Name: ミトコンドリアの構造と機能の研究にショウジョウバエ卵巣 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学ぶミトコンドリア構造と機能の解析法。Drosophila melanogaster卵巣を用いた生体・固定組織での顕微鏡観察技術により、ミトコンドリアの動態と調節機構を詳細に解明する方法を示します。

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私たちは、ショウジョウバエ培地の準備を手伝ってくれたリーナ・パテルとダイアモンド・ウッダードに感謝します。また、カメラに取り付けられた実体顕微鏡へのアクセスを提供してくれたイーゴリ・チェスノコフ博士に感謝します。

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</ol>

著者には競合する金銭的利益はありません。

プロトコル内の重要なステップ 光退色：蛍光サンプルの過度の光退色を防止することは、効率的な共焦点顕微鏡を実行することに絶対に必要です。したがって、接眼レンズを介してサンプルを検索したり、ライブ走査モードを介して画像取得パラメータを設定するために使用される時間は、光退色を最小にするために最小化されるべきです。 組織の損傷 ：ミトコンドリアは、細胞の健康のセンサであると考えられているので、それは記載された方法を用いて得られたデータは、生理学的に関連しており、 ショウジョウバエ卵巣の手続き切開によって引き起こされる過度の損傷を反映していないことを確実にするために極めて重要です。解剖は、組織の損傷を最小限にできる限り迅速に行われ、だけでなく、極端な予防措置とされるべきです。 5 ショウジョウバエ卵巣の解剖やからかいのための平均時間は、私たちの手に（7分に5です秒）。努力は分析から除外される損傷組織を示す卵室を識別するために注意しなければなりません。...

