ミトコンドリアの構造と機能の研究にショウジョウバエ卵巣

この手順の全体的な目標は、モデル生物ショウジョウバエ メラノガスターの生体組織および固定組織におけるミトコンドリアの構造と機能を研究する方法を実証することです。この方法は、ミトコンドリア生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。ミトコンドリア機能の調節メカニズムなど。

この手法の主な利点は、ミトコンドリアの構造と機能の関係を詳細に分析できることです。テキストプロトコルに従って麻酔をかけた5匹の雌のハエを選別した後、解剖顕微鏡下で、2対の鉗子を使用して腹部から胸部を切断します。次に、腹部を皿の2番目のウェルに慎重に移します。

一方の鉗子を使用して腹部を後端に保持し、もう一方の鉗子のペアを使用して卵巣をゆっくりと押し出します。次に、鉗子を使用して個々の卵巣を不透明な後端で保持し、からかいまたは固定するために皿の3番目のウェルに慎重に移動します。一対の鉗子を使用して後端を保持し、後端から前端にからかい針を軽く掃くことにより、卵巣の周りから保護シースを慎重にからかいます。

ポリリセンコーティングチャンバーを調製するには、ガラス底のペトリ皿のカバーガラスに2つの分離した20マイクロリットルのポリリセン滴を置きます。プレートを摂氏37度で1時間風乾し、プレートの下側にポリリジンの輪郭を描きます。画像取得ソフトウェアを開いて共焦点顕微鏡のスキャンパラメータを設定し、取得タブで適切なスキャンパラメータを設定します。

時系列、漂白、および地域のボックスをチェックして、個々のタブを開きます。次に、各タブに適切な取得パラメータ値を入力します。次に、解剖してからかった卵巣をマークされたポリリジンコーティング領域に置き、ティーシング針を使用して卵巣を広げ、卵巣を分離します。

10マイクロリットルの昆虫解剖培地を卵巣の上に置き、ポリリジンコーティング領域全体を覆うようにします。次に、ペトリ皿に蓋をします。卵巣をマウントした直後に、サンプルを顕微鏡ステージに置き、接眼レンズを使用して、生組織の関心フィールドをすばやく特定します。

「ライブ」をクリックして、選択した対象フィールドのライブ画像を取得し、「停止」をクリックしてライブスキャンを停止します。必要に応じて、検出された蛍光シグナルが、オフセット値を調整して設定された定義されたバックグラウンドで飽和レベルを下回るように、集録パラメータを調整します。グラフィックタブから、ベジェ描画ツールを使用して小さなROIを描画し、スキャンによって取得した画像上の写真の漂白ゾーンを区切ります。

次に、[実験の開始]をクリックして画像取得を実行します。蛍光ミトコンドリア色素で生染色を行うには、温かい解剖培地で染色液を希釈し、最終作業濃度にします。解剖とからかいが以前に示された後、卵巣を解剖皿のウェルに200マイクロリットルの染色液に入れます。

皿をアルミホイルで包んだ箱で覆って光から保護し、ティッシュを10分間インキュベートします。次に、鉗子を使用して染色した卵巣を洗浄し、染色のない培地を含む3つの連続したウェルに慎重に移動します。TMREとの共染色では、適合する全体ミトロコンドリア染色において、まずTMREによる染色を行い、次に組織を洗浄せずに、直ちにサンプルを全体ミトコンドリア染色に移します。

このビデオで前述したように卵巣を洗浄して埋入した後、サンプルの共焦点イメージングを実行するには、Zセクショニングボックスをチェックしてタブを開きます。ライブスキャン中にフォーカスホイールをサンプルの底に向け、set-firstをクリックして最下部のZセクションを定義します。次に、フォーカスホイールを反対方向に動かして、最上部を定義します。

[実験の開始]をクリックして画像取得を行います。生体Xvivamicroscopyの場合、データは組織のマウントから15分以内に取得されるべきであり、そうでなければ、実験結果は組織の死による生理機能の変化によって影響を受ける可能性があります。解剖直後、ドラフトの下で卵巣を200マイクロリットルの新鮮な室温のPFAにガラス解剖皿のウェルに入れます。

組織を15分間インキュベートして固定します。テキストプロトコルに従ってPBSで卵巣を洗浄した後、PBSに留まったまま、卵巣をからかって、抗体からの抗原アクセスを妨げる可能性のある保護繊維シースを慎重に取り除きます。からかった卵巣を、PBS中の0.5%トライタン×100マイクロリットルの500マイクロリットルのマイクロヒューズチューブに入れて透過処理します。

次に、チューブを蓋付きの箱に入れ、25RPMで30分間揺らします。テキストプロトコルに従ってPBS / TXを取り外し、0.5%PBS / TXに溶解した200マイクロリットルのBSAを追加して組織をブロックします。サンプルをロッカーで室温で1時間インキュベートします。

ブロッキング溶液を除去した後、抗狂犬病デスクリンE抗体と抗マウスATPB抗体を添加します。組織をロッカー上で室温で2時間インキュベートします。インキュベーション後、PBS-TXを使用して卵巣を3回、それぞれ15分間洗浄します。

次に、200マイクロリットルの適切な二次抗体と新鮮なPBS-TXを加え、室温で1時間インキュベートします。ティッシュを2回洗った後、3回目の洗濯にフックを追加します。次に、1ミリリットルのマイクロピペットで、免疫染色された卵巣をマイクロヒューズチューブから取り出し、200マイクロリットルのPBSを含むガラス解剖皿の新鮮なウェルに入れます。

スライドガラスにグリセロールベースの封入剤を1滴加え、免疫染色した卵巣を1つずつ封入剤に加えます。解剖顕微鏡下で、卵巣の不透明な部分を鉗子で保持しながら、からかい針を使用して、不透明な成熟卵室から透明な卵巣をそっと摘み取ります。次に、成熟した卵チャンバーを封入培地から取り出します。

スライド上にカバーガラスを載せ、軽く押すことで封入剤が均一に広がるようにします。サンプルを15分間風乾してから、マニキュアを使用して端をシールします。最後に、必要に応じて共焦点顕微鏡検査を行います。

ここに示すように、神経細胞に関連するミトコンドリア雲の1つをターゲットとしたフリップは、赤のフリップROIを囲む青と白のROIから200秒以内に蛍光シグナルを50%以上失うことになりますが、黄色のコントロールROIは漂白が最小限に抑えられます。ドロソフィラ卵巣は、組織の深さとともに信号の減少を示し、ライブイメージング中にTMREやミトステインなどのフロロフォアを検出できる組織の最大深さを識別することが重要です。TMREとの共染色および全体的なミトコンドリア染色による定性分析により、ゲルマリウム乾燥体はステージ2Bで単位質量あたりのミトコンドリア電位が高いことが示されています。

この図では、ステージ9の卵室から分析したAFCとMBCの単位質量あたりのミトコンドリア電位の違いを半定性分析で示しています。これらの画像は、有糸分裂および有糸分裂後のドリソフィラ卵胞細胞でマイトソックスの取り込みが起こることを示しています。この実験では、コイムノ染色により、ゲルマリウムおよびステージ9の卵室で、ミトコンドリアATPBシグナルおよびGFP陰性DRP1ノールクローンと重複するデサイクリンシグナルの上昇が同定されます。

記載された方法は、他のドリソフィラ組織におけるミトコンドリア構造機能を研究するために修正し、採用することができる。このビデオを見た後、ミトコンリアの構造と機能を研究するために、固定および生きたドリソフィラ卵巣を解剖、染色、および画像化する方法を十分に理解しているはずです。