Name: RNA配列決定およびTH-プロモーター駆動EGFP発現を使用して中脳培養における生活ドーパミン作動性ニューロンの信頼性の高い同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: 学ぶ、THプロモーター駆動EGFP発現とRNAシーケンスを用いてマウス中脳培養における生活ドーパミン作動性ニューロンを同定する方法。パーキンソン病研究における遺伝子発現解析と電気生理学的アッセイに応用可能です。

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この作業は、米国国立衛生研究所（DA017279、AG033954、DA037743）、マイケル・J・フォックス財団、およびカリフォルニア工科大学のミラード・アンド・ミュリエル・ジェイコブス遺伝学・ゲノミクス研究所に資金提供したカリフォルニア工科大学イノベーションイニシアチブからの助成金によって支援されました。RNA-Seqライブラリプロトコルの最適化と支援を提供してくださったBrian Williamsに感謝します。計算トレーニングを提供してくれた Henry Amrhein に感謝します。バーバラ・J・ウォルド氏には、彼女の機器と実験室スペースを使用してくださったことに感謝します。図書館のシーケンシングと施設管理について、Igor Antoshechkinに感謝します。

<ol><li>Henley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+by+nicotine+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).</li>
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<li>Lammel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+transgenic+mouse+models+for+selective+targeting+of+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons.</a> Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).</li>
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<li>Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Regulation+of+Action+Potential+Shape+and+Burst-Frequency+Firing+by+BK+and+Kv2+Channels+in+Substantia+Nigra+Dopaminergic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons.</a> J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、単一細胞RNA-seqの各セルを研究、蛍光タグを使用して、不均一な集団から単一細胞を単離。私たちは、私たちが収穫し、配列決定し、ライブTH-EGFP細胞の100％は、次の3つのDA関連遺伝子の転写産物、TH、DDCおよびSLC6A3の存在に基づいて、実際にドーパミン作動性ニューロンであったことを報告しています。 RNA-のSeqによって評価されるように、TH-EGFP陽性細胞のすべては、これらの3つの遺伝子を発現しました。これは、各TH-EGFP細胞はまた、ドーパミン作動性ニューロン8、9に関連付けられているイオンチャネルのレパートリーを表示することが示された電気生理学的研究と一致しました。このプロトコルでは、我々は、ライブドーパミン作動性ニューロンのための信頼できるマーカーとしてGENSATチロシンヒドロキシラーゼ-EGFPマウス系統10を利用しました 。 WT文化では現在、それらの形態に基づいて生きてドーパミン作...

パーキンソン病（PD）は、不治の、年齢関連神経変性疾患です。この比較的一般的な障害の原因はよくわかっていないままです。脳全体広まっニューロンの損失は緩慢、硬直及び振戦の診断臨床的特徴につながる、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの顕著な神経変性（SNC）と、があります。 SNCドーパミン作動性ニューロンを含む初代混合培養物は、パーキンソン病のために特に関連しています。腹側被蓋領域（VTA）ドーパミン作動性ニューロンは報酬と中毒に関与しています。腹側中脳（VM）の一次混合胚の培養は、SNCとVTAのドーパミン作動性（DA）ニューロン及びGABA作動性ニューロンの両方を含みます。 VM初代培養物は、神経保護アッセイに有用であることができ、ドーパミン作動性ニューロンの選択的脆弱性を明らかにすること。形態に基づいて、培養中のドーパミン作動性細胞を同定する信頼できる方法はありません。彼再我々は特定し、収穫単一ドーパミン作動性ニューロンを、および単一セル、高収量RNAシーケンシングライブラリーを構築するための技術を開発します。 我々は、単一のドーパミン作動性および中脳培養物から単離しGABA作動性ニューロンのための代表的なRNAトランスクリプトームデータを報告しています。このプロトコルは、DA / GABAのトランスクリプトームの様々な治療の効果を研究するため、神経保護、神経変性、および薬理学的アッセイのために使用することができます。ドーパミン作動性ニューロンは、一次VM培養で発現したニューロンの少数を代表しているので、確実に生きている培養物中のこれらのニューロンを同定する能力は、単一細胞研究の強化された範囲を可能にします。これらの新規の技術は、細胞レベルで起こるメカニズムの理解の進歩を促進し、他の場所で神経科学と分子生物学の分野での用途を有することができます。

