Name: 単一分子力分光法を用いて無機材料とアミノ酸とペプチドの相互作用への洞察 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 学ぶ単一分子力分光法を用いて無機材料とアミノ酸・ペプチドの相互作用を測定する手法。AFMを活用した分子レベルでの付着力測定により、表面化学と材料開発の知見を深めることができます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業は、マリー・キュリー国際再統合助成金(EP7)の支援を受けました。P.D.は、イスラエル高等教育評議会の支援に感謝します。

1.ヒント修正<ol><li>購入窒化シリコン（Si 3 N 4）、シリコンチップとAFMカンチレバー（〜2nmの公称カンチレバー半径）。 </li><li> 20分間無水エタノールに浸漬して、各AFMカンチレバーを清掃してください。室温で乾燥しました。その後、5分間O 2プラズマにそれらを暴露することによってカンチレバーを扱います。 </li><li> 15の割合で（3センチ）を含む溶液メチルトリエトキシシラン、3-（アミノプロピル）トリエトキシシラン上記のきれいなヒントをサスペンド：1（v / v）の不活性雰囲気（窒素やアルゴンのいずれか）の下でデシケーター中とにデシケーターを接続真空ポンプ。混合したシラン化合物のこれら2つのタイプの単層を形成するために2時間真空。 </li><li>ホットプレート上でのヒントを配置する（このプロセスのために作製）金属製のチップホルダーを使用します。その後、大気条件下で、70℃で10分間のヒントを乾燥させます。使用前に、エタノールを使用して、ホットプレート、金属製のホルダーとピンセットを清掃してください。 </li><li>部屋tでのヒントをクールemperature、その後で1時間、0.5％（v / v）のトリエチルアミンを含有するクロロホルム中の5 mMの濃度で、フルオレ-PEG-N-ヒドロキシカルボニル（Fmoc-PEG-NHS、MW 5,000 Da）での溶液にチップを浸漬室温。 </li><li> 5分間クロロホルムでヒントを浸漬した後、さらに5分間、ジメチルホルムアミド（DMF）中に浸します。結合したPEG分子のFmoc基を脱保護するために、30分間DMF中の20％ピペリジン（v / v）の中にヒントを浸します。 4分間DMF中でチップを浸漬した後、N-メチル-2-ピロリドン（NMP）中でさらに4分間。 3回浸漬シーケンシャルを繰り返します。 </li><li>アミノ酸のカップリングのために、N末端保護アミノ酸（AA）/ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）/ 2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムhexafluophosphateを含む溶液にチップを浸漬1.5時間5mLのNMP中の30mMの総濃度で、1：1：1のモル比で（HBTU）。 </li><li>ペプチドカップリングのために、5 mL溶液の続きにヒントを浸し保護されたペプチド40mgのaining（N末端及び側鎖、例えばのFmoc-Glnを（Trtの）-Pro-ALA-のSer（tBuで）-Ser（tBuで）-Arg（PBF）-Tyr（tBuで）-COOHを。） 、15mgの2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）、および2時間NMP中DIPEA 5mLの。 </li><li> 4分間のNMP中のヒントを浸します。 1及びNMP中0.65 Mの合計濃度：次に、アセチル基によってリーマ無料/未反応NH 2を保護するために、モル比4で無水酢酸/ DIPEAの混合物中で30分間のヒントを浸します。 </li><li> ペプチドカップリングのために、二つの追加の手順を実行します。 <ol><li> 、ペプチドの側鎖を脱保護し、1時間、95％TFA、2.5％のトリイソプロピルシラン、2.5％の水を含む溶液にチップを浸漬し、次いで、クロロホルムおよびDMFで洗浄するためです。 </li><li> 30分間DMF中の20％ピペリジン（v / v）の中にチップを、ペプチドのFmoc基を除去浸漬するためです。 </li></ol></li><li>順次ペプチド/アミノ酸 - 官能ディップDMF（ペプチド）またはNMP（アミノ酸など）、クロロホルム、50％のエタノールと水の4つの分間、Dヒント。最後に、空気中のチップを乾燥させます。 </li></ol> 2.表面の準備<ol><li>マイカを準備します。スコッチテープを使用して、各使用前に基質（9.9ミリメートルの直径）を切断します。その後、三重蒸留水（TDW）で表面を洗います。 </li><li> TiO 2被覆シリコンを準備します。 <ol><li>ダイヤモンドペンを用いて2cmの正方形にシリコンウェハ（100）を切断します。 </li><li>アセトンを充填した15mLの試験管内に基板を配置し、超音波浴中で5分間、それを超音波処理します。次いで、イソプロパノールを充填した15 mLの試験管にこの表面を置き、5分間、それを超音波処理。窒素を使用して基板を乾燥させます。 </li><li> 5％（重量/容量）溶液を調製し、エタノール中の界面活性剤（ 例えば 、BYK-348）を溶解します。その後、2 mLの30の％のTiO 2分散液に界面活性剤溶液の0.02 mLを加え。 </li><li>得られた溶液から、ドロップキャスト0を。清浄なSi基板上に2 mLです。 </li><li>空気中で2時間、250℃でこれらのドロップキャスト表面をアニール。 41 </li></ol></li></ol> 3.シングル分子力分光測定<ol><li>市販の二成分接着剤でAFMの金属製のホルダーに所望の表面を取り付けます。小さなペトリ皿のように形作られているAFM、ガラスホルダーに金属製のホルダーを配置します。トリス緩衝液（50mMのpH = 7.4）、または任意の媒体と、このホルダーを記入してください。そして、チップホルダ以下AFMステージ上にホルダーを配置します。 </li><li>約10％の絶対的な不確実性（AFMソフトウェアに含まれる）熱揺らぎ法26を使用して10から30 PN / nmの範囲のバネ定数とAFMカンチレバーのキャリブレーションを行います。 </li><li>それが圧縮された基板に接触するまで、基板にアミノ酸又はペプチド官能先端に近づくことにより、相互作用の力を測定〜200 pNでの力と直ちに〜200nmの距離のために、0.1〜0.8ミクロン/秒から、様々な速度で先端を撤回。 </li></ol> 4.データ解析<ol><li>フォトダイオードの感度（V / m）を乗算し、実験的に決定されたばね定数を使用して強制的に偏向値（V）に変換します。 42これは、AFMソフトウェアによって自動的に行われます。 <ol><li> 1単一分子イベントとFD曲線を得るためには、曲線の数百（800-1,500）を記録。単一分子曲線に2つのピークを取得します。最初のピークは、表面と分子の特異的な相互作用に先端部と表面と第2のピークに相当するとの間の非特異的な相互作用を示しています。 FD曲線は、これら2つのピークを超えて含有する場合、最も可能性の力の計算からそれらを捨てます。 注：つだけ接着イベントは（曲線の10〜30％の）考慮されます。 43 </li></ol></li><li&gt;は、その後のヒストグラムを調製するために使用された積載率のセットを取得する直前に破裂に明らか負荷率、ワームのようなチェーン（WLC）モデル44との距離曲線対フィット少なくとも50の力を計算するために、見かけの負荷率。基板からカンチレバーを分離した後力のジャンプからのペプチド/アミノ酸と表面との間のバインド解除力を求めよ。 </li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

