Name: 検出するための実験プロトコールシアノバクテリア抗体マイクロアレイチップと液体と固体試料中の (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 学ぶシアノバクテリアの蛍光マイクロアレイ免疫測定法による液体・固体試料中の複数菌株検出法。環境モニタリングと水質管理において、毒素産生細菌の早期発見と生物多様性評価に有用です。

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私たちは、シアノバクテリア菌株を提供するために大学自治・デ・マドリードから博士アントニオ・ケサダに感謝します。この作品は、スペイン語MINISTERIOデエコノミアのy Competitividad（MINECO）のSubdirección一般デProyectosデInvestigaciónによって資金を供給された、無許可します。 AYA2011-24803とESP2014-58494-R。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、CYANOCHIP、シアノバクテリア属の広い範囲の検出および同定のための17-抗体マイクロアレイを用いて、多重蛍光サンドイッチ免疫測定法は、22に記載されています。これらのシアノバクテリアは、そのうちのいくつかは毒素生産され、淡水生息地の中で最も頻繁に底生やプランクトンの属を表します。最近、蛍光サンドイッチイムノアッセイ形式が、環境のアプリケーション26、27、28中の微生物および/またはbioanalytesを識別するために使用されています。 （I）固定化または捕捉抗体を特異的に試験試料から分析物を結合することと、（ii）蛍光標識された抗体（トレーサーまたは検出抗体）を用いて分析物 - 抗体ペアを検出：プロトコルは、主に次の2つのステップに基づいています。サンドイッチアッセイは、のために、検体中に少なくとも2個のアクセス抗体の結...

