Name: 隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、 Dermestes maculatus (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学ぶ Dermestes maculatusの飼育法とRNAiによる遺伝子ノックダウン技術。胚と成体での遺伝子機能解析により、発生生物学と進化生物学の研究に貢献します。害虫防除への応用も期待されます。

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私たちは、マイクロインジェクション装置を設置し、昆虫RNAiに関する貴重な知識と経験を共有してくださったアリソン・ヘファー博士とヨン・ルー博士に感謝します。この研究は、国立衛生研究所(R01GM113230からLP)の支援を受けました。

著者らは開示するものは何もない。

洗練されたモデル系（マウス、ハエ、ワーム）の数が少ないが、20 世紀中に開発されたが、21世紀には、世界中の研究室で開発中の新しい動物系の波を見ています。これらの新しいシステムは、科学者が唯一の「標準」モデル系を用いて探索することができません比較、進化の質問に対応することができます。新モデルのこの展開は、迅速な実験室培養方法の開発、遺伝子同定、および新種で機能的なアプローチが必要です。ここでは、実験室および胚のRNAi、親のRNAi、およびこの甲虫における表現型解析のためのステップバイステップのプロトコルでD. maculatusを飼育するための手順が提示されました。目標は、これらの記述は、独自の実験でD. maculatusを使用すると、追加の新モデル種を開発するためにここに提示アプローチの使用を作るために他の人を励ますことです。 D. maculatusのリットルながら、ABのコロニーが維持するために非常に簡単です、この種の飼育の一つの制限は、食品の彼らのソースとしてカブトムシに...