1.3の手順、プロトコル1.4と1.7は、大規模な注意を払って、非常に穏やかな方法で行われるべきです。ステップ1.3において、チップは、シラン混合物と接触してはならず、シラン化処理は、不活性雰囲気（無水）で行われるべきです。 45これは、多層の形成を防止するために、シラン分子が容易に水分の存在下で加水分解を受けるために行われます。 45 ステップ1.4で、温度と時間が適切に保たれるべきです。ステップ1.5を開始する前に、チップを室温まで冷却されるべきです。それ以外の場合は破損します。カップリング工程（1.7）において、HBTU及び検査アミノ酸またはペプチドは、完全に混合物中に溶解されるべきです。カップリングの後、別の溶媒を用いてチップを洗浄する先端への損傷を避けるために、非常に穏やかな方法で行われるべきです。 報告された技術は、APPLことができます任意のペプチドまたはアミノ酸にIED。シリコンチップを変更するには、我々はシランを...

タンパク質および無機鉱物との間の相互作用は、独特の特性を有する複合材料の構築につながります。これは、高い機械的強度、または独自の光学特性を有する材料を含みます。例えば、 図1、 図2は 、鉱物ヒドロキシアパタイトとタンパク質コラーゲンの組み合わせは、異なる機能のための軟質または硬質の骨のいずれかを生成します。 3短いペプチドはまた、特異性の高い無機材料をバインドすることができます。 4、5、これらのペプチドの6特異性は、結晶を成長させる、9ナノ構造材料を製造する、8、7、新たな磁気及び電子材料を設計するために使用されています、 10とナノ粒子を合成します。 図11は、ペプチドまたはタンパク質と無機材料との間の相互作用の根底にあるメカニズムを理解することは、したがって、私たちは改善された吸着特性を持つ新しい複合材料を設計することができるようになります。免疫応答とインプラントの間期は、タンパク質によって媒介されるので、また、より良い無機物質とタンパク質の相互作用を理解することは、インプラントを設計する当社の能力を向上させます。無機表面と相互作用するタンパク質が関与するもう一つの重要な領域は、防汚材料の製造です。 12、13、14、15生物付着生物が表面に付着する望ましくないプロセスです。それは私たちの生活に多くの有害な影響を与えます。例えば、医療機器上の細菌の生物付着は、院内感染につながります。ボートや大型船舶の海洋生物の生物付着が増加します<html>燃料の消費量。 12、16、17、18 単一分子力分光法（SMFS）は、AFMを用いて、直接アミノ酸または基質とペプチドの間の相互作用を測定することができます。このようなファージディスプレイ、27、28と19、20、21、22、23、24、25、26他の方法 水晶微量天秤（QCM）29または表面プラズモン共鳴（SPR）29、30、31、32、REF &quot;&gt; 33小節バルク中の無機表面へのペプチドおよびタンパク質の相互作用。34、35、36 これは、これらの方法により得られた結果は、分子または凝集体の集合に関連することを意味します。 SMFSでは、1つまたは非常に少数の分子は、AFMチップに固定されており、所望の基材との相互作用が測定されます。このアプローチは、表面からのタンパク質を引っ張ることによって、タンパク質のフォールディングを研究するために拡張することができます。また、細胞タンパク質およびそれらのリガンドに対する抗体の結合との間の相互作用を測定することができます。 37、38、39、40本稿では、シラノール化学を用いてAFMチップにペプチドまたはアミノ酸のいずれかを接続する方法を詳細に説明しています。また、紙は力の測定を実行する方法および分析する方法について説明します結果。

