蛍光 x 線 (XRF)

蛍光X線(XRF)分光法は、室温でサンプルの元素分析を行うために使用される非破壊分析技術です。

XRFは、生物学、法医学、環境、さらには芸術作品など、幅広いサンプルに適用できます。サンプルは、粉末、結晶、液体など、さまざまな形をとることもできます。XRFでは、サンプルにX線ビームが照射され、蛍光放射と呼ばれる低エネルギーの二次X線が放出されます。

蛍光X線分析計は蛍光技術と呼ばれていますが、従来の蛍光顕微鏡法とは異なり、低エネルギーの可視光や光活性分子を使用しません。

このビデオでは、XRFの基本を紹介し、生物学的サンプルの元素マップを収集する方法を示します。

十分なエネルギーの光子が原子に衝突すると、エネルギーが吸収され、外殻電子の1つが励起されます。電子が弛緩すると、通常は低エネルギーの二次光子を放出します。このプロセスは蛍光として知られています。蛍光顕微鏡で使用されるような低エネルギーの光子とは異なり、X線光子は、しっかりと保持された電子を内殻から完全に放出するのに十分なエネルギーを持っています。その後、高エネルギーの殻からの電子が空孔に落ちます。2つのシェル間のエネルギー差に比例した光子が放出されます。各要素は、要素を識別し、存在する量を決定するために使用できる一意の光子またはスペクトルのセットを放出します。この現象は蛍光X線として知られています。

元素スペクトルが収集されると、目的の元素の信号を分離できます。サンプル全体の複数の場所で測定を行い、一度に1ピクセルずつ画像を生成できます。このプロセスは、ラスター スキャンと呼ばれます。その後、関心のあるすべての要素の画像を生成できます。これらの元素マップは、サンプルに関する貴重な情報を提供します。XRFについて理解すれば、元素マップを生成するための生体細胞サンプルを調製する準備が整いました。

まず、スキャンのためにサンプルを所定の位置に保持する窒化ケイ素ウィンドウを準備して滅菌します。彼らは非常に壊れやすいので注意してください。窓が平らな面を上にして向きを変えます。次に、窓を培養皿に入れ、小さな粘着テープで皿に接着します。

最後に、窒化ケイ素ウィンドウをUV放射で1時間滅菌します。

ウィンドウが滅菌されたので、サンプルをそれに固定できます。まず、培養皿を斜めに持ち、皿の側面に培地を加えます。ゆっくりと傾きを和らげて窓をコーティングします。同様に細胞を皿に加え、インキュベートします。

細胞が使用できる状態になるまで、定期的に光学顕微鏡で観察してください。

層流フードで、ディッシュからメディアを静かに吸引します。

次に、リン酸緩衝生理食塩水で細胞をすすぎ、余分な培地を取り除きます。

PBSを吸引し、パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。20分後、混合物を取り出し、有害廃棄物として処分します。

皿から窓を取り外し、キムワイプで窓の端と背面のくぼみをすばやく拭きます。窓を清潔な面に置いて乾かします。

サンプルが乾いたら、光学顕微鏡で窓に細胞が存在することを確認します。

透明なマニキュアを使用して、ウィンドウをアルミニウムホルダーに固定します。

サンプルホルダーを装置マウントに挿入し、マウントをX線顕微鏡の位置決めステージに置きます。

サンプルウィンドウをX線顕微鏡光学系の焦点に配置し、入射ビームに対して45度の角度で配置します。

装置エリアを出て、残りの手順をリモートで実行して、X線の被ばくを最小限に抑えます。

シャッターを開き、光学系を使用して、単色X線ビームをサブマイクロメートルのスポットサイズまで焦点を合わせます。

スポットの位置は、事前にキャリブレーションされたカメラで画像化できます。ポジショニングステージを使用して、サンプル上にラスターを配置するために必要な適切な幅と高さを決定します。

滞在時間が 1 の目的の要素のテストスペクトルを収集しますか?2秒です。

テストスペクトルから、目的の元素に十分なS/N比を提供するために、適切なスキャン時間を選択します。

次に、サンプルに必要な分解能を決定します。解像度は、対象の特徴よりも小さく、スポット サイズよりも大きくする必要があります。最後に、スキャンをスキャンソフトウェアにプログラムし、画像を収集します。

この実験では、いくつかの異なる要素について、細胞の元素マップを実行しました。銅、鉄、亜鉛などの多くの金属は細胞内の重要な栄養素であり、細胞内で明確に同定されました。

各金属が細胞内のどこにあるかを決定することにより、その正常な細胞プロセスに関する貴重な情報を解明することができます。さらに、金属ベースの病気を理解することができます。

蛍光X線は、幅広い科学分野で利用されています。XRFの非破壊的な性質により、歴史的遺物の研究にXRFを使用することができます。美術史家は、この技術を利用して、もともと芸術作品に使用された顔料を特定します。これにより、出所、時間の経過とともに色あせた色、信憑性など、作品に関する情報を解明できます。法医学者は、犯罪現場の調査にもXRFを使用しています。銃が発砲されると、周囲は銃弾の残留物で覆われます。ガンショットの残留物には、ガンパウダー、イグニッションプライマー、およびケーシングと弾丸の金属が含まれています。XRFで収集された情報により、犯人と使用された武器を特定できます。

蛍光X線に適した別の研究分野は、古生物学です。ここでは、2億5000万年以上前に生息していた海洋節足動物である三葉虫の化石から元素情報が収集されます。

化石の元素組成を特徴づけることで、長い絶滅した生命について新たな情報を得ることができます。保存状態の良いサンプルは、ずっと前に劣化した軟組織の組成を提供することさえできます。

JoVEの蛍光X線の紹介をご覧になりました。これで、X線分光法の理論と、さまざまなソースから元素情報を収集する方法を理解できたはずです。

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