RNA配列決定およびTH-プロモーター駆動EGFP発現を使用して中脳培養における生活ドーパミン作動性ニューロンの信頼性の高い同定

この手順の全体的な目標は、チロシンヒドロクスラーゼ駆動のeGFP発現、シングルセルハーベスティング、およびRNAシーケンシングライブラリの生成を使用して、中脳培養中の生きたドーパミン作動性ニューロンを確実に同定することです。この方法は、培養中の同定された生きたドーパミン作動性ニューロンに対して遺伝子発現と電気生理学的アッセイを行うことを可能にするため、パーキンソン病および薬物中毒の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の利点は、一次腹側中脳培養において、固定されたドーパミン作動性ニューロンではなく、生きているニューロンを確実に同定する手段を提供することです。

手順の最初の部分をデモンストレーションするのは、ヘンリー・レスターの研究室の技術者であるシャーリーン・キムです。まず、マウス胚の頭部を鉗子を鼻にしっかりと固定し、背側表面にアクセスできるようにします。もう一方の手で持っている鉗子を使用して、中脳の隆起の直前に皮膚の層と頭蓋骨をつまみ、正中線に沿って皮膚と頭蓋骨を尾状に剥がします。

鉗子を隆起の周りに置き、一方の先端を皮質と中脳の間に置き、もう一方の先端を小脳の上に置きます。中脳全体をつまんで取り除きます。中脳を冷やしたHBSSを入れたシャーレに、解剖顕微鏡で入れます。

解剖顕微鏡の下で、脳セグメントを反転させて、腹側にアクセスできるようにします。これで、4 つの象限が表示されます。鉗子で髄膜を優しくつかみ、脳から上向きに引き離すことにより、髄膜と血管系をすべて取り除きます。

次に、1トンの鉗子をセグメントのほぼ中央にある心室に配置します。次に、中脳を分離するために、背側につまみ、次に両側の内側につまみます。両側に横方向に切り込みを入れて、下の2つの象限を取ります。

腹側被蓋領域と黒質部は腹側下部にあり、密集しているように見えます。VTAとSNCの両方を含む解剖した組織を、ペトリ皿の別の領域にある新鮮なHBSSに入れます。すべての脳セグメントを解剖した後、鉗子と11番のメスを使用して、各中脳セクションをほぼ同じサイズの断片に四つ切りにします。

次に、ワイドボアのP1000ピペットチップを使用して、四分の一の中脳セグメントをすべて15ミリリットルの円錐管に移します。組織を沈降させ、HBSSを除去した後、500マイクロリットルのパパイン溶液を追加します。摂氏37度の水浴中で15分間インキュベートします。

インキュベーション後、ワイドボアP1000チップを使用して、中脳セグメントのみを1ミリリットルのDNase I溶液に移し、セグメントがチューブの底に沈殿するのを待ちます。次に、中脳セグメントのみを、1ミリリットルのコールドストップ溶液を含む15ミリリットルのチューブに移します。2回目のすすぎ液を1ミリリットルの新鮮な停止液に交換し、P1000ピペットチップで7回上下にピペットで動かして細胞を粉砕します。

次に、200マイクロリットルの4%BSA溶液をチューブの底にゆっくりとピペッティングして、細胞懸濁液を下敷きにします。280 x gで6分間遠心分離した後、上清をP1000で吸引し、細胞を1ミリリットルのめっき培地に再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞数を計数し、その後、細胞懸濁液をめっき培地で1000細胞/マイクロリットルに希釈します。

ラミニンを吸引した直後に、ポリ-D-リジン、ポリ-L-オルニチン、およびラミニンでコーティングされた培養皿に細胞懸濁液120マイクロリットルをプレート化し、コーティングが乾燥して表面に凹凸を形成しないようにします。次に、1時間のインキュベーション後、細胞の破壊を最小限に抑えるために、培養皿の播種されていない領域に3ミリリットルの培地を慎重に加えます。3週間の培養後、2ミリリットルのRNaseフリーのDulbecco's PBSで培養皿をすすぎます。