<table><tbody><tr><td>窒化ケイ素 (Si3N4) シリコンチップ付き AFM カンチレバー</td><td>Bruker (Camarilo, CA, USA)</td><td></td><td>MSNL10, 公称カンチレバー半径 ~2 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>メチルトリエトキシシラン&nbsp;</td><td>Acros Organics(ニュージャージー州、米国)</td><td></td><td>AFMチップのSilaylation&nbsp;</td></tr><tr><td>3-(アミノプロピル)トリエトキシシラン</td><td>Sigma-Aldrich(エルサレム、イスラエル)</td><td></td><td>AFMチップのシレイ化用</td></tr><tr><td>トリイソプロピルシラン</td><td>Sigma-Aldrich(エルサレム、イスラエル)</td><td></td><td>ペプチド脱保護に使用</td></tr><tr><td>N-エチルジイソプロピルアミン</td><td>Alfa-Aesar(ランカシャー、英国</td><td></td>)<td>チップ修飾に使用</td></tr><tr><td>トリエチルアミン</td><td>Alfa-Aesar(ランカシャー、英国)</td><td></td><td>チップに使用修飾</td></tr><tr><td>ピペリジン</td><td>アルファ-エーザール(ランカシャー、英国)</td><td></td><td>先端のFmoc脱保護フル</td></tr><tr><td>オレニルメチルオキシカルボニル-PEG-N-ヒドロキシスクシンイミドに使用&nbsp;(FMOC-PEG-NHS)</td><td>Iris Biotech GmbH(ドイツ、ドイツ)</td><td></td><td>共有結合フレキシブルリンカーとして使用&nbsp;(MW=5,000 Da)</td></tr><tr><td>2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3,-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸(HBTU)</td><td>Alfa Aser(Heysham, England)</td><td></td>カップリング<td>試薬として使用。&nbsp;</td></tr><tr><td>N-メチル-2-ピロリドン (NMP)</td><td>Acros Organics(ニュージャージー州、米国)</td><td></td><td>チップ修正手順の溶媒として使用</td></tr><tr><td>DMF(ジメチルホルムアミド)</td><td>Merck(ダルムシュタット、ドイツ)</td><td></td><td>チップ修正手順の溶媒として使用</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>バイオラボ(エルサレム、イスラエル)</td><td></td><td>チップ修正手順の溶媒として使用</td></tr><tr><td>エタノール(無水)</td><td>ガドット(ネタニヤ、イスラエル)</td><td></td><td>チップ修飾手順の溶媒として使用されます</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸 (TFA)</td><td>メルク (ダルムシュタット、ドイツ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>無水酢酸</td><td>メルク (ダルムシュタット、ドイツ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペプチドGL</td><td>Biochem (上海、中国)。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フェニルアラニンとチロシン&nbsp;</td><td>Biochem (ドイツ、ダルムシュタット)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>溶剤2-(2メトキシエトキシ)エタノール（DEGME)とエチル3-エトキシプロピオネート（EEP）</td>Applied <td>Vision Laboratories（エルサレム</td>）(イスラエル）)(<td></td>30%)の混合物中の30%TiO2分散液 溶<td>媒2-(2メトキシエトキシ)エタノール）(DEGME)とエチル3-エトキシプロピオン酸）の混合物中。TiO2基板調製に使用</td></tr><tr><td>マイカ基板</td><td>TED PELLA, INC.(米国カリフォルニア州レディング)</td><td></td><td>直径9.9mm</td></tr></tbody></table>

単一分子力分光法を用いて無機材料とアミノ酸とペプチドの相互作用への洞察

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

タンパク質またはペプチドと無機材料との間の相互作用は、いくつかの興味深いプロセスにつながります。例えば、無機物でタンパク質を結合する独特の特性を有する複合材料の形成をもたらします。また、生物付着の好ましくないプロセスが表面上の生体分子、主にタンパク質の吸着によって開始されます。この有機層は、細菌のための接着層であり、それらは表面と相互作用することを可能にします。有機 - 無機界面での相互作用を支配する基本的な力を理解することは、研究の多くの分野のためには重要であると、光学機械的および生物医学的用途のための新しい材料の設計につながる可能性があります。本稿では、ペプチドまたはアミノ酸と明確に定義された無機表面のいずれかとの間の接着力を測定するために、AFMを利用して単一分子力分光法の技法を示しています。この技術は、AFMに生体分子を付着するためのプロトコルを含みます原子間力顕微鏡による共有結合柔軟なリンカーおよび単一分子力分光測定を通じて先端。また、これらの測定値の分析が含まれます。

図1は、先端変更手順を示します。第1のステップでは、プラズマ処理は、窒化シリコンチップの表面を変化させます。先端はOH基を提示します。これらのグループはその後、シランと反応します。このステップの終了時に、チップの表面は、遊離-NH 2基により覆われます。これらの遊離アミンは、その後のFmoc -PEG-NHS、共有結合性リンカーと反応します。 PEGリンカーのFmoc基をpipyridine、脱保護試薬により除去されます。最後に、検査したアミノ酸又はペプチド分子がカップリング試薬HBTUを用いてPEGの遊離アミン基を介して結合されています。 修正されたAFMチップを、表面（ 図2）を有するアミノ酸又はペプチドの相互作用を調べることができます。 PEG分子は、先端から、ペプチドまたはアミノ酸を分離し、それらを自由に配向させることができます。典型的な力measuフォ...

