隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、 Dermestes maculatus

この手順の全体的な目標は、カブトムシの多様なクレードを表す新しい昆虫モデルシステムであるDermestes maculatusの遺伝子機能を探求し、基礎研究と応用研究の課題の研究を促進することです。この方法は、Dermestesの胚と成体における遺伝子機能の試験を可能にすることにより、発生生物学、進化生物学などの分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、完全なゲノム配列がない場合でも、配列情報のみに基づいて、RNA干渉を使用して任意の遺伝子を標的にできることです。

ここで紹介する方法は、Dermestesの遺伝子機能を研究するためのアプローチを提供するだけではありません。また、新しい昆虫モデルシステムの開発や、害虫の防除にも応用できる可能性があります。D.maculatusの飼育ケージを準備するには、まず木の削りくずを薄く広げて中型の昆虫ケージに入れます。

発泡スチロールの一部をケージに入れて、幼虫が蛹になる環境を確保します。20〜50匹の成虫または後期幼虫をケージに加えます。濡れたキャットフードを食料源として、ペトリ皿または計量ボートに入れます。

ケージをメッシュクロスで覆い、インキュベーターに入れます。胚の収集を開始する前に、まずケージに胚が存在するかどうかを注意深く確認し、それらを取り出します。ケージがクリアになったら、伸ばしたコットンボールをケージに入れ、コロニーを摂氏30度でインキュベートします。

適切な時間枠の後、綿球を集め、そこにいる大人をすべて取り除き、ケージに戻します。黒い画用紙の上に、コットンボールをそっとつまみ、ゆっくりと細いフィラメントに引き裂き、存在する卵が黒い紙に落ちるようにします。標準的なペトリ皿の蓋を取り、黒い濾紙を使用して内部を覆います。

標準的な顕微鏡スライドの端に沿って両面テープを貼り付けます。顕微鏡スライドをペトリ皿の蓋の黒い濾紙に置きます。採取した胚が入った紙を取り、軽くたたいて胚をペトリ皿の蓋に移します。

絵筆を使用して、テープ上の胚をスライドに対して垂直に位置合わせし、前端または後端を端に向けて位置合わせします。RNAiを開始するには、まず20マイクロリットルのマイクロローダーピペットチップに2〜4マイクロリットルのdsRNAを取ります。先端を事前に引っ張ったガラスキャピラリー(針と呼ばれる)に挿入し、溶液を針に静かにピペットで入れます。

針をガラスキャピラリーホルダーに固定し、キャピラリーホルダーをマイクロマニピュレーターに組み立てます。次に、胚を付着させたスライドを解剖顕微鏡のステージに慎重に移します。スライドを動かして1つの胚をフィールドの中心に持ってきて、顕微鏡の焦点を合わせます。

解剖スコープを覗き込みながら、マイクロマニピュレーターでキャピラリーの先端を位置決めします。行の最初の胚の端に先端を近づけます。窒素または空気供給のスイッチを入れてから、ソレノイド入力セレクタースイッチを真空に設定します。

装置に応じて、イジェクト圧力レギュレーターを10〜15psiに調整します。キャピラリーを開くと、着色されたdsRNA溶液が先端を満たし、注射の準備が整います。毛細血管の先端を前方に動かし、胚に優しく穴を開けます。

理想的な圧力設定では、胚液が毛細血管に流れ込むことはありません。足のスイッチを踏んで、適切な量が分配されるまで、dsRNAを胚に排出します。先端を胚の中に入れたまま約2秒間置いてから、慎重に取り出します。

すべての胚が注入されたら、スライドをペトリ皿に入れます。濡れたコットンボールを皿に加え、滑り台に接触しないように注意します。ペトリ皿を覆い、シーリングフィルムで包みます。

dsRNAの種類、濃度、日付、時刻、および注入された胚の数で標識します。最後に、胚が孵化するまで、皿を摂氏30度のインキュベーターに入れます。pRNAiを実施するには、まずコロニーから蛹を採取します。

オスとメスの蛹を2つの別々の皿に分類し、これらを摂氏30度のインキュベーターに入れます。閉じたカブトムシがないか毎日プレートをチェックし、これらの個体を男性と女性の大人の2つの別々のペトリ皿に移します。これらの成虫に餌を与え、注射を開始するのに十分な成虫が閉じるまで、プレートを隔日で維持します。

成虫のプールが完成したら、メスのカブトムシに麻酔をかけ、片手で個々の腹側を上に持ち、もう一方の手で注射器を持ちます。胸骨2と3の間のセグマコリア膜に穏やかに浸透させます。シリンジスケールを確認し、女性1人あたり約2マイクロリットルをゆっくりと分注します。

注射後、針を少なくとも5秒間安定させてから、慎重に引き抜いてください。注入した女性をキャットフードの入ったペトリ皿に移します。皿に適切なラベルを付けます。

皿を摂氏30度のインキュベーターに入れます。24時間後、注射した雌をミニケージに移し、注射していない若い雄を同数追加します。ケージにラベルを貼り、キャットフードを追加します。

ケージを摂氏30度のインキュベーターに入れ、交配を可能にします。その後、得られた子孫を調べて、pRNAiの効果を判断できます。この画像は、コントロールとしてDS GFP、緑色蛍光タンパク質を注射したpRNAi個体の子孫を示しています。

ここでは、野生型の個体と同様に、子孫はセグメントごとに1本の色素入りストライプで孵化しました。隣接する色素沈着ストライプは、非色素沈着ギャップによって分離されました。対になったpRNAiに続いて、影響を受けた子孫は融合した隣接する色素ストライプで孵化し、セグメント境界に欠陥があることを示しました。

表現型の重症度はさまざまでしたが、融合は特定の境界領域で一貫して現れ、ペアルールのような欠陥を示しています。同様に、ペアノックダウン後の未孵化胚のキューティクル表現型は、腹部セグメントの喪失と体長の短縮を示しました。初期胚をエングレイル抗体で染色し、分子欠陥を調べたところ、対照個体の各セグメントで等しい強度の発現の縞模様が見られました。

対照的に、Dmac対dsRNAを注入した雌の子孫の代替縞では、発現の減少が検出された。この発現減少のパターンは、影響を受けたハッチングされた幼虫に観察された欠陥のあるキューティクルパターンと一致しています。ここでは、Dermestes maculatusの初期胚発生中に、RNA干渉を使用して目的の遺伝子をノックダウンするためのプロトコルを初めて紹介します。

これらの手順を試みる際には、適切な段階で胚または女性の成体を使用することを忘れないでください。一度習得すれば、約100個の胚または10人の女性の成人女性への注入を30分以内に行うことができます。この手順に続いて、遺伝子調節メカニズムに関する追加の質問に答えるために、胚染色や定量的PCRなどの他の方法を実行できます。

このビデオを見れば、Dermestesラボコロニーの設定方法と、このカブトムシの胚性および親性RNA干渉の実行方法について十分に理解できるはずです。現在、機能研究に使用できる昆虫モデルはごくわずかです。ここで紹介した技術は、研究者がDermestesをモデルシステムとして使用する道を開き、分子遺伝学的解析に適した昆虫の範囲を拡大します。