彼らは分化した細胞でのエネルギー産生の主な席があるので、ミトコンドリアは、古典的に、携帯大国として記載されています。また、ミトコンドリア等は1、代謝、発熱、脂質修飾、カルシウム及び酸化還元ホメオスタシスにおける細胞シグナル伝達プロセスのオーケストレーションに重要な役割を演じます。ミトコンドリアは、細胞死2、ならびに細胞周期調節3での誘導に積極的な役割を果たしています。このような多機能性は、以下の基本的な問題を提起する：a）どのようにミトコンドリアが同時にこれらすべての機能を実行し、異なる機能のために特化されている特定のミトコンドリアプールやサブゾーンb）はありますか？この文脈では、多官能性ミトコンドリアが、個々の細胞内での形状、大きさ、および構造に動的であること、およびミトコンドリアの定常状態の形状は、細胞型間で変化し得ることに留意することが重要です。様々な実験室からの研究の十年オラトリオは、ミトコンドリアの形状、大きさ、構造、総称ミトコンドリアのダイナミクスの変化は、様々なミトコンドリアの機能4,5,6を維持するために重要であることを示唆しています。これらの知見は、ミトコンドリアがそれらの構造的ダイナミズムのおかげで、それらの多機能化を達成することができる可能性を提起します。 大規模な努力がミトコンドリアの構造と機能の関係を理解するために進行中です。ミトコンドリアの構造のダイナミズムは、主として、互いに分裂および融合事象を受ける能力によって維持されます。 2つの小さなミトコンドリアの融合が大きくミトコンドリア素子7にそれらをマージしながら、大規模なミトコンドリアの分裂は、より小さなミトコンドリアの要素に変換します。また、2ミトコンドリアの一過性の融合は、その内容の混合を可能にするために発生することがあります。内側と外側のミトコンドリア膜の分裂と融合イベントは慎重仕様によって支配されていますタンパク質のIFICセット。コア核分裂機械はDRP1機能もによって調節することができる一方で、特定の善意のミトコンドリアタンパク質（ 例えば、Fis1またはMff1）との相互作用によってミトコンドリアに細胞質ゾルから募集されたダイナミン関連タンパク質1（DRP1）、から構成されていますミトコンドリアの表面4上の他のタンパク質。 DRP1は、外膜で動作しますが、その核分裂能力は、同様に内膜に影響を与えます。外側と内側のミトコンドリア膜の分裂のオーケストレーションが十分に理解されていません。 mitofusinsは、外膜5の融合を支配しながら、一方で、内膜の融合は、OPA1の活動によりコアに支配されています。ミトコンドリアの対抗核分裂と核融合イベントのバランスは、細胞内の定常状態のミトコンドリア形状を決定します。例えば、ミトコンドリア分裂の抑制は、ミトコンドリアの過活動しながら、完全かつ無競争の融合をもたらすであろうリットルの核分裂はミトコンドリア3の断片化をもたらすであろう。 ミトコンドリアの構造と機能の関係の研究は、主に次の2つの相補的なアプローチを含む：a）は、ミトコンドリア分裂/融合タンパク質の遺伝子操作した後、細胞および生物表現型の分析およびb）ミトコンドリアの構造と機能の直接評価。表現型が原因で二次的な影響を生じる可能性があるとして、遺伝的分析はいつも、（この場合は、ミトコンドリアの分裂/融合タンパク質）手元にある分子の直接の機能を明らかにしない可能性があることに注目すべきです。したがって、直接ミトコンドリアの構造および機能を研究するためのツールを開発し、使用するために極めて重要です。ミトコンドリアの構造のいずれかの評価は、様々な顕微鏡ツールを必要とします。ミトコンドリアの活力を定性的およびquantitatモニターすることができるので、生細胞の蛍光顕微鏡法の使用は、ミトコンドリアの動力学の研究を大幅に進んでいますively適切な蛍光顕微鏡のツールとテクニック8を使用して。蛍光顕微鏡ベースのツールは、 インビボ 9 ミトコンドリアダイナミズムの意義を解明する、ライブ固定キイロショウジョウバエ組織においてミトコンドリアの構造および機能を研究するために開発されてきました。これらおよび関連する方法は、 ショウジョウバエ卵巣でミトコンドリアの構造と機能を研究することを目的に、ここで説明します。 ショウジョウバエの卵巣は、胚腺10,11内に存在し、それぞれの成体幹細胞から生じる生殖系列および体細胞系統、で構成されています。十六合胞体胚細胞（のGC）は、胚腺（ 図1）から出てくる個々の卵室を形成するために体包細胞（FCS）によってカプセル化されます。 16のGCの一つは、卵母細胞になることを約束します、そして残りの15 GCは卵母細胞チャンバの成長を支援ナース細胞に発展しますそれが載置される前に、卵の成熟を促進します。これらは末端前方包細胞（AFCS）、後方包細胞（PFC類）、及び本体細胞からなるパターン化された上皮細胞層に分化する分裂細胞周期を出る前に、FCの大半は、有糸分裂の9ラウンドを受ける（MBCS） 。連続卵室が早期開発中のFCに由来する細胞を分化さ茎細胞によって接続されています。ミトコンドリア分裂タンパク質DRP1によって規制ミトコンドリアの形状は、積極的にショウジョウバエ卵巣FC層9,12の正常な発達の間、分化の過程に関与しています。 ショウジョウバエ卵胞細胞層の発達にDRP1の関与を同定するために、これらの研究で使用した方法は、ここに記載されています。