<table><tbody><tr><td>パパイン</td><td>・ワーシントン・バイオケミカル・コーポレーション&nbsp;</td><td></td><td></td>LS003126</tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、1x</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>ドナー馬血清</td><td>サーモサイエンティフィック&nbsp;</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Medium: 神経基礎中</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン、L-アラニル-L-グルタミンの安定化形態を含む培地: GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050-061</td><td>0.5 mM 最終濃度。</td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td>17504-044</td><td>50倍ストック溶液、1倍最終濃度。</td></tr><tr><td>35mmガラス底皿</td><td>MatTek&nbsp;&nbsp;</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-オルニチン</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>L2020</td><td>-20 °Cで保管。20のC&micro;Lアリコート</td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼI(DNase)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>ブルーピペットチップ P1000</td><td>Sorenson Bioscience</td><td>&nbsp;Inc. 10130</td><td></td></tr><tr><td>10 mm 浅シャーレ</td><td>シャーレ VWR&nbsp;</td><td>25384-324</td><td></td></tr><tr><td>37 >C ウォーターバス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C、湿度5%インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16%パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>電子顕微鏡科学&nbsp;</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ</td><td>&nbsp;X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ドンキーセラム</td><td>エクイテック&nbsp;</td><td>SD-0100HI</td><td>100%ストック溶液、1%最終濃度。</td></tr><tr><td>標準パターンの外科用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14000-14</td><td></td></tr><tr><td>鉗子 - 2x3 歯</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11022-14</td><td></td></tr><tr><td>鉗子 - デュモン #55</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>鉗子 - デュモン #5</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS、pH 7.4</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝液 (DPBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>21 G ニードル</td><td>BD プレシジョングライド ニードル</td><td>305167</td><td>100 ニードル</td></tr><tr><td>マイクロピペット プーラー</td><td>サッター インスツルメント</td><td>モデル P-87</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター&nbsp;</td><td>サッターインストゥルメント</td><td>&nbsp;MP-285</td><td></td></tr><tr><td>シーケンシングキット: Illumina シーケンシング用 SMARTer 超低 RNA キット</td><td>Clontech</td><td>634936</td><td>100 rnxs,incl Advantage2PCR Kit</td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド (12 & micro;M):SMARTer IIAオリゴヌクレオチド(12 & micro;M)</td><td></td><td></td><td>SMARTerキットより&nbsp;</td></tr><tr><td>逆転写酵素(100単位)</td><td>SMARTcribe逆転写酵素</td><td></td><td>SMARTerキットから&nbsp;</td></tr><tr><td>プライマー1</td><td>3'CDSIIa入門&nbsp;</td><td></td><td>SMARTerキットより</td></tr><tr><td>Primer 2</td><td>IS PCR Primer</td><td></td><td>SMARTerキットより</td></tr><tr><td>50x 2ポリメラーゼミックス</td><td>50x Advantage 2ポリメラーゼミックス</td><td></td><td>SMARTerキットより</td></tr><tr><td>10x PCRバッファー 10x Advantage</td><td>2 PCRバッファー</td><td></td><td>SMARTerキットより</td></tr><tr><td>RNAスパイク</td><td>ThermoFisher</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>PCRクーラーラック</td><td>IsoFreeze PCRクーラーラック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAサンプル調製キット&nbsp;</td><td>(イルミナ/ネクステラ) ネクスター</td><td>FC-121-1030</td><td>24サンプル</td></tr><tr><td>PCR マスターミックス</td><td>ネクステラ PCRマスターミックス (NPM)</td><td></td><td>ネクステラキットより&nbsp;</td></tr><tr><td>PCRプライマーカクテル(PPC)&nbsp;</td><td>ネクステラPCRプライマーカクテル(PPC)&nbsp;</td><td></td><td>Nexteraキットから</td></tr><tr><td>蛍光光度計</td><td>Qubit ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>HS DNA BioAnalyzer キット</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>110 rxns</td></tr><tr><td>電気泳動システム&nbsp;</td><td>Agilent 2100バイオアナライザー。</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>マグネットビーズ アジャンクール アンプル&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>RNAse wipes: RNAse Zap wipes</td><td>Ambion</td><td>AM9786</td><td>Size 100 Sheets</td></tr><tr><td>Qubit ds HS Assay Kit</td><td>Molecular probes&nbsp;</td><td>Q32854</td><td>500アッセイゲル</td></tr><tr><td>抽出キット:Qiaquickゲル抽出キット</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリーチューブ</td><td>(Kimax-51、外径1.5 - 1.8 mm)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige(または同等品)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シーケンサー</td><td>Illumina HiSeq装置</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GENSAT チロシンヒドロキシラーゼ-eGFPマウス系統&nbsp;</td><td></td><td>MMRRC品番:000292-UNC</td><td>ストックTg(Th-EGFP)DJ76Gsat/ミュータントマウス地域研究センター</td></tr></tbody></table>

