3Dホール・ハート心筋組織の分析

ナレーター}このプロトコルの全体的な目標は、梗塞境界ゾーンへの心筋内注射のターゲティング精度を評価するために使用できる、3D全心組織処理のための構造化された再現性のある方法を促進することです。この方法は、診療開発や注射技術の最適化など、心臓再生医療分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、3D全身組織処理のための標準化された再現性のある方法を提供することです。

この技術の意味は、心臓再生療法の開発と、通常の送達技術の注射精度の検証にまで及びます。この心臓幹細胞療法の目的は、梗塞境界帯に細胞を注入して、局所血管形成と心筋細胞の保護を刺激することです。拡張期末期に心臓を捉えるには、練習と忍耐が必要です。

これらの手順を視覚的に示しておくことが重要です。まず、マイクロビーズを注入した心臓から心膜を分離し、心房と心室を無傷に保ちます。すべての組織を切除したら、クリンケンベルグハサミを使用して、大動脈弁の約1センチメートル上の上行大動脈を解剖し、アトリウムから約1センチメートルの下大静脈と肺静脈を切断します。

浮遊を防ぐために心臓の頂点をプラスチック埋め込み容器の底に固定した後、大動脈の残りの部分を通して容器の縁に2-0縫合糸を配置し、心臓を固定します。心臓が中央にあり、容器の壁に触れないように注意してください。臓器が拡張末期のような形状に固定されている場合は、蚊クランプを使用して下大静脈をつかみ、50ミリリットルの注射器を使用して、新たに準備した50〜60°Cの寒天を上大静脈を介して右心房にゆっくりと注入します右心房と心室の両方が完全に満たされるまで。

拡張末期の形状にできるだけ近い埋め込み心臓を得るには、左心室頂点を容器の底に固定し、肺静脈を固定しながら右心室を寒天で満たします。次に、肺静脈に蚊クランプを装着し、新しい寒天で満たされた50ミリリットルの注射器を大動脈弁を逆行方向に静かに通過させます。心室と左心房が完全にいっぱいになるまで、溶液を左心室にゆっくりと注入し、左心室が満たされたら大動脈を締めます。.

次に、心臓が完全に覆われるまで残りの寒天を容器に注ぎ、画像レジストレーション中の参照構造として機能するように、埋め込み容器内に2本の硬質プラスチックチューブを配置します。次に、心臓を摂氏2〜7度に少なくとも4時間置き、寒天を固めます。磁気共鳴画像法の後、容器を逆さまにし、寒天と容器の側面との間に空気を入れて、固体の寒天溶液と心臓を容器から取り出します。

プラスチック棒を取り外します。次に、ミートスライサーを使用して、寒天ブロックと心臓を頂点から心臓の基部まで5ミリメートルのスライスに分割し、寒天ブロックの底部と平行に切断して、スライスの角度を取得した磁気共鳴画像と同じに保ちます。すべてのスライスが得られたら、組織サンプルをTTCで染色します。

15分後、スライスの両側を垂直な角度で撮影し、0.9%生理食塩水で切片を注意深くすすいでください。蛍光顕微鏡でサンプルをイメージングするには、可変モードスキャナーで蛍光モードイメージングを選択し、ピクセルサイズを100 x 100ミクロンに設定します。最初のフィルター ブロックでは、チャネル 1 のビーズ蛍光の発光波長とオーバーラップするバンド パス フィルターを選択し、次にチャネル 2 の発光波長の外側にある 2 番目のフィルター ブロックのバンド パス フィルターを選択します。

次に、適切なフィルターブロックを選択し、光電子増倍管を適切な電圧に設定し、励起レーザーを注入したマイクロビーズの励起波長に最も近い波長に設定します。すべての画像を取得したら、適切な後処理ソフトウェアで、磁気共鳴画像で心筋と心内膜および心外膜の左心室の境界をセグメント化し、続いて蛍光画像で心筋と注射部位を同様にセグメント化します。次に、スライスの両側から画像登録されたセグメントを線形補間して、元のサンプルの厚さを再構築し、データの3Dモデルを作成します。

今示したように、心臓を拡張期末端のような形状に固定すると、この代表的な実験では、寒天が心臓組織にうまく付着し、組織を同じスライス厚さで所望の角度でスライスすることができました。2D蛍光画像と磁気共鳴画像の両方で、瘢痕と注射部位ははっきりと区別されます。TTC染色組織および後期ガドリニウム増強磁気共鳴画像は、蛍光イメージングにおける瘢痕評価のコントロールを提供します。

ポストプロセッシングイメージングは、セグメンテーションと蛍光画像に基づいてex vivo心臓の3D形状を再構築することを可能にし、3D注入精度の評価を可能にします。この研究では、注射沈着物と梗塞境界帯を心内壁に保護し、心内膜表面の突起間の距離を測定しました。この手順に続いて、外科的評価、梗塞サイズの定量化、または他の3次元イメージングモダリティの検証などの他の方法を実行できます。

この手法を使用して、梗塞境界ゾーンへの注射の精度を評価しました。本研究は、心不全に対する心血管再生治療の改善を目的として実施された。このビデオを見れば、心臓の準備方法、心臓組織の埋め込みと処理の方法、心臓組織サンプルの蛍光イメージングの方法について十分に理解できるはずです。