1998年には、火とメロは、二本鎖RNA（dsRNA）が線虫（Caenorhabditis elegans）1における遺伝子機能の抑制を誘導することができることを報告しました。該dsRNAによって誘発この応答は、RNA干渉（RNAi）と命名し、そしてそのようなRNAiを介した遺伝子サイレンシングは、動物、植物、および真菌2-7に保存されることが報告されました。植物や一部の動物において、RNAi機能は、全身、意味の効果が（8月10日に概説）のdsRNAが直接導入されていない他の細胞/組織に広がることができます。科学者たちは、それによって直接（11月14日に見直さ）ゲノムを操作することなく、遺伝子機能をノックダウン、目的の遺伝子を標的とするためのdsRNAを設計することにより、この内因性細胞RNAi応答を利用してきました。 RNAiは、次のような利点のために機能的研究のための強力なツールです。まず、偶数最小限の遺伝子配列情報を用いて、遺伝子は、RNAiを使用して標的化することができます。これは、STのために特に重要ですゲノムやトランスクリプトームデータを欠く非モデル生物のudies。第二に、RNAi応答がロバスト全身である生物で、RNAiを介した遺伝子ノックダウンは、ほぼすべての発達段階で行うことができます。この機能は、多面的な遺伝子の機能を研究するために非常に有用です。第三に、いくつかの場合には、RNAi効果を表現型子孫15,16において観察されるように、生殖腺および子孫に広がります。単一注入親によって生成多数の子孫は、卵を直接操作することなく検査することができるように、親のRNAi（pRNAi）として知られるこの現象は、胚発生に影響を与える遺伝子について特に有利です。これらの理由から、pRNAiを選択する方法です。 pRNAiが無効である場合は、卵形成のために必要な遺伝子のために、たとえば、その後、胚のRNAi（eRNAi）を使用する必要があります。 dsRNAの量は強い欠陥に弱い生成する範囲にわたって変化させることができる送達という点で第四に、RNAiは、対立遺伝子シリーズの等価物を生成するために使用することができます。表現型のようなグラデーションは、遺伝子は致命的である複雑なプロセスおよび/または機能の完全な喪失に関与しているときに遺伝子機能を理解するのに役立つことができます。第五に、dsRNAの配信は、特に堅牢な全身のRNAi応答を示す動物では、一般的に簡単で、実現可能です。 dsRNAは、マイクロインジェクション1,5、摂食/摂取17,18、浸漬、19,20およびウイルス/細菌媒介送達21,22によって導入することができます。第六に、いくつかの遺伝子ターゲティング/編集方法とは異なり、変異を有する生物をスクリーニングするまたはRNAiを用いた場合にホモ接合体を生成するための遺伝的交雑を行う必要はありません。したがって、遺伝子機能を研究するための多くの他の技術と比較して、RNAiは、速く、安価であり、かつ大規模なスクリーニング23-25に適用することができます。 RNAiの広範なユーティリティがbeyon研究のために利用可能な種の範囲を拡大し、生物の広い範囲で機能的研究を遂行するための手段を提供します遺伝的ツールが開発されているために、従来のモデルシステムをdは。例えば、非モデル系を用いた研究は、異なる開発モードを表すか、別個の形態学的特徴26〜29を示す種由来のオルソログの機能を比較することにより、遺伝子および遺伝子ネットワークの進化への洞察を得るために必要とされます。研究のこれらのタイプは、印加されたと基本の両方の研究のための影響で、生物多様性のより良い理解を提供します。 地球上で最大の動物群である、昆虫は多様性のメカニズムを探求する絶好の機会を提供します。また、昆虫は、一般的に小さく、短いライフサイクル、高い繁殖力を持っている、と研究室の後部に簡単です。過去20年間において、RNAiが正常に双翅目（真のハエ）5を含む、注文にまたがる昆虫で適用されてきた、鱗翅目（蝶や蛾）30、鞘翅目（甲虫）16,31、膜翅目（sawf嘘、ハチ、アリやハチ）32、半翅目（真のバグ）、等翅目（シロアリ）34、Blattodea（ゴキブリ）35、直翅目（コオロギ、バッタ、イナゴ、とキリギリス）36と、シラミ目（シラミ）37。 RNAiの成功のアプリケーションは、エクジソンが42シグナル伝達、初期胚発生におけるパターン形成の研究のための機能データ（前後軸32、背腹軸28、セグメンテーション26,38）、性別決意39,40、キチン/キューティクルの生合成41を提供してきました社会的行動43、およびより多くの。彼らは（44-46に概説）害虫防除のために有用である可能性があるという点で異なる昆虫種のために開発されたRNAi法は、付加的な有益であり得ます。 RNAi効果は、非保存領域を標的とするために選択されている限り、遺伝子特異的なだけでなく、種特異的であろう。の生存に不可欠な遺伝子を標的ミツバチやカイコなどの有益な昆虫種については、感染を制御するためのウイルスまたは寄生虫は、これらの種47,48を保護するための新規な戦略を提供することができます。 Dermestes maculatus（D. maculatus）、一般名の非表示カブトムシは、南極大陸を除く世界的に分布しています。完全変態の昆虫としては、D. maculatusのライフサイクルは、胚、幼虫、さなぎ、および成体期（ 図1）が含まれています。それは肉を餌にするので、D. maculatusは死んだ動物を骸骨にするために美術館に使用され、法医学昆虫学者は、死亡49,50の時間を推定するためにそれを使用することができます。 D. maculatusは死体、乾燥肉、チーズ、および他の昆虫の蛹/繭などの動物性食品に供給し、このように家計へのダメージ、保存された食品、シルク、チーズ、肉産業51,52の原因となります。この甲虫でRNAiを適用すると、その経済的影響を最小化するための効率的かつ環境に優しい方法を提供することができます。私たちの研究室では、新しいメートルとしてD. maculatusを使用していますセグメンテーション53を研究するodel昆虫。それはそれの有用な種は短期および長期の生殖発達の間の移行を検討すること、中間胚の開発者であるとして、実験室飼育の影響を受けやすいことに加えて、D. maculatusは、基礎研究のために重要です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig1.jpg"> 図1：D. maculatusのライフサイクル。示されているように異なるライフステージでのD. maculatusの写真、。卵から大人までのライフサイクルは、より低い温度でより長い30℃で3週間かかりますが。 （A、F）産まれたての胚は、長さ約1.5ミリメートル、淡黄色の楕円形に白です。胚は〜30℃で55時間かかります。 （B、C、およびG）幼虫が暗く着色されたストライプを有しており、毛で覆われています。幼虫は、環境に応じて、いくつかの齢を通過し、その長さは1オーバーセンチにまで拡張することができます。 （D、H） （E、I）間もなく羽化後、暗い色素沈着は、大人のカブトムシの体の上に表示されます。大人数ヶ月まで生きることができ、一人の女性が生涯にわたって胚の数百人を置くことができます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54976/54976fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 以前、我々は、RNAiは、D. maculatus 53における遺伝子機能のノックダウンに有効であることが示されました。ここでは実験室でD. maculatusコロニーを飼育経験は、胚と親の両方のRNAiセットアップ、注射、注射後のケア、および表現型解析のためのステップバイステップのプロトコルと一緒に共有されています。 D. maculatusで質問に対処するための詳細な情報を提供するだけでなく、foの潜在的な重要性を持っているだけでなく、ここで紹介したdsRNA媒介遺伝子ノックダウンと分析方法rの他の非モデル甲虫/昆虫種でRNAiを適用します。

