復のRNA塩基認識のコードは、驚くほど単純であり（ 図1A ）、可能な8塩基の組み合わせを認識するPUFドメインの生成を可能にする（WeiおよびWang 15によって総説された）。 このモジュラー設計原理により、カスタマイズされたPUFドメインとスプライシング変調ドメイン（ すなわち 、SRドメインまたはGlyリッチドメイン）からなるエンジニアリングスプライシングファクター（ESF）の生成が可能になります。これらのESFは、スプライシングアクチベーターとして、または様々なタイプのスプライシング事象を制御するインヒビターとして機能することができ、ヒト疾患に関連する内因性遺伝子のスプライシングを操作するためのツールとして有用であることが判明している16,17 。一例として、Bcl-x遺伝子のスプライシングを特異的に改変するPUF-Gly型ESFを構築した抗アポトーシス長イソ型（Bcl-xL）をアポトーシス促進性の短いアイソフォーム（Bcl-xS）に変換する。 Bcl-xアイソフォームの比をシフトさせることは、いくつかの癌細胞を複数の抗癌化学療法薬16に感作させるのに十分であり、これらの人工因子が潜在的な治療薬として有用である可能性があることを示唆している。 既知のスプライシングエフェクタードメイン（ 例えば、 RSまたはGlyリッチドメイン）によるスプライシングの制御に加えて、改変されたPUF因子を用いて、新しいスプライシング因子の活性を調べることもできる。例えば、このアプローチを用いて、いくつかのSRタンパク質のC末端ドメインが異なるプレmRNA領域18に結合する場合、RBM4のアラニンに富むモチーフがスプライシング19を阻害し得ること、およびDAZAP1のプロリンが豊富なモチーフは、スプライシングを促進することができる20,21 &lt;/ SUP&gt;。これらの新しい機能ドメインは、微調整のスプライシングには人為的な要因の追加タイプを構築するために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>High Fidelity DNA ポリメラーゼ (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>DNA ligase (T4 DNA ligase)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000)</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Reduced serum medium (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>RNA抽出バッファー(TRIzol試薬)</td><td>ambion</td><td>15596018</td><td>TRIzol試薬にはフェノールが含まれており、火傷の原因となることがあります。PBSを取り扱う際は手袋を着用してください</td></tr><tr><td>(1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase (RT)</td><td>Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-3 antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9668</td><td></td></tr><tr><td>PARP antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9542</td><td></td></tr><tr><td>Bcl-x antibody</td><td>BD Bioscience</td><td>610211</td><td></td></tr><tr><td>β-アクチン抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>α-tubulin 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>FLAG抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4042</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロース膜</td><td>Amersham-Pharmacia RPN203D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting detection reagents</td><td>Invitrogen</td><td>WP20005</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-dCTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA55021</td><td></td></tr><tr><td>蛍光活性化セルソーター(FACS)</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSCalibur&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグル」s Medium (DMEM)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム (PI)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7638-5G</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>P-4832</td><td>フィルター滅菌し、4°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>ベクター pWPXLd</td><td>Addgene</td><td>12258</td><td></td></tr><tr><td>ベクター pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>ベクター psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNase-free)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)18 Primer</td><td>Thermo Scientific</td><td>SO131&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス二次抗体(Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7076S</td><td></td></tr></tbody></table>

具体的にはヒト細胞における選択的スプライシングを操作するために工学人工要因

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

ほとんどの真核生物RNAの処理は、具体的プレmRNA標的およびエフェクタードメインに結合するRNA認識モジュールを含むモジュラー構成とRNA結合タンパク質（RBPs）によって媒介されます。以前、我々は、RNA代謝を操作するために、様々な人工RBPsを操作するために使用されたプログラム可能なRNA結合足場を生成するために、ヒトPumilio 1にPUFドメインのユニークなRNA結合モードの利点をとっています。ここでは、詳細なプロトコルは、具体的には、標的遺伝子の選択的スプライシングを調節するように設計されたエンジニアースプライシング因子（のESF）を構築することが記載されています。プロトコル設計および構築物特定のRNA標的に対するカスタマイズPUF足場を、デザイナーPUFドメインおよびエフェクタードメインを融合させることによってESF発現プラスミドを構築する方法、およびどのように標的遺伝子のスプライシングを操作するためのESFを使用する方法を含みます。この方法の代表的な結果では、我々はまた、一般的なアッセイを記載していますスプライシングレポーターを用いたESF活性の測定、培養ヒト細胞におけるESFの適用、およびその後のスプライシング変化の影響が含まれる。このレポートの詳細なプロトコールに従うことにより、異なるタイプのオルタナティブスプライシング（AS）の調節のためのESFを設計および生成し、スプライシング調節を研究する新しい戦略および異なるスプライシングアイソフォームの機能を提供することが可能である。さらに、異なる機能ドメインを設計されたPUFドメインと融合させることにより、研究者はRNAプロセシングの様々なステップを操作するために特異的RNAを標的とする人工因子を設計することができる。