ここでは、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、単一分子力分光測定によって明確に定義された無機表面のいずれかのペプチドまたはアミノ酸との間の相互作用の力を測定するためのプロトコルを提示します。測定から得られた情報は、より良好なペプチド無機材料相間を理解することが重要です。

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

単一分子力分光法の全体的な目標は、異なる表面を持つアミノ酸またはペプチド間の相互作用の接着力と性質を決定することです。この問題は、表面化学の分野における重要な質問に答えるのに役立ち、新しい複合材料や脊索動物の開発に使用できます。この手法の主な利点は、目的の分子と表面との間の相互作用に関する情報を単一分子レベルで提供できることです。まず、公称カンチレバー半径が2ナノメートルのシリコンチップを備えた窒化ケイ素AFMカンチレバーを購入します。先端をホルダーに取り付けます。各AFMカンチレバーをエタノールに20分間浸して洗浄し、室温で乾燥させます。次に、チップをプラズマチャンバーに入れ、カンチレバーを酸素プラズマに5分間さらして処理します。メチルトリエトキシシラン15部とアミノプロピルトリエトキシシラン1部を含む溶液を準備し、不活性雰囲気下で溶液の3センチメートル上にキャニレバーを懸濁します。チップとホルダーがシラン混合物に触れないことが重要です。さらに、シランは水分に非常に敏感であるため、これらのチップは不活性雰囲気で実行する必要があります。密封したら、デシケーターを真空ポンプに接続し、真空を2時間かけてカンチレバーの表面に2種類の混合シラン化合物の単層を形成します。先端を慎重に取り外し、摂氏70度に予熱したホットプレートに置きます。チップを10分間乾燥させます。チップを室温で冷却してから、Fmoc-PEG-NHSの溶液に室温で1時間浸します。次に、チップをクロロホルムに5分間浸し、次にDMFにさらに5分間浸します。DMFでのインキュベーション後、付着したPEG分子のFmoc基をDMF中の20%ピペリジン溶液に30分間浸して、Fmoc基を脱保護します。再度、チップをDMFに4分間浸し、次にN-メチル-2-ピロリドンにさらに4分間浸します。先端にアミノ酸を結合するには、総濃度30ミリモルと5ミリリットルのN-メチル-2-ピロリドンのアミノ酸カップリング溶液に1時間半浸します。アセチル基によって残りの遊離または未反応のPEG残基を保護するために、4部の無水酢酸と1部のジイソプロピルエチルアミンとN-メチル-2-ピロリドンの0.65モル混合物にチップを30分間浸します。次に、ペプチドアミノ酸官能基チップをNMP、クロロホルム、50%エタノール、および水にそれぞれ4分間連続して浸し、最終的にチップを空気中で乾燥させます。所望の試験面を、市販のエポキシでAFMの金属ホルダーに取り付けます。次に、金属製のホルダーを、小さなシャーレの形をしたAFMのガラスホルダーに入れます。ガラスホルダーにTRISバッファーを入れます。次に、金属製のホルダーをAFMステージのチップホルダーの下に置きます。次に、AFMチップをAFMの光学ガラスに取り付けます。光学ガラスブロックをAFMヘッドに配置します。そして、AFMヘッドをステージに置きます。次に、ナノメートルあたり10〜30ピコニュートンの範囲のスプリング定数でAFMカンチレバーを校正します。一般的な力の測定では、ここに示すような力の距離曲線が得られます。最初のピークは、チップと表面との間の非特異的な相互作用を示し、2番目のピークは特定の接着イベントを指します。数百の力距離曲線から、接着イベントの数と力をプロットすることでヒストグラムを構築することができます。これらのヒストグラムにガウス近似を適用すると、最も可能性の高い力が決定されます。このビデオを見れば、アミノ酸やペプチドを用いてAFMチップを化学的に修飾する方法や、AFMを用いて単一分子力分光法を行う方法について、十分に理解できるはずです。