<table><tbody><tr><td>Dermestes maculatus 生きたカブトムシ</td><td>私たちの研究室またはカロライナ生物学的供給</td><td>#144168</td><td>私たちの研究室の株はCOIバーコードによって検証されました。カロライナからの株のバリエーションは除外できません</td></tr><tr><td>ウェットキャットフード</td><td>ファンシーフィースト</td><td></td><td>肉の塊と肉の塊。ほとんどのペットフードや食料品店で買える</td></tr><tr><td>ドライドッグフード</td><td>ピュリナ パピーチャウ</td><td></td> ほとんどの<td>ペットフードや食料品店で買える</td></tr><tr><td>昆虫ケージ (サイズ ミディアム、30.5 x 19 x 20.3 cm)</td><td>エクソテラ</td><td>PT2260</td><td>コロニーメンテナンス用。必要に応じてより大きなケージを使用できます</td></tr><tr><td>昆虫ケージ(サイズミニ、17.8 x 10.2 x 12.7 cm)</td><td>エクソテラ</td><td>PT2250</td><td>胚コレクション用</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td></td></tr><tr><td>コットンボール</td><td>フィッシャー</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>メガスクリプトT7転写キット</td><td>フィ</td><td>ッシャーAM1334</td><td>40反応用</td></tr><tr><td>空気圧ポンプ</td><td>WPI</td><td>PV830</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリーホルダー</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>ナリシゲ</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>黒色濾紙 (90&nbsp;mm)</td><td>VWR</td><td>28342-010</td><td></td></tr><tr><td>食品着色料(緑)</td><td>McCormick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細管</td><td>ヒルゲンベルグ</td><td>1406119</td><td></td></tr><tr><td>ニードルプーラー(マイクロピペットプーラー)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライドガラス</td><td>ワールドワイドライフサイエンス事業部</td><td>41351157</td><td></td></tr><tr><td>封止フィルム (パラフィルムM)</td><td>フィッシャー</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>801型シリンジ (10&nbsp;&マイクロ;l)</td><td>ハミルトン</td><td>7642-01</td><td></td></tr><tr><td>ニードル(32ゲージ)&nbsp;</td><td>ハミルトン</td><td>7762-05</td><td></td></tr><tr><td>固定液 (パンペル社)</td><td>BioQuip Products, Inc.</td><td>1184C</td><td>有毒、ヒュームフードで取り扱う必要があります</td></tr><tr><td>鉗子 (DUMONT #5)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ (24 x 50 mm, No. 1.5)</td><td>グローブサイエンティフィ</td>ック <td>1415-15</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ フェムトチップ マイクロローダー ピペットチップ</td><td>フィッシャー</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>胚注入用解剖顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M420</td><td></td></tr><tr><td>幼虫の表現型可視化のための顕微鏡解剖</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discover.V12</td><td></td></tr><tr><td>DIC顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Imager.M1</td><td></td></tr></tbody></table>の

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖rna媒介遺伝子、 dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

ゲノミクスの進歩により、前例のない規模で生物多様性を調査する可能性が高まっています。しかし、配列だけでは、遺伝子機能を研究するためのツールがなければ、情報を得ることはできません。したがって、実験室での新しいモデルシステムの確立や、機能研究を実施するためのツールのための詳細なプロトコルの開発と共有は、ゲノミクスの力を活用するために重要です。鞘翅目(カブトムシ)は昆虫の最大のクレードであり、地球上のほぼすべての種類の生息地を占めています。カブトムシの研究は、基礎研究の理想的なモデルを提供するだけでなく、家庭、農業、食品産業の害虫であることが多いため、害虫駆除に影響を与える可能性があります。D. maculatus 実験室コロニーの飼育と維持、および D. maculatus における dsRNA 媒介干渉の実施に関する詳細なプロトコルが提示されます。胚および親のRNAi手順(装置のセットアップ、調製、注射、および注射後の回復を含む)が説明されています。また、生存率、孵化した幼虫のパターン化欠陥、孵化していない幼虫のキューティクル調製など、胚の表現型を解析する方法も紹介されています。これらのアッセイは、in situハイブリダイゼーションおよび分子マーカーの免疫染色とともに、D. maculatusを基礎研究および応用研究のためのアクセス可能なモデルシステムにします。さらに、他の新興昆虫モデルシステムにおける手順を確立するための有用な情報を提供します。