この報告書は、ESFおよびスプライシングレポーターの設計および構築のための完全なプロトコールを記載する。また、内在性遺伝子のASを操作する際のESFのさらなる応用についても概説している16 。 ESFを介したスプライシングの変化の典型的な結果を説明するために、前の研究のデータを例として使用します。異なる機能ドメインを有するESFを用いて、標的カセットエキソンの包含を促進または阻害することができる（ 図 1DおよびE ）。 ESFはまた、レポーターシステム（ 図 1F ＆ G ）における代替の5 'および3'スプライス部位の使用に影響し得る。 内因性遺伝子...

このレポートは、具体的には、哺乳動物細胞において標的遺伝子のスプライシングを調節する新規な人工スプライシング因子（ASFS）を設計および構築する生物工学の方法を記載しています。この方法はさらに、RNA代謝の他の側面を操作するための様々な人工的な要因を設計するために拡張することができます。

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

このプロトコルの全体的な目標は、特定のターゲットの選択的スプライシングを特異的に操作できる人工スプライシング因子を設計することです。この方法は、がん細胞における代替スプライシングの制御や誤制御など、RNAプロセシングの分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、その柔軟性です。私たちは、任意の遺伝子における異なるタイプの代替スプライシングを促進または阻害する人工因子を設計することができます。この手順を実証するのは、私の研究室の研究員であるHuan-Huanと、私の研究室のポスドクであるQianyunです。野生型PUF DNAは、カスタマイズされたPUFドメインスキャフォールドを生成するためのテンプレートとして使用されます。各位置で異なるRNAヌクレオチドを特異的に認識するPUF配列を含むPCRプライマーを使用してください。PUFリピートごとに、4つの異なるプライマーを使用して、各位置で異なる塩基を認識します。ラウンド1のPCRでは、示されているプライマーペアを使用して、4つのPUFリピート、ユニバーサルブリッジフラグメント、およびキャップフラグメントのコード配列を生成します。ラウンド2では、最後のステップで生成したPCR産物をテンプレートとして使用し、示されているプライマーの組み合わせを使用して、RNA認識コードR-oneからR-four、およびR-fiveからR-eightのコード配列を生成します。ラウンド3では、ラウンド2とブリッジ4から5の製品をテンプレートとして使用し、R-oneフォワードプライマーとR-eightリバースプライマーを使用して、キャップなしでR-oneからR-eightのコーディングシーケンスを生成します。ラウンド4 PCRでは、R-oneからR-eight、5プライムエンドキャップ、3プライムエンドキャップをテンプレートとして使用して、完全なPUFドメインのコーディングシーケンスを生成します。HEK-293T細胞のトランスフェクションを開始するには、ボトルを穏やかに反転させてリポソームトランスフェクション試薬を混合します。次に、トランスフェクションごとに2マイクロリットルのリポソームトランスフェクション試薬を50マイクロリットルの還元血清培地で希釈します。穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートします。次に、04 マイクログラムのグリシンリッチドメイン発現ベクターと0.2マイクログラムのモジュール式スプライシングレポータープラスミドを、滅菌チューブ内の50マイクロリットルの還元血清培地に希釈します。次に、0.4マイクログラムのRSエフェクタードメイン発現ベクターと0.2マイクログラムのPGZ-threeレポータープラスミドを50マイクロリットルの還元血清培地で希釈します。最後に、0.4 マイクログラムの PGL-RS-PUF 発現ベクターと 0.2 マイクログラムの PEZ-1B または PEZ-2F レポータープラスミドを、滅菌チューブ内の 50 マイクロリットルの還元血清培地に希釈します。室温で5分間インキュベートした後、希釈したリポソームトランスフェクション試薬を希釈したプラスミド混合物と穏やかに混合します。最終混合物を室温で20分間インキュベートします。次に、発現ベクターを含むトランスフェクション混合物をHEK-293細胞を播種した24ウェルプレートの各ウェルに加え、加湿インキュベーターで摂氏37度、二酸化炭素5%の加湿インキュベーターで少なくとも12時間インキュベートします。12時間のインキュベーション後、トランスフェクションした細胞をトリプシン処理と遠心分離により回収します。遠心分離後、培地を廃棄し、チューブあたり0.5ミリリットルのRNA抽出バッファーを追加します。各サンプルに 0.5 ミリリットルの RNA 抽出バッファーあたり 0.1 ミリリットルのクロロホルムを添加します。インキュベーション後、チューブを12,000倍Gおよび摂氏4度で15分間遠心分離する。