rna配列決定およびth-プロモーター駆動egfp発現を使用して中脳培養における生活ドーパミン作動性ニューロンの信頼性の高い同定

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

<html>パーキンソン病（PD）で動作緩慢、硬直、振戦につながるのSNcにおけるドーパミン作動性ニューロンの顕著な変性と脳全体広まっ神経細胞の損失があります。蛍光マーカーを使用して、プライマリ腹側中脳（VM）の文化に住んでドーパミン作動性ニューロンの同定は、固定した細胞の免疫染色に頼ることなく、これらのニューロンの選択的脆弱性を研究するための代替方法を提供します。ここでは、単離、解離、および培養マウスVMニューロン3週間。私たちは、その後、（チロシンヒドロキシラーゼ（TH）プロモーターによって駆動される）eGFP蛍光を用いて、培養物中のドーパミン作動性ニューロンを識別します。個々のニューロンは、ガラスマイクロピペットを用いて、マイクロ遠心チューブに回収します。次に、我々は、採取した細胞を溶解し、単一細胞RNA-のSeqライブラリ1、2を生成するために、cDNA合成およびトランスポゾン媒介」tagmentation」を実施しますお尻= &quot;外部参照&quot;&gt; 3、4、5。品質管理チェックを通過した後、単一細胞ライブラリーを配列決定され、その後の分析は、遺伝子発現を測定するために行われます。私たちは、個々のドーパミン作動性および中脳培養物から単離しGABA作動性ニューロンのためのトランスクリプトームの結果を報告します。私たちは、収穫し、配列決定したライブTH-EGFP細胞の100％がドーパミン作動性ニューロンであったことを報告しています。これらの技術は、神経科学および分子生物学において広範な用途を持つことになります。

ここでは、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター配列によって駆動されたeGFPを発現するマウスから腹側中脳の神経細胞を培養する培養物から個々の蛍光ニューロンを収穫し、RNA-seqの（ 図1）を使用して、それらのRNAトランスクリプトームを測定するためのプロトコルを報告しています。データを収集し、配列決定したTH-EGFP陽性細胞の100％は、次の3つのDA関連遺伝子の転写物の存在、TH、ドーパデカルボキシラーゼ（DDC）、およびドーパミン輸送体DATに基づいて、ドーパミン作動性ニューロンであることが示されました（SLC6A3）。 RNA-のSeqによって評価されるように、TH-EGFP陽性細胞のすべては、これらの3つの遺伝子を発現しました。各単一細胞RNA-のSeqライブラリーでは6000 - 8000タンパク質をコードする遺伝子は、（ 図2）を検出しました。ドーパミン作動性ニューロンは、ロバストに、いくつかのニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）サブユニット（ <...