著者らの研究室は、昆虫53,55内のセグメンテーションを制御する遺伝子の機能進化を研究するためにRNAi技術を使用しています。すべての昆虫がセグメント化されているが、このプロセスを制御する遺伝子は、昆虫の放射線26,38,56-63中に発散したと思われます。 ショウジョウバエにおける遺伝子スクリーニングは、身体セグメント64-70の形成を促進するための責任を負う9対ルールセグメント遺伝子のセットを同定しました。ここでは、これらの遺伝子のいずれかのオルソログ、 対になった （PRD）は 、D. maculatusにおける遺伝子機能を研究するためのRNAiの有用性を文書化するために使用されます。 この種では、セグメントの形成にPRD - eRNAiとpRNAiは、各DMACのための役割...

ここでは、研究室で（D. maculatus）Dermestes maculatus、中間胚芽カブトムシを飼育するためのプロトコルを提示します。我々はまた、この種における遺伝子機能を研究するために胚の表現型を解析するための胚および親のRNAiのためのプロトコルとメソッドを共有しています。

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、 Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

この手順の全体的な目標は、カブトムシの多様なクレードを表す新しい昆虫モデルシステムであるDermestes maculatusの遺伝子機能を探求し、基礎研究と応用研究の課題の研究を促進することです。この方法は、Dermestesの胚と成体における遺伝子機能の試験を可能にすることにより、発生生物学、進化生物学などの分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、完全なゲノム配列がない場合でも、配列情報のみに基づいて、RNA干渉を使用して任意の遺伝子を標的にできることです。ここで紹介する方法は、Dermestesの遺伝子機能を研究するためのアプローチを提供するだけではありません。また、新しい昆虫モデルシステムの開発や、害虫の防除にも応用できる可能性があります。D.maculatusの飼育ケージを準備するには、まず木の削りくずを薄く広げて中型の昆虫ケージに入れます。発泡スチロールの一部をケージに入れて、幼虫が蛹になる環境を確保します。20〜50匹の成虫または後期幼虫をケージに加えます。濡れたキャットフードを食料源として、ペトリ皿または計量ボートに入れます。ケージをメッシュクロスで覆い、インキュベーターに入れます。胚の収集を開始する前に、まずケージに胚が存在するかどうかを注意深く確認し、それらを取り出します。ケージがクリアになったら、伸ばしたコットンボールをケージに入れ、コロニーを摂氏30度でインキュベートします。適切な時間枠の後、綿球を集め、そこにいる大人をすべて取り除き、ケージに戻します。黒い画用紙の上に、コットンボールをそっとつまみ、ゆっくりと細いフィラメントに引き裂き、存在する卵が黒い紙に落ちるようにします。標準的なペトリ皿の蓋を取り、黒い濾紙を使用して内部を覆います。標準的な顕微鏡スライドの端に沿って両面テープを貼り付けます。顕微鏡スライドをペトリ皿の蓋の黒い濾紙に置きます。採取した胚が入った紙を取り、軽くたたいて胚をペトリ皿の蓋に移します。絵筆を使用して、テープ上の胚をスライドに対して垂直に位置合わせし、前端または後端を端に向けて位置合わせします。RNAiを開始するには、まず20マイクロリットルのマイクロローダーピペットチップに2〜4マイクロリットルのdsRNAを取ります。先端を事前に引っ張ったガラスキャピラリー(針と呼ばれる)に挿入し、溶液を針に静かにピペットで入れます。針をガラスキャピラリーホルダーに固定し、キャピラリーホルダーをマイクロマニピュレーターに組み立てます。次に、胚を付着させたスライドを解剖顕微鏡のステージに慎重に移します。スライドを動かして1つの胚をフィールドの中心に持ってきて、顕微鏡の焦点を合わせます。解剖スコープを覗き込みながら、マイクロマニピュレーターでキャピラリーの先端を位置決めします。行の最初の胚の端に先端

rearing-double-stranded-rna-mediated-gene-knockdown-hide-beetle

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Genetics

遺伝学

このプロトコルでは、とRNAiによる遺伝子サイレンシングを組み合わせる...