insights-into-interactions-amino-acids-peptides-with-inorganic

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

この記事では、高度に並列化可能な方法で単一分子レベルでのタンパク質分解酵素に作用する力の影響を研究するために磁気ピンセットの使用方法について説明します。...

磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

セルロソームは、セルロースを消化するために設計された多酵素複合体です。AFMベースのSMFSを使用して、セルローム関連タンパク質集合体の機械的特性とフォールディング配置を研究しました。セルロソームの組み立てに関与する個々の受容体-リガンド複合体の相互作用を研究するための、タンパク質の固定化、データ取得、およびデータ解析のための完全なワークフローを紹介します。...

AFMベース1分子力分光法によるセルロソームの受容体リガンド系の探索

多種多様な単一分子をAFMチップに共有結合するプロトコールが提示されます。これらの分子が固体支持体および生体界面に付着力および自由エネルギーを決定するための手順および例が提供される。...

原子間力分光法による単一分子の接着性を調査

詳細な手順と機械的性質および原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子のアンフォールディング経路を機械的に測定するための戦略について述べる。また選択と良い単一蛋白質分子の録音の正当化のための参照として代表的な結果を述べる.

原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法

このプロトコルを記述する、heterobifunctional シラン カップリング剤による酸化シリコン薄膜表面の原子間力顕微鏡による単一分子力分光法のために設計するで例示されている蛋白質の共有結合固定化、RrgA の相互作用 (毛 1 先端付着性S.

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

赤外線ナノ分光法と高分解能原子間近顕微鏡の応用を用いて、タンパク質自己組織化のプロセスをオリゴメラ凝集体とアミロイド線維に可視化し、発症と発達に密接に関連している。ヒト神経変性疾患の広い範囲の。...

赤外線ナノ分光法と原子間力顕微鏡による個々のタンパク質凝集物の特徴付け

ここでは、タンパク質ポリマーを制御された配列で形成する酵素によってタンパク質モノマーを結合し、単一分子力分光研究のために表面に固定化するプロトコルを提示する。...

OaAEP1-媒介酵素合成と単分子力分光法のための重合タンパク質の固定化

原子間力顕微鏡(AFM)片持ち体先端へのプローブ分子の共有結合は、その物理的性質を調査する上で不可欠な技術である。これにより、AFMベースの単一分子力分光法を介して、高い再現性を持つ伸縮力、脱着力、ポリマーの長さを決定することができます。...

AFMベースの力分光法のための単一分子の共有結合

アンサンブル力分光法(EFS)は、生物物理学およびバイオセンシング分野における生体分子構造のアンサンブルセットの機械的アンフォールディングおよびリアルタイムセンシングのための堅牢な技術です。...

せん断力によるアンサンブル力分光法

プラズモニックナノピンセットは、金ナノ構造の局在化表面プラズモン共鳴を利用して、ナノメートルスケールの光学場内にタンパク質を含む単一のナノ粒子をトラップします。散乱シグナルの変化により、タンパク質の存在とコンフォメーションダイナミクスが明らかになり、フルオロフォアの修飾や表面テザリングなしでのモニタリングが可能になります。...

プラズモニックナノピンセットを用いた単一非修飾タンパク質のコンフォメーションダイナミクスのモニタリング

学ぶ単一分子力分光法を用いて無機材料とアミノ酸・ペプチドの相互作用を測定する手法。AFMを活用した分子レベルでの付着力測定により、表面化学と材料開発の知見を深めることができます。

単一分子力分光法を用いて無機材料とアミノ酸とペプチドの相互作用への洞察

さらに動画を探す