パーキンソン病（PD）では、黒質（SNC）ドーパミン作動性ニューロンは、運動機能障害につながる、退化します。ここでは、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）プロモーター配列によって駆動されるeGFPを発現するマウスから腹側中脳の神経細胞を培養する培養物から個々の蛍光ニューロンを収穫し、RNA-seqのを使用して、それらのトランスクリプトームを測定するためのプロトコルを報告しています。

RNA配列決定およびTH-プロモーター駆動EGFP発現を使用して中脳培養における生活ドーパミン作動性ニューロンの信頼性の高い同定

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

この手順の全体的な目標は、チロシンヒドロクスラーゼ駆動のeGFP発現、シングルセルハーベスティング、およびRNAシーケンシングライブラリの生成を使用して、中脳培養中の生きたドーパミン作動性ニューロンを確実に同定することです。この方法は、培養中の同定された生きたドーパミン作動性ニューロンに対して遺伝子発現と電気生理学的アッセイを行うことを可能にするため、パーキンソン病および薬物中毒の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の利点は、一次腹側中脳培養において、固定されたドーパミン作動性ニューロンではなく、生きているニューロンを確実に同定する手段を提供することです。手順の最初の部分をデモンストレーションするのは、ヘンリー・レスターの研究室の技術者であるシャーリーン・キムです。まず、マウス胚の頭部を鉗子を鼻にしっかりと固定し、背側表面にアクセスできるようにします。もう一方の手で持っている鉗子を使用して、中脳の隆起の直前に皮膚の層と頭蓋骨をつまみ、正中線に沿って皮膚と頭蓋骨を尾状に剥がします。鉗子を隆起の周りに置き、一方の先端を皮質と中脳の間に置き、もう一方の先端を小脳の上に置きます。中脳全体をつまんで取り除きます。中脳を冷やしたHBSSを入れたシャーレに、解剖顕微鏡で入れます。解剖顕微鏡の下で、脳セグメントを反転させて、腹側にアクセスできるようにします。これで、4 つの象限が表示されます。鉗子で髄膜を優しくつかみ、脳から上向きに引き離すことにより、髄膜と血管系をすべて取り除きます。次に、1トンの鉗子をセグメントのほぼ中央にある心室に配置します。次に、中脳を分離するために、背側につまみ、次に両側の内側につまみます。両側に横方向に切り込みを入れて、下の2つの象限を取ります。腹側被蓋領域と黒質部は腹側下部にあり、密集しているように見えます。VTAとSNCの両方を含む解剖した組織を、ペトリ皿の別の領域にある新鮮なHBSSに入れます。すべての脳セグメントを解剖した後、鉗子と11番のメスを使用して、各中脳セクションをほぼ同じサイズの断片に四つ切りにします。次に、ワイドボアのP1000ピペットチップを使用して、四分の一の中脳セグメントをすべて15ミリリットルの円錐管に移します。組織を沈降させ、HBSSを除去した後、500マイクロリットルのパパイン溶液を追加します。摂氏37度の水浴中で15分間インキュベートします。インキュベーション後、ワイドボアP1000チップを使用して、中脳セグメントのみを1ミリリットルのDNase I溶液に移し、セグメントがチューブの底に沈殿するのを待ちます。次に、中脳セグメントのみを、1ミリリットルのコールドストップ溶液を含む15ミリリットルのチューブに移します。2回目のすすぎ液を1ミリリットルの新鮮な停止液に交換し、P1000ピペットチップで7回上下にピペットで動かして細胞を粉砕します。次に、200マイクロリットルの4%BSA溶液をチューブの底にゆっくりとピペッティングして、細胞懸濁液を下敷きにします。280 x gで6分間遠心分離した後、上清をP1000で吸引し、細胞を1ミリリットルのめっき培地に再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞数を計数し、その後、細胞懸濁液をめっき培地で1000細胞/マイクロリットルに希釈します。