複雑な自然の微生物群集中の微生物の検出と監視は生物医学、環境、エコロジー、そして宇宙生物学などの多くの分野で重要です。淡水中の細胞の花（過剰増殖）を形成する能力についてよく知られている原核微生物はシアノバクテリアです。彼らは遍在している、と多くの種は、ヒトの健康に対する潜在的なリスクに、だけでなく、生態系への影響のみならず大手、毒素を産生することができます。この点では、 シアノバクテリアおよび/または土壌及び水中のそれらの毒素の早期検出のための迅速かつ高感度な方法を開発することが不可欠です。水管理者が適切な水管理プログラムを実施する際に、結果的に、決定にそれらを助けるために、この目的のために、多重蛍光サンドイッチマイクロアレイイムノアッセイ（FSMI）のツールとして開発されました。 方法の多様な範囲は、シアンを検出および同定するために開発されています光学顕微鏡、分子生物学、および免疫学的技術を含む土壌や水にobacterial細胞およびシアノトキシン、。これらの方法は、それらが提供する情報に大きく異なります。顕微鏡技術は、細胞の形態や、フィコシアニンやクロロフィル1とシアノバクテリア顔料、からの生体内蛍光の検出に基づいています。彼らは、試料中に存在するシアノバクテリアの種類と数をお知らせリアルタイムおよび頻繁なモニタリングのための迅速かつ安価な方法であるが、それらは潜在的な毒性に関する情報を与えることはありません。さらに、彼らは、しばしば密接に関連した種2を区別することは非常に困難であることを考慮して、専門知識の特定のレベルを必要とします。これらの制限を克服するために、光学顕微鏡は、生物学的および生化学的スクリーニングアッセイおよびシアノトキシンの同定および定量のための物理化学的方法の両方を添付しなければなりません。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、タンパク質リン阻害アッセイ（PPIA）、およびマウスにおける神経化学的試験は、シアノトキシンを検出するための生化学的スクリーニングアッセイの例です。最初の二つは、迅速かつ高感度な方法論であるが、使用してELISAおよびPPIAテストは毒素の3種類に制限されている場合、偽陽性が記載されています。マウスバイオアッセイは、低感度および精度の質的な技術であり、特別なライセンスやトレーニングが必要です。また、試料中に存在する毒素の種類についての情報を与えません。シアノトキシン例えば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などの他の分析方法によって同定及び定量することができる、液体クロマトグラフィー - 質量分析（LC-MS）、ガスクロマトグラフィー（GC）、ガスクロマトグラフィー - 質量分析（GC-MS）またはマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間（MALDI-TOF）。参照標準、必要とされる場合は、これが唯一の可能性であります複雑なサンプル中の個々の毒素濃度を決定するためのedは、3、4ご利用いただけます。また、これらの方法は時間がかかります。高価な機器、消耗品、およびサンプル調製を必要とします。そして、経験豊富な専門スタッフによって行われなければなりません。 分子ベースの方法は、ゲノムデータベースに公開された配列情報のおかげで、検出、同定、およびシアノバクテリアとそれらに対応するシアノトキシンを定量化するために数十年にわたって適用されている（ 例えば、バイオテクノロジー情報、NCBIのための国立センター）。これらの方法の中でDNAの増幅のためのプライマーセットの設計を必要とし、別のシアノバクテリア種のDNA配列の予備知識に依存してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づくものです。遺伝子の検出は、フィコシアニンオペロンのように、属レベルでの正確な同定をもたらす一方で、一部の種や菌株がで検出されませんこの方法。しかしながら、このようなミクロオペロンに属するものとして毒素をコードする遺伝子は、プロデューサ5不足しているサンプル中の毒素の同定を容易にします。それにもかかわらず、PCRによる毒素マーカーの検出は、必ずしも環境に毒性を示すものではありません。また、 シアノバクテリアの種と試料中に存在する毒素生産の全範囲を分析するために開発されたプライマーのセットは、まだ不完全であり、更なる研究は、未知の種を同定するために行われなければなりません。他の分子技術は、 蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）およびDNAマイクロアレイなどの非PCRベースです。 過去20年間では、マイクロアレイ技術は、特に環境モニタリングでは、アプリケーションの多くの分野で重要性を増しています。 DNAマイクロアレイは、種との検体4の間の識別、6、7を可能に</SUP&gt;、8、9、10、それらは非常に面倒で時間がかかる複数のステップ（ 例えば、マイクロアレイの性能、DNA抽出、PCR増幅、およびハイブリダイゼーション）を伴う作業を考えています。そのため、例えば、サンドイッチおよび競合免疫学的マイクロアレイのような抗体に基づいてより少ない時間のかかるアッセイは、多数の環境の分析物11、12、13の検出のために不可欠で信頼性の高いハイスループット法となっています。抗体の能力は、特に、それらの標的化合物を認識し、ほとんどすべての物質に対する抗体を産生する可能性とともに、検体およびタンパク質の少量を検出するために、抗体マイクロアレイを環境目的のための強力な技術を作ります。また、複数を達成する能力は、として分析しますイングルアッセイは、ppmのppbの範囲の検出限界で、この方法14の主な利点の1つです。 抗体ベースのバイオセンサーは、環境モニタリング15、16、17、18、19、20、21中の病原体および毒素の広い範囲を検出するための高感度かつ迅速なツールであることが判明しています。 DNA法は、いくつかのステップを含むが、抗体ベースのマイクロアレイは、主に適切なソリューションバッファ内の短い溶解段階に基づいて、小さなサンプル調製を必要とします。 DelehantyとLigler 15 4 PPBのANのタンパク質濃度を検出することができる抗体サンドイッチ免疫測定法に基づいて、複雑な混合物中のタンパク質および細菌分析物の同時検出を報告しD 10細胞の4 CFU / mLです。 Szkola ら。 21は生物兵器に使用されるかもしれないproteotoxinsと小さな毒素、化合物の同時検出のための安価で信頼性の高いマルチプレックスマイクロアレイを開発しました。彼らは20分未満で、3 ppbでの検出限界で、リシン毒素の濃度を検出しました。最近、CYANOCHIP、毒性および非毒性のシアノバクテリアのin situ検出のための抗体マイクロアレイベースのバイオセンサーは、22に記載されています。このマイクロアレイは、主に顕微鏡的に識別することが困難である水生環境で、潜在的なシアノバクテリアブルームの同定を可能にします。でも、種レベルで、多重検出およびシアノバクテリアの同定のための費用対効果の高いツールにこのバイオセンサーを回すほとんどの種のために10 3細胞、 -マイクロアレイの検出限界は10 2です。これらのプロパティはすべてantiboを作りますDYマイクロアレイ技術、およびこの仕事で提示特に方法、前述の技術に比べて迅速かつ簡単な方法。 この作品は、土壌と水のサンプル中のシアノバクテリアの存在を検出するために抗体マイクロアレイベースのバイオセンサーを使用した実験の2つの例を示します。これは、非常に少量の試料と非常に基本的なサンプル調製を必要とするサンドイッチイムノアッセイフォーマットに基づいて簡単かつ信頼できる方法です。この方法は、短い時間を必要とし、容易フィールドで行うことができます。

