足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成しますインビトロ

この技術の全体的な目標は、in vitroで脂質-近位タンパク質-タンパク質相互作用を捕捉することです。この方法は、ミトコンドリア外膜でのタンパク質間相互作用がアクセサリー脂質によってどのように影響を受けるかなど、ミトコンドリアダイナミクス分野の質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、可溶性タンパク質ドメインを脂質テンプレートにテザリングすることで、よりネイティブな確認を確実に達成できることです。

さらに、可溶性タンパク質とそのつながれたパートナーとの間の複雑な相互作用は、定義された脂質補因子の存在下で評価できます。この方法は、ミトコンドリア分裂機構におけるタンパク質相互作用の研究に用いていますが、多様な膜コンパートメントに局在する他のタンパク質複合体にも適用できます。この手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるライアンです。

まず、目的の脂質のクロロホルム溶液をきれいなガラス試験管に混ぜ合わせます。チューブを回転させながら乾燥窒素ガスで溶媒を蒸発させ、薄い脂質膜を形成します。次に、遠心蒸発器で残留溶媒を摂氏37度で1時間除去します。

これに続いて、予熱したバッファーAを添加して、最終脂質濃度を1〜2ミリモルにします。摂氏37度で30分間インキュベートし、時折ボルテックスを起こして脂質混合物を完全に再懸濁します。インキュベーション後、脂質混合物をプラスチック試験管に移し、完全に凍結するまでチューブを液体窒素に約30秒間置きます。

次に、チューブを摂氏37度のウォーターバスに1〜2分間入れ、完全に解凍します。次に、バッファーAに4つのフィルターサポートとポリカーボネートフィルターを浸漬し、メーカーの指示に従って押出機を組み立てて、脂質押出機を準備します。脂質溶液を穏やかで一定の圧力を使用してフィルターに21回押し出し、均一なサイズ分布を確保します。

押し出し中は、リポソームサイズの均一性を確保するために、ゆっくりとした一定圧力を使用してください。1ミクロンのフィルターでは、これはそれほど重要ではありません。しかし、フィルターサイズが小さいと、より明白な不均一性が生じる可能性があります。

押し出されたリポソームを摂氏4度で保管します。Hisタグ付きミトコンドリア分裂因子またはMffを足場リポソームと室温で少なくとも15分間、バッファーAおよびBMEでインキュベートします。Mffフリーコントロールの場合は、GFPなどのHisタグ付きコントロールタンパク質とリポソームをインキュベートして、露光されたNickel-NTAに結合してシールドします。

リポソーム混合物にダイナミン関連タンパク質OneまたはDrp1を添加し、室温で1時間インキュベートします。次に、サンプルの5マイクロリットルを実験用フィルムのシートに移し、サンプルの上にカーボンコーティングされた銅-ロジウムグリッドを置きます。1分間インキュベートした後、余分な液体を濾紙で取り除き、2%酢酸ウラニルを一滴加えます。

さらに1分間インキュベートした後、濾紙で余分な汚れを取り除き、サンプルをグリッドボックスに移します。翌日、透過型電子顕微鏡を使用して18,500〜30,000倍の倍率でサンプルを画像化し、タンパク質とリポソームの形態の超微細構造の変化を観察します。Hisタグ付きMffおよびFis1を足場リポソームと室温で15分間、バッファーAおよびBME中でインキュベー

Drp1を添加し、各混合物を室温でさらに15分間インキュベートします。チューブを摂氏37度に設定されたサーモサイクラーに移し、GTPと塩化マグネシウムを加えて反応を開始します。所望の時点で、各反応混合物の20マイクロリットルを、5マイクロリットルの0.5モルEDTAを含むマイクロタイタープレートのウェルに移し、マグネシウムをキレート化して反応を停止します。

これに続いて、リン酸カリウムをバッファーAおよびBMEで希釈して結果を較正することにより、一連のリン酸塩標準試料を調製します。5マイクロリットルの0.5モルEDTAを含むウェルに、各標準液の20マイクロリットルを加えます。各ウェルに150マイクロリットルのマラカイトグリーン試薬を加えます。

最後に、各追加から5分後にOD 650を読み取ります。GTPは、酸性のマラカイトグリーン試薬の存在下でゆっくりと加水分解します。したがって、この試薬は、吸光度を測定してから10分以内にすべてのサンプルウェルに追加して、S/N比を最大化する必要があります。

Drp1に存在しない場合、MffもGFPも膜変形をもたらさなかった。また、GFPで装飾された濃縮スキャフォールドリポソームまたはESLでは、特徴のないリポソームのみが観察されました。しかし、Drp1がMffで装飾されたESLテンプレートに追加されたとき、リポソームの改造は明らかでした。

MffによるSLの装飾はGTPase活性を強化しました。逆に、曝露されたNTAヘッドグループをHisタグ付きGFPでブロックすると、この増強されたGTPase活性が解消されました。SLへの膜貫通ドメインを欠くFis1のテザリングも、Drp1のGTPase活性の刺激を引き出すことができませんでした。

SLと同様に、Drp1にSL/Clを添加すると、GTPase活性がわずかに刺激されましたが、Hisタグ付きFis1またはGFPをリポソームにテザリングすることで逆転しました。Drp1をMffで装飾したSL/CLとインキュベートすると、Drp1のGTPase活性が2.6倍に刺激されたため、Mffとカルジオリピンの相乗効果が観察されました。SL/PE/CLテンプレートをMffで装飾すると、Drp1の活性が向上しました。

Drp1がリポソームを脂質細管にリモデリングする能力は、足場リポソームにPEを添加することによって増強されました。習得すると、これらの足場は、手順が適切に実行されれば、数時間で準備して使用できます。この手順に続いて、機能的相互作用を特徴付けるために、沈降や光散乱アッセイなどの他のタンパク質および脂質相互作用法を実施できます。

この技術を応用することで、タンパク質が定義された生体膜への転座を調べることで、一過性のタンパク質相互作用や、重要な細胞集合体の形成と安定化における特定の脂質補因子の影響を探ることができます。