<table><tbody><tr><td>Grace's Media (昆虫解剖媒体)</td><td>Fisher Scientific</td><td>30611031-2</td><td></td></tr><tr><td>41 パラホルムアルデヒドAQ</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>50-259-99</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Green (全体的にミトコンドリア染色)</td><td>Life Technologies</td><td>m7514</td><td>再構成およびアリコート</td></tr><tr><td>テトラメチルローダミン エチルエステル過塩素酸塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>87917-25MG</td><td></td></tr><tr><td>MitoSox(Mito-Ros染色)</td><td>Life Technologies</td><td>m36008</td><td></td></tr><tr><td>PolyLysine</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN15017625</td><td></td></tr><tr><td>Fly Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-515</td><td></td></tr><tr><td>Fly Conicals</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-355</td><td></td></tr><tr><td>Fly Vial Flugs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS273</td><td></td></tr><tr><td>Fly Conical Flugs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS 277</td><td></td></tr><tr><td>Jazzmix Drosophila food (ショウジョウバエ食品)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS153</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cyclin E 抗体 (d-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc- 33748</td><td></td></tr><tr><td>ATPB 抗体 [3D5] - ミトコンドリアマーカー</td><td>AbCam</td><td>ab14730</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-175-144</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Fisher Scientific</td><td>H100</td><td></td></tr><tr><td>Azer Scientific EverMark Select 顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-026-252</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>マットテックコーポレーション&nbsp;ガラス底 Mircrowell ディッシュ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>活性乾燥酵母</td><td>フィッシャーサイエンティフィック ICN10140001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>ファインサイエンステクノロジーズ</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>モリアニッケルメッキピンホルダー</td><td>ファインサイエンステクノロジー</td><td>ズ 26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Minutien</td>ピン<td>ファインサイエンステクノロジー</td><td>ズ26002-15</td><td></td></tr><tr><td>MYFP(w [*];P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )</td><td>ブルーミントンストックセンター</td><td>7194</td><td></td></tr><tr><td>フライパッド</td><td>フライスタッフ</td><td>59-118</td><td></td></tr><tr><td>ブローガン</td>フライ<td>スタッフ</td><td>54-104</td><td></td></tr><tr><td>ブローガンニードル</td><td>フライスタッフ</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td>ステミ 2000</td><td></td></tr><tr><td>分析ソフトウェア</td><td>カールツァイス</td><td>ゼン&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>解析ソフトウェア</td><td>オープンソース</td><td>画像 J</td><td></td></tr><tr><td>Research マクロズーム顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>QICAM Fast 1394 冷却デジタルカメラ、12ビット、モノ&nbsp;</td><td>QImaging</td><td>QIC-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>QCapture Pro 5.1</td><td>QImaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ミトコンドリアの構造と機能の研究にショウジョウバエ卵巣

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

ミトコンドリアの機能制御メカニズムを完全に理解するためには、ミトコンドリアの構造と機能の関係の分析が必要です。蛍光顕微鏡法は、生細胞のミトコンドリアの構造と機能を直接評価し、主にミトコンドリア間の分裂と融合を支配する分子によって調節されるミトコンドリアの構造と機能の関係を研究するために不可欠なツールです。この論文では、モデル生物であるDrosophila melanogasterの生組織および固定組織におけるミトコンドリアの構造と機能を研究するための具体的な方法について説明し、実証します。ここで選択される組織はショウジョウバエの卵巣であり、これを分離してex vivoライブ共焦点顕微鏡法に適したものにすることができます。さらに、この論文では、ショウジョウバエの卵巣におけるミトコンドリア分裂タンパク質Drp1を遺伝的に操作する方法を説明し、Drp1によるミトコンドリア分裂がミトコンドリアの構造と機能の関係を調節する関与を研究しています。このような方法の広範な使用は、すでに発表されたデータだけでなく、新しいデータでも実証されています。記載された方法は、栄養素および/または成長因子が生体外でミトコンドリア特性に及ぼす直接的な影響の理解に向けてさらに拡張することができる。ミトコンドリアの調節不全がさまざまな疾患の病因の根底にあることを考えると、遺伝的に扱いやすいモデル生物であるショウジョウバエで開発された革新的な方法は、ミトコンドリアの構造と機能の関係のメカニズムの詳細の理解とミトコンドリア指向の治療戦略の開発に大きく貢献することが期待されます。

記載の方法は、生きて固定ショウジョウバエ卵巣（ 図2B）にミトコンドリアの構造および機能を研究するために使用することができます。記載された方法を用いて得られた期待結果のいくつかの例が提供されます。 ショウジョウバエ卵巣の解剖 ：さらに解剖すると、全体のショウジョウバエ （ 図3A）から切断腹部（ 図3B）は、各個々のショウジョウバエから2卵巣を含め、腹部内容物を放出する必要があります。無傷の卵巣は、理想的には、卵管茎を介して相互に接続されたままべき楕円形、白構造（ 図3C及びD中の矢印）として表示されます。各卵巣内ovariolesは、Bを除去して線維鞘（ 図3Cの...