<table><tbody><tr><td>0.22 mmの細孔径フィルター</td><td>ミリポア</td><td>GSWP04700</td><td>免疫原の調製用</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; 5424R 微量遠心分離機</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td></td><td>免疫原の調製用</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) pH 7.4 (10x)</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>70011036</td><td>50 mM リン酸カリウム、150 mM NaCl、pH 7.4</td></tr><tr><td>超音波プロセッサ UP50H</td><td>ヒールシャー</td><td></td>免疫<td>原の調製のために完全な</td></tr><tr><td>フロイントのアジュバント&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5881</td><td>免疫増強剤</td></tr><tr><td>不完全 フロイトのアジュバント</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F5506</td><td>ブースト注射用</td></tr><tr><td>プロテインA抗体精製キット&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>PURE1A&nbsp;</td><td>IgGの単離</td></tr><tr><td>遠心フィルター装置 MWCO<100 kDa</td><td>Millipore</td><td>UFC510096-96K</td><td>IgG</td></tr><tr><td>透析チューブの単離、ベンゾイル化</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7884-10FT</td> IgG <td></td></tr><tr><td>Illustra Microspin G-50 カラム</td>の単離用&nbsp;<td>GE-HealthCare</td><td>GE27-5330-02</td><td>IgG</td></tr><tr><td>Bradford試薬</td>の単離<td>用 Sigma-Aldrich</td><td>B6916-500 mL</td><td>抗体濃度を定量するには</td></tr><tr><td>MicroBCAタンパク質アッセイキット&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23235</td><td>抗体濃度を定量化するには</td></tr><tr><td>Protein arraying buffer 2x</td><td>Whatman (Sigma Aldrich)&nbsp;</td><td>S00537</td><td>印刷バッファー; 30 - 40% グリセロール 1x PBS と 0.01% Tween</td></tr><tr><td>20 Tween 20&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>P9416</td><td>非イオン性界面活性剤</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9418</td><td>Control&nbsp; 印刷用; ブロッキング試薬</td></tr><tr><td>384ウェル マイクロプレート</td><td>Genetix</td><td>X6004</td><td>抗体印刷</td></tr><tr><td>用 ロボットアレイ Digilab</td><td></td><td>社製 MicroGrid II TASアレイ</td><td>抗体印刷用</td></tr><tr><td>エポキシ基板ガラススライド</td><td>Arrayit corporation</td><td>VEPO25C</td><td>抗体印刷用ソリッドサポート</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-647スクシンイミジルエステル&nbsp;</td><td>分子プローブ</td><td>A20006</td><td>蛍光色素</td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>D8418</td><td>蛍光色素溶解</td></tr>剤 <tr><td>ハイドルフ タイトラマックス 振動プラットフォームシェーカー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td><td></td>ック <td>抗体標識用&nbsp;</td></tr><tr><td>Illustra Microspin G-50カラム&nbsp;</td><td>ヘルスケア</td><td>27-5330-01</td><td>標識抗体の精製用</td></tr><tr><td>セーフシール ブラウン 0.5 mL チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>72,704,001</td><td>標識抗体の保管用&nbsp;</td></tr><tr><td>Nanodrop 1000 分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>抗体濃度と標識効率を定量化するには</td></tr><tr><td>3 &micro;m細孔サイズポリカーボネート47mm直径</td>フィルター<td>ミリポア</td><td>TMTP04700</td>細胞<td>を濃縮するために</td></tr><tr><td>1Mトリズマ塩酸塩溶液pH8</td>シ<td>グマアルドリッチ&nbsp;</td><td>T3038</td><td>TBSTRR調製用;スライドをブロックするために塩化</td></tr><tr><td>ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S7653</td><td>TBSTRR調製用</td></tr><tr><td>20 &micro;mナイロンフィルター&nbsp;</td><td>ミリポア</td><td>NY2004700</td><td>環境抽出物調製用</td></tr><tr><td>10 - 12 mmフィルターホルダー</td><td>ミリポア</td><td>SX0001300</td><td>環境抽出物調製用</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P8340</td><td>環境抽出物保存用</td></tr><tr><td>1 M Trizma 塩酸塩溶液 pH 9</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T2819</td><td>スライドをブロックするには</td></tr><tr><td>ハイドルフ デュオマックス 1030 ロッキングプラットフォーム シェーカー</td><td>VWR</td><td></td><td>スライドをブロックするには、インキュベーションプロセス用&nbsp;</td></tr><tr><td>VWR ギャラクシー ミニアレイ微量遠心分離機</td><td>VWR</td><td>C1403-VWR</td><td>スライドを乾燥させる</td></tr><tr><td>マルチウェルマイクロアレイハイブリダイゼーションカセット</td><td>Arrayit corporation</td><td>AHC1X24</td><td>スライドあたり24アッセイのカセット</td></tr><tr><td>GenePix 4100A マイクロアレイスキャナー&nbsp;</td><td>蛍光用</td><td>分子デバイス</td><td></td>スキャナー</tr><tr><td>GenePix Proソフトウェア</td><td>画像解析・定量用</td><td>分子デバイス</td><td></td>ソフトウェア</tr></tbody></table>