ラミニンを吸引した直後に、ポリ-D-リジン、ポリ-L-オルニチン、およびラミニンでコーティングされた培養皿に細胞懸濁液120マイクロリットルをプレート化し、コーティングが乾燥して表面に凹凸を形成しないようにします。次に、1時間のインキュベーション後、細胞の破壊を最小限に抑えるために、培養皿の播種されていない領域に3ミリリットルの培地を慎重に加えます。3週間の培養後、2ミリリットルのRNaseフリーのDulbecco's PBSで培養皿をすすぎます。DPBSを取り外します。その後、収穫のために1ミリリットルの新鮮なDPBSと交換します。GFPフィルターセットと40倍対物レンズを倒立落射蛍光顕微鏡で使用して、培養物中の蛍光TH陽性ニューロンを同定します。細胞体の上にピペットにマイクロマニピュレーターを使用します。次に、マイクロピペットホルダーのサイドポートに取り付けられたプラスチックチューブを使用して、ニューロンをガラスマイクロピペットに吸引するために穏やかに吸引します。細胞が入ったマイクロピペットを直ちに浴液から取り出し、反応バッファーを含む0.2ミリターPCRチューブコレクション内にチップを入れます。先端をチューブの底部近くの側面にぶつけます。次に、滅菌済みの21ゲージシリンジ針をマイクロピペットの背面に置き、圧力を加えてマイクロピペットの壊れた先端から残りの液体を排出します。卓上微量遠心分離機を使用して収集チューブを5秒間遠心分離し、ドライアイスで凍結します。PCRキャビネット内で試薬を氷上またはチラーブロック上で作業しながら、室温で最初のマウスマスターミックスと10%の追加容量を調製します。そして、サンプルに3つのプライムプライマーの1マイクロリットルと1マイクロリットルの定量化されたRNAスパイク。次に、サンプルをサーモサイクラーで摂氏72度で3分間インキュベートし、サンプルを直接PCRクーラーラックに置きます。次に、調製したマスターミックス5.5マイクロリットルをPCRクーラーラックの反応チューブに加え、ピペッティングで穏やかに混合します。チューブを5秒間遠心分離した後、画面に表示されているパラメータに設定されたサーモサイクラーでインキュベートします。一本鎖cDNAを精製するには、25マイクロリットルの渦巻く室温磁気ビーズをサンプルに加えます。全容量を少なくとも10回上下にピペッティングして混合します。その後、室温で8分間インキュベートし、cDNAをビーズに結合させます。次に、液体が完全に透明になり、上清にビーズが残らなくなるまで、サンプルと磁気ビーズを磁気分離装置に置きます。上清を吸引して捨てます。サンプルを5秒間回転させて、チューブの側面から液体を収集します。サンプルを磁気分離装置に30秒間置きます。次に、P10ピペッターで残りの上清をすべて取り除き、DNAが結合したビーズだけを残します。ds-cDNA PCRマスターミックスを50マイクロリットル加え、次に2本鎖合成PCRプログラムを実行して二本鎖cDNAを取得します。このヒストグラムは、TH-eGFP陽性細胞から生成されたシングルセルドーパミン作動性RNAシーケンシングライブラリで検出されたタンパク質コード遺伝子の数を、マッピングされたリード100万あたりの転写産物のキロベースあたりの数を示しています。6, 000 から 8, 000 のタンパク質遺伝子が単一細胞ライブラリで検出されました。この技術を習得すると、細胞の誘導、培養中の細胞の成熟、細胞の採取とライブラリ生成のステップ、ライブラリのシーケンシング、および予備分析の時間を含め、4〜5週間で実行できます。この手順を試行する際には、RNAシークライブラリの生成と細胞採取のためのRNAseフリーのワークスペースを維持すること、細胞培養を通じて無菌技術を維持すること、および単一細胞採取に適した直径のピペットを作成することを覚えておくことが重要です。パラホルムアルデヒドの取り扱いは非常に危険であり、ドラフトの使用、皮膚や目の接触を避ける、熱や直火を避ける、適切な個人用防護服を着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。この手順に続いて、薬物治療がドーパミン作動性細胞のタンパク質発現にどのように影響するかなどの追加の質問に答えるために、遺伝子発現や遺伝子ネットワーク解析などの他の方法を実行できます。