ミトコンドリアの機能制御メカニズムを完全に理解するためには、ミトコンドリアの構造と機能の関係の分析が必要です。この論文では、生きたショウジョウバエの卵巣と固定された卵巣のミトコンドリアの構造と機能を研究するための具体的な方法について説明し、実証しています。

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

この手順の全体的な目標は、モデル生物ショウジョウバエ メラノガスターの生体組織および固定組織におけるミトコンドリアの構造と機能を研究する方法を実証することです。この方法は、ミトコンドリア生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。ミトコンドリア機能の調節メカニズムなど。この手法の主な利点は、ミトコンドリアの構造と機能の関係を詳細に分析できることです。テキストプロトコルに従って麻酔をかけた5匹の雌のハエを選別した後、解剖顕微鏡下で、2対の鉗子を使用して腹部から胸部を切断します。次に、腹部を皿の2番目のウェルに慎重に移します。一方の鉗子を使用して腹部を後端に保持し、もう一方の鉗子のペアを使用して卵巣をゆっくりと押し出します。次に、鉗子を使用して個々の卵巣を不透明な後端で保持し、からかいまたは固定するために皿の3番目のウェルに慎重に移動します。一対の鉗子を使用して後端を保持し、後端から前端にからかい針を軽く掃くことにより、卵巣の周りから保護シースを慎重にからかいます。ポリリセンコーティングチャンバーを調製するには、ガラス底のペトリ皿のカバーガラスに2つの分離した20マイクロリットルのポリリセン滴を置きます。プレートを摂氏37度で1時間風乾し、プレートの下側にポリリジンの輪郭を描きます。画像取得ソフトウェアを開いて共焦点顕微鏡のスキャンパラメータを設定し、取得タブで適切なスキャンパラメータを設定します。時系列、漂白、および地域のボックスをチェックして、個々のタブを開きます。次に、各タブに適切な取得パラメータ値を入力します。次に、解剖してからかった卵巣をマークされたポリリジンコーティング領域に置き、ティーシング針を使用して卵巣を広げ、卵巣を分離します。10マイクロリットルの昆虫解剖培地を卵巣の上に置き、ポリリジンコーティング領域全体を覆うようにします。次に、ペトリ皿に蓋をします。卵巣をマウントした直後に、サンプルを顕微鏡ステージに置き、接眼レンズを使用して、生組織の関心フィールドをすばやく特定します。「ライブ」をクリックして、選択した対象フィールドのライブ画像を取得し、「停止」をクリックしてライブスキャンを停止します。必要に応じて、検出された蛍光シグナルが、オフセット値を調整して設定された定義されたバックグラウンドで飽和レベルを下回るように、集録パラメータを調整します。グラフィックタブから、ベジェ描画ツールを使用して小さなROIを描画し、スキャンによって取得した画像上の写真の漂白ゾーンを区切ります。次に、[実験の開始]をクリックして画像取得を実行します。蛍光ミトコンドリア色素で生染色を行うには、温かい解剖培地で染色液を希釈し、最終作業濃度にします。解剖とからかいが以前に示された後、卵巣を解剖皿のウェルに200マイクロリットルの染色液に入れます。皿をアルミホイルで包んだ箱で覆って光から保護し、ティッシュを10分間インキュベートします。次に、鉗子を使用して染色した卵巣を洗浄し、染色のない培地を含む3つの連続したウェルに慎重に移動します。TMREとの共染色では、適合する全体ミトロコンドリア染色において、まずTMREによる染色を行い、次に組織を洗浄せずに、直ちにサンプルを全体ミトコンドリア染色に移します。このビデオで前述したように卵巣を洗浄して埋入した後、サンプルの共焦点イメージングを実行するには、Zセクショニングボックスをチェックしてタブを開きます。ライブスキャン中にフォーカスホイールをサンプルの底に向け、set-firstをクリックして最下部のZセクションを定義します。