次に、水性ベースを新しいチューブに移します。最初の均質化に使用したRNA抽出バッファー0.5ミリリットルあたり0.25ミリリットルのイソプロパノールを添加します。ボルテックスで混合し、室温で10分間インキュベートします。以前と同様に遠心分離後、通常、RNA沈殿物はチューブの底に見えます。上清を捨て、RNA抽出バッファー0.5ミリリットルあたり0.5ミリリットルの75%エタノールでRNAペレットを洗浄します。激しく渦巻いてから、摂氏4度で5分間Gの7,500倍で遠心分離します。スピン後、上清を取り除き、RNAペレットを風乾します。RNAを50マイクロリットルのRNaseフリー水に溶解します。次に、各50マイクロリットルのRNA溶液に、1マイクロリットルのDNase-oneあたり5ユニットの2マイクロリットル、7マイクロリットルの10Xバッファー、および11マイクロリットルの水を追加します。インキュベーション後、溶液を摂氏70度に15分間加熱して、DNaseを不活性化します。逆転写酵素反応を行って各サンプルからcDNAを合成した後、標識PCR反応の本体の成分を画面に示されている順序でPCRチューブに加えます。サンプルごとに1つの反応を準備します。サーマルサイクラーでRT-PCRプログラムを実行します。最後に、TBEバッファーを含む10%ポリアクリルアミドゲルを介した電気泳動によりPCR産物を分離します。蛍光スキャナーを使用して製品を視覚化し、デンシトメトリーソフトウェアを使用してスプライシングされた各アイソフォームの量を測定します。アポトーシスを測定するための免疫蛍光アッセイでは、前述したようにグリシンリッチドメイン発現プラスミドを含むトランスフェクションミックスを調製し、ポリリジンコーティングされたガラスカバー上に増殖したHeLa細胞を6ウェルプレートに入れます。トランスフェクションの24時間後、カバースリップ上の細胞を1ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドで1x PBS溶液で室温で20分間固定します。次に、カバースリップ上の細胞を2ミリリットルの1x PBSで5分間静かに洗います。次に、0.2%Triton X-100を1x PBS溶液中で10分間細胞に透過処理します。前回と同様に1x PBSで3回洗浄した後、1x PBS中の3%ウシ血清アルブミンによる非特異的結合を10分間ブロックします。フラッグ抗体をPBS中の3%BSAで1,000に希釈し、希釈したフラッグ抗体の30マイクロリットルをパラフィルムシートにピペットで移します。鉗子を使用してカバースリップを取り外します。ラボ用ワイプで余分なバッファーを慎重に乾かし、カバースリップをセル側を下にしてフラッグ防止溶液の上に置きます。室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、約500マイクロリットルの1x PBSをカバースリップの細胞側に加え、溶液の上に浮かぶまで加えます。ウェルに1x PBSを入れた6ウェルプレートに戻します。前回と同様に、パラフィルム上で二次抗体と15分間インキュベートします。前回と同様に洗浄した後、DAPI入り封入剤を用いてカバースリップを顕微鏡スライドに埋込みします。蛍光顕微鏡で細胞を可視化し、デジタルカメラで撮影します。免疫蛍光顕微鏡を用いたところ、Gly-PUF-531を発現する多くの細胞は核DNAが断片化しており、アポトーシスを起こしていることが示されました。対照として、Gly-PUF野生型を発現する細胞は、Gly-PUF-531トランスフェクト細胞と比較して、断片化された核DNAが少なかった。ここでは、DAPI染色細胞と融合した抗フラグ抗体を用いた免疫蛍光顕微鏡により、Gly-PUF-531が主にトランスフェクション細胞の核に局在していることが示されています。Gly-PUF野生型は、トランスフェクションされた細胞の核にも局在しており、完全にスプライシングされたmRNAが細胞質に輸送されると、これらのESFが標的から解離することを示唆しています。核DNAが断片化されたアポトーシス細胞の割合は、無作為に選択された蛍光顕微鏡画像のフィールドから測定されました。一度習得すると、RNA結合特異性を持つPUFスキャフォールドの構築は、適切に実行されれば2日で行うことができます。このビデオを見れば、人工因子をエンジニアリングしてヒト細胞の選択的スプライシングを特異的に操作する方法を十分に理解できるはずです。

engineering-artificial-factors-to-specifically-manipulate-alternative

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

選択的スプライシング制御は、さまざまな生理学的および病理学的プロセスにおける必須の細胞プログラムである上皮間葉転換(EMT)に寄与することが示されています。ここでは、EMT中の選択的スプライシングの検出に誘導性EMTモデルを利用する方法について説明します。...