DPBSを取り外します。その後、収穫のために1ミリリットルの新鮮なDPBSと交換します。GFPフィルターセットと40倍対物レンズを倒立落射蛍光顕微鏡で使用して、培養物中の蛍光TH陽性ニューロンを同定します。

細胞体の上にピペットにマイクロマニピュレーターを使用します。次に、マイクロピペットホルダーのサイドポートに取り付けられたプラスチックチューブを使用して、ニューロンをガラスマイクロピペットに吸引するために穏やかに吸引します。細胞が入ったマイクロピペットを直ちに浴液から取り出し、反応バッファーを含む0.2ミリターPCRチューブコレクション内にチップを入れます。

先端をチューブの底部近くの側面にぶつけます。次に、滅菌済みの21ゲージシリンジ針をマイクロピペットの背面に置き、圧力を加えてマイクロピペットの壊れた先端から残りの液体を排出します。卓上微量遠心分離機を使用して収集チューブを5秒間遠心分離し、ドライアイスで凍結します。

PCRキャビネット内で試薬を氷上またはチラーブロック上で作業しながら、室温で最初のマウスマスターミックスと10%の追加容量を調製します。そして、サンプルに3つのプライムプライマーの1マイクロリットルと1マイクロリットルの定量化されたRNAスパイク。次に、サンプルをサーモサイクラーで摂氏72度で3分間インキュベートし、サンプルを直接PCRクーラーラックに置きます。

次に、調製したマスターミックス5.5マイクロリットルをPCRクーラーラックの反応チューブに加え、ピペッティングで穏やかに混合します。チューブを5秒間遠心分離した後、画面に表示されているパラメータに設定されたサーモサイクラーでインキュベートします。一本鎖cDNAを精製するには、25マイクロリットルの渦巻く室温磁気ビーズをサンプルに加えます。

全容量を少なくとも10回上下にピペッティングして混合します。その後、室温で8分間インキュベートし、cDNAをビーズに結合させます。次に、液体が完全に透明になり、上清にビーズが残らなくなるまで、サンプルと磁気ビーズを磁気分離装置に置きます。

上清を吸引して捨てます。サンプルを5秒間回転させて、チューブの側面から液体を収集します。サンプルを磁気分離装置に30秒間置きます。

次に、P10ピペッターで残りの上清をすべて取り除き、DNAが結合したビーズだけを残します。ds-cDNA PCRマスターミックスを50マイクロリットル加え、次に2本鎖合成PCRプログラムを実行して二本鎖cDNAを取得します。このヒストグラムは、TH-eGFP陽性細胞から生成されたシングルセルドーパミン作動性RNAシーケンシングライブラリで検出されたタンパク質コード遺伝子の数を、マッピングされたリード100万あたりの転写産物のキロベースあたりの数を示しています。

6, 000 から 8, 000 のタンパク質遺伝子が単一細胞ライブラリで検出されました。この技術を習得すると、細胞の誘導、培養中の細胞の成熟、細胞の採取とライブラリ生成のステップ、ライブラリのシーケンシング、および予備分析の時間を含め、4〜5週間で実行できます。この手順を試行する際には、RNAシークライブラリの生成と細胞採取のためのRNAseフリーのワークスペースを維持すること、細胞培養を通じて無菌技術を維持すること、および単一細胞採取に適した直径のピペットを作成することを覚えておくことが重要です。

パラホルムアルデヒドの取り扱いは非常に危険であり、ドラフトの使用、皮膚や目の接触を避ける、熱や直火を避ける、適切な個人用防護服を着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。この手順に続いて、薬物治療がドーパミン作動性細胞のタンパク質発現にどのように影響するかなどの追加の質問に答えるために、遺伝子発現や遺伝子ネットワーク解析などの他の方法を実行できます。