RNAiによる遺伝子ノックダウンと<emインビボで&gt;</em大人の女性の&gt;利尿アッセイ<em&gt;ネッタイシマカ</em&gt;蚊

このプロトコルでは、我々は同時に、ミツバチの二つの遺伝子（二重遺伝子ノックダウン）を抑制の2つの戦略について説明します。その後私たちはミツバチ味覚知覚に二重遺伝子ノックダウンの効果を研究するために口先拡張応答（PER）アッセイを使用する方法を提示します。...

ミツバチにおけるRNAiによる二重遺伝子ノックダウンと味覚知覚測定（<em&gt;ミツバチ</em&gt;）

dsRNAは、Cで供給しながら、 エレガンスは、大規模な送り画面の現在のプロトコルは、可変ノックダウン効率をもたらす遺伝子機能を評価するための強力なツールである。我々は、遺伝子発現の非常に有効かつ再現性のノックダウンをもたらす大規模なRNAi送り画面を実行するための改良されたプロトコルを記載している。...

大規模な遺伝子ノックダウン中<em&gt; C.虫</em&gt;堅牢な機能喪失表現型を生成するためのdsRNA摂食ライブラリの使用

RNA干渉（RNAi）は、遺伝子ノックダウン技術は、 コクヌスト研究の中核にあるベース。ここでは、 コクヌストにおける当社の幼虫のRNAi技術の概要を説明します。幼虫RNAiは、研究者が多様な文脈で遺伝子機能を研究することができ、機能喪失型の表現型への迅速なアクセスを提供する単純な、しかし強力な技術である。...

レッドフラワービートル幼虫RNA干渉、コクヌストモドキ

ここでは、幼虫により摂取されたキトサン/干渉RNAナノ粒子の使用を通じて疾病媒介蚊で遺伝子機能を阻害するための手順を記述している。...

病気のベクトル蚊幼虫におけるキトサン/干渉RNAナノ粒子媒介遺伝子サイレンシング

RNA干渉（RNAi）は、遺伝子の機能を明らかにするための非常に貴重なツールです。しかし、成人前の段階でRNAiを使用して遺伝子を標的とする能力は、主要なヒトマラリアベクターであるAnopheles...

RNAiのトリガ配信へ<em&gt;ハマダラカ</em&gt;蛹

ここでは、クリケットの卵を注入するプロトコルを提示します, を含むが、これらに限定されないクリケットの多くの実験で基礎的な方法として機能する技術, RNA干渉とゲノム操作.

グリルス・ビマキュラトゥス・エッグを注入する

RNA干渉は、特定の発生段階で遺伝子発現を操作するための広く適用可能で強力な技術です。ここでは、この手法を、遺伝子配列の獲得から、構造や行動に影響を与える遺伝子のノックダウンまで、水生潜用カブトムシ の熱NECTTus...

特定の発生時における遺伝子発現を操作するための強力なツールとしての水生カブトムシのRNA干渉

私たちは、青い尾のダムを使用して、オーダーオドナタ(トンボとダムリー)の昆虫に対するエレクトロポレーション媒介性RNA干渉(イシュヌラ・セネガルシス:コエナゴロ科:ツィゴプテラ)とパイドスキマートンボ(プセミソナタ:リベルリドエ:アネリスラプテ)を使用して詳細なプロトコルを提供します。...

オドナタにおけるエレクトロポレーション媒介性RNA干渉法

ここでは、CRISPR/Cas9ゲノム編集によって作成された Helicoverpa armigera...

CRISPR/Cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

アメリカのゴキブリにおけるRNA干渉の応用

学ぶ Dermestes maculatusの飼育法とRNAiによる遺伝子ノックダウン技術。胚と成体での遺伝子機能解析により、発生生物学と進化生物学の研究に貢献します。害虫防除への応用も期待されます。

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、 Dermestes maculatus

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