上皮間葉転移の間の選択的スプライシングの検出

ここでは、固形腫瘍および血液悪性腫瘍における薬剤耐性に異常なスプライシングの影響を調査することを目的とプロトコルについて説明します。この目標のために、我々は、RNA-seqのを介してin vitroモデルにおける親及び抵抗性のトランスクリプトームプロフィールを分析し、候補遺伝子を検証するための定量RT-PCRベースの方法を確立しました。...

に薬剤耐性に関連する新規スプライス変異体を検出するために、RNA配列決定を使用して、<em&gt;インビトロ</em&gt;がんモデル

その場で交配 (っぽい) プロトコル マウス脳セクションの代替の Pre-mrna スプライシング パターンを検出する短いアンチセンス...

代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

円形RNAを生成するレポーター遺伝子のクローン化と解析を行います。これらのレポーター遺伝子は、線形スプライシングを解析する構築物よりも大きく、Alu要素を含んでいます。円形RNAを調べるため、細胞にトランスフェクトされ、リニアRNAを除去した後にRT-PCRを用いてRNAを解析します。...

円形RNA解析に対する小遺伝子を含むAlu要素の使用

このプロトコルは、皮膚線維芽細胞を筋芽細胞に変換し、その分化を筋管に変換することを記述する。細胞株は神経筋疾患の患者に由来し、病理学的メカニズムを調査し、治療戦略をテストするために使用することができる。...

神経筋障害の治療法を調査するヒト線維芽細胞の筋芽細胞への直接リプログラミング

このプロトコルは、化学療法治療後の代替スプライシング調節において特徴のない機能を有するタンパク質の役割を評価するための迅速かつ有用なツールを提示する。...

E1Aミニジーンツールを使用したmRNAスプライシング変更の研究

選択的スプライシング(AS)および選択的ポリアデニル化(APA)は、転写産物アイソフォームとその産物の多様性を拡大します。ここでは、バルクRNA-seqを分析するためのバイオインフォマティクスプロトコルと、実験条件によって変化するASおよびAPAを検出および視覚化するための3'エンドシーケンシングアッセイについて説明します。...

RNA-seqデータにおける選択的スプライシングおよびポリアデニル化の同定(英語)

このプロトコルは、スプライシングに対する5'-スプライス部位変異の影響をモニターするためのミニジーンレポーターアッセイを記述し、変異誘発スプライシング阻害のレスキューのためのサプレッサーU1 snRNAを開発する。レポーターおよびサプレッサーU1...

スプライシング効率を監視するためのレポーターベースの細胞アッセイ

造血幹細胞生物学および造血悪性腫瘍をよりよく研究するためには、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の体細胞変異を忠実にモデル化するための新しい戦略が必要です。ここでは、CRISPR/Cas9とデュアルrAAVドナー形質導入の使用を組み合わせることにより、HSPCにおけるヘテロ接合機能獲得変異をモデル化するためのプロトコルについて説明します。...

ヒト造血幹細胞および前駆細胞における発癌性ヘテロ接合性機能獲得変異の改変

このプロトコルは、効率的に新たに単離されたヒト絨毛細胞栄養芽層でのsiRNAのトランスフェクションマイクロポを使用して、これらの細胞におけるDNA-タンパク質複合体を同定するための方法が記載されています。トランスフェクトされた細胞は、ウェスタンブロットによりモニターすることができ、EMSAは、4日間の培養期間中に分析します。...

新たに単離したヒト絨毛細胞栄養芽層に対するsiRNAトランスフェクションおよびEMSA分析

学ぶ人工スプライシング因子の設計法。ヒト細胞における選択的スプライシングを操作し、RNA代謝と遺伝子発現制御の研究に応用可能。がん細胞でのスプライシング制御メカニズム解明に貢献する柔軟なバイオエンジニアリング技術です。

具体的にはヒト細胞における選択的スプライシングを操作するために工学人工要因

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