次に、フォーカスホイールを反対方向に動かして、最上部を定義します。[実験の開始]をクリックして画像取得を行います。生体Xvivamicroscopyの場合、データは組織のマウントから15分以内に取得されるべきであり、そうでなければ、実験結果は組織の死による生理機能の変化によって影響を受ける可能性があります。解剖直後、ドラフトの下で卵巣を200マイクロリットルの新鮮な室温のPFAにガラス解剖皿のウェルに入れます。組織を15分間インキュベートして固定します。テキストプロトコルに従ってPBSで卵巣を洗浄した後、PBSに留まったまま、卵巣をからかって、抗体からの抗原アクセスを妨げる可能性のある保護繊維シースを慎重に取り除きます。からかった卵巣を、PBS中の0.5%トライタン×100マイクロリットルの500マイクロリットルのマイクロヒューズチューブに入れて透過処理します。次に、チューブを蓋付きの箱に入れ、25RPMで30分間揺らします。テキストプロトコルに従ってPBS / TXを取り外し、0.5%PBS / TXに溶解した200マイクロリットルのBSAを追加して組織をブロックします。サンプルをロッカーで室温で1時間インキュベートします。ブロッキング溶液を除去した後、抗狂犬病デスクリンE抗体と抗マウスATPB抗体を添加します。組織をロッカー上で室温で2時間インキュベートします。インキュベーション後、PBS-TXを使用して卵巣を3回、それぞれ15分間洗浄します。次に、200マイクロリットルの適切な二次抗体と新鮮なPBS-TXを加え、室温で1時間インキュベートします。ティッシュを2回洗った後、3回目の洗濯にフックを追加します。次に、1ミリリットルのマイクロピペットで、免疫染色された卵巣をマイクロヒューズチューブから取り出し、200マイクロリットルのPBSを含むガラス解剖皿の新鮮なウェルに入れます。スライドガラスにグリセロールベースの封入剤を1滴加え、免疫染色した卵巣を1つずつ封入剤に加えます。解剖顕微鏡下で、卵巣の不透明な部分を鉗子で保持しながら、からかい針を使用して、不透明な成熟卵室から透明な卵巣をそっと摘み取ります。次に、成熟した卵チャンバーを封入培地から取り出します。スライド上にカバーガラスを載せ、軽く押すことで封入剤が均一に広がるようにします。サンプルを15分間風乾してから、マニキュアを使用して端をシールします。最後に、必要に応じて共焦点顕微鏡検査を行います。ここに示すように、神経細胞に関連するミトコンドリア雲の1つをターゲットとしたフリップは、赤のフリップROIを囲む青と白のROIから200秒以内に蛍光シグナルを50%以上失うことになりますが、黄色のコントロールROIは漂白が最小限に抑えられます。ドロソフィラ卵巣は、組織の深さとともに信号の減少を示し、ライブイメージング中にTMREやミトステインなどのフロロフォアを検出できる組織の最大深さを識別することが重要です。TMREとの共染色および全体的なミトコンドリア染色による定性分析により、ゲルマリウム乾燥体はステージ2Bで単位質量あたりのミトコンドリア電位が高いことが示されています。この図では、ステージ9の卵室から分析したAFCとMBCの単位質量あたりのミトコンドリア電位の違いを半定性分析で示しています。これらの画像は、有糸分裂および有糸分裂後のドリソフィラ卵胞細胞でマイトソックスの取り込みが起こることを示しています。この実験では、コイムノ染色により、ゲルマリウムおよびステージ9の卵室で、ミトコンドリアATPBシグナルおよびGFP陰性DRP1ノールクローンと重複するデサイクリンシグナルの上昇が同定されます。記載された方法は、他のドリソフィラ組織におけるミトコンドリア構造機能を研究するために修正し、採用することができる。このビデオを見た後、ミトコンリアの構造と機能を研究するために、固定および生きたドリソフィラ卵巣を解剖、染色、および画像化する方法を十分に理解しているはずです。

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