reliable-identification-living-dopaminergic-neurons-midbrain-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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ここでは、ドーパミン作動性に（DA）ニューロンの年齢依存性神経変性を研究するために設立されている2つのアッセイを記述する...

神経変性表現型を評価する<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;クライミングアッセイによりドーパミン作動性ニューロンと脳全体の免疫染色

ドーパミン作動性ニューロンは、脳内で重要な調節役割を果たしています。それらの喪失はパーキンソン病に関連しています。このビデオでは、胚性マウス中脳から中枢ドーパミン作動性ニューロンの初代培養物を生成する方法を示します。このような培養物は、これらのニューロンがさまざまなストレスに対して非常に脆弱であることを研究するのに役立ちます。...

マウスドーパミン作動性ニューロンの初代培養

パーキンソン病中の中脳ドーパミン作動性ニューロンの変性の原因は完全には理解されていません。細胞培養システムは、これらのニューロンの神経生理学的特性を研究するための重要なツールを提供します。ここでは、神経変性のin...

胚性齧歯類の脳から単離、プライマリ脳ドーパミンニューロンの文化と長期メンテナンス

側坐核ドーパミン D1-アルファ受容体の同定は、中枢神経系疾患の中に D1 受容体の機能不全を明らかにするため重要です。特定の脳領域の RNA 分子を可視化する交配アッセイの in situ新規 RNA...

検出技術その場で革新的な RNA 側坐齧歯動物の核内ドーパミン D1-アルファ受容体の同定

培養ショウ ジョウバエ 脳外植体において静止期神経幹細胞を再活性化する方法が確立されている。この方法を用いて、神経幹細胞の静止、入口および退出の調節において、全身性シグナルの役割を組織内因性シグナルから切り離すことができる。...

ショウ ジョウバエ 脳外植における神経幹細胞の再活性化

このプロトコルは免疫学の汚損および得られた顕微鏡のハイコンテント画像からのニューロンの表現型のプロフィールの生成に先行している人間の中脳のdopaminergicニューロンの細胞の培養を、記述し、遺伝か化学調節による表現型の変化の同一証明を可能にする。...

ヒト幹細胞由来中脳ドーパミン作動性ニューロンの表現型プロファイリング

大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスには多くの遺伝子が関与しています。このプロトコルでは、移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージングの技術を紹介します。...

マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)は、拡大顕微鏡法と蛍光in...

Expansion-assisted iterative Fluorescence In Situ Hybridizationを用いたInsact Drosophila Brainにおける遺伝子発現のマルチプレックス検出

本研究は、多孔質膜挿入を用いて軸索mRNAを単離する堅牢な方法を提示し、全ニューロンと神経突起の分離およびRNA精製を可能にします。RTddPCRと組み合わせることで、低コピー転写体の絶対定量が可能となり、mRNA輸送および局所翻訳の研究を高感度、再現性、そして広範な実験応用で可能にします。...

多孔質膜挿入およびRTddPCRを用いた軸索mRNAの単離および定量

学ぶ、THプロモーター駆動EGFP発現とRNAシーケンスを用いてマウス中脳培養における生活ドーパミン作動性ニューロンを同定する方法。パーキンソン病研究における遺伝子発現解析と電気生理学的アッセイに応用可能です。

RNA配列決定およびTH-プロモーター駆動EGFP発現を使用して中脳培養における生活ドーパミン作動性ニューロンの信頼性の高い同定

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