検出するための実験プロトコールシアノバクテリア抗体マイクロアレイチップと液体と固体試料中の

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

地球温暖化や富栄養化は、いくつかの水生生態系が急速かつ大規模なシアノバクテリアの成長をトリガとして、真のバイオリアクターを動作させます。これは、関連する健康と経済的な影響を持っています。多くのシアノバクテリア菌株は毒素生産者である、とだけ少数の細胞は、環境に取り返しのつかない損傷を誘発するために必要です。したがって、水体当局との投与は、それらの予防的もしくは治療的な意思決定をサポートするために信頼できるデータを提供する迅速かつ効率的な早期警報システムを必要とします。この原稿は、分類学上の解像度（CYANOCHIP）で17抗体（ABS）を有する抗体マイクロアレイチップを使用して、毒素産生シアノバクテリア株のインフィールド検出のための実験プロトコルを報告します。ここでは、17シアノバクテリア株の同時モニタリングのための多重蛍光サンドイッチマイクロアレイイムノアッセイ（FSMI）が頻繁に淡水生態系に咲く発見、それらのいくつかの毒素生産者は、記載されています。マルチでのマイクロアレイPLE CYANOCHIPの（24まで）同一の複製を同時にサンプルの同様の数をテストするために、単一の顕微鏡スライド上に印刷しました。液体試料は、1〜3ミクロンのフィルターを通して濾過することにより、抗体との直接的インキュベーション（ABS）または細胞濃度後のいずれかで試験することができます。そのような堆積物とグランド石のような固体サンプルを、最初のインキュベーション緩衝液中のハンドヘルド超音波処理によって均質化し、分散しています。粗物質を除去し、ろ液をABSでインキュベートする - それらは、次いで、（20ミクロン5）濾過します。免疫反応は、17蛍光標識Abの混合物で最終インキュベーションによって明らかにされており、可搬型蛍光検出器によって読み取られます。全体のプロセスは、そのほとんどが、インキュベーションの2 1時間の期間に対応し、約3時間かかります。出力は、明るいスポットは、シアノバクテリアマーカーの陽性検出に対応した画像です。

この作品はCYANOCHIP抗体マイクロアレイを用いて、最も関連性の高い淡水シアノバクテリア種の同時同定（ 表1）のためのマルチプレックスイムノアッセイテストを説明します。マイクロアレイは、顕微鏡スライド上に印刷された3×8マイクロアレイフォーマットすることができます。各マイクロアレイは、陰性対照としてトリプリケートスポットパターンで印刷17抗体のセット、それらの対応する免疫前抗体およびBSAから構成されています。マイクロアレイはまた、簡単にマイクロアレイパターン22（ 図1）をローカライズするために、蛍光標識された免疫前抗体を用いて、蛍光のフレームが含まれます。 マイクロアレイはマドリードの街を供給する淡水ロソヤ貯水池の海岸で採取した水試料のその場での分析のためのフィールドで試験しました。サンプルは、上記のように処理し...

人間が消費する淡水貯留層にシアノバクテリア毒素が存在することは、水管理当局にとって大きな懸念事項です。水質汚染のリスクを評価するために、この記事では、抗体マイクロアレイチップを使用して、液体および固体サンプル中のシアノバクテリア株を野外で検出するためのプロトコルについて説明します。

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

この手順の全体的な目標は、蛍光マイクロアレイイムノアッセイを使用して、液体および固体サンプル中の複数のシアノバクテリア株の存在を決定することです。この方法は、ブルームが肉眼で見えるようになる前に、毒素を生成する毒素がプロトキシン産生細菌の存在など、環境、モニタリング、および水管理の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、複数のシアノバクテリア株と複数のサンプルを、in situまたは実験室の両方で3時間から4時間の間に同時に監視できることです。したがって、これらの方法は生物多様性についての洞察を提供することができます。また、農業設備の監視、ひずみ環境での生命検出、惑星探査など、他の分野にも適用できます。一般的に、この方法に不慣れな個人は苦労しません。サンプル処理が簡単で、結果の解釈が容易だからです。テキストプロトコルに従って抗体を作製および精製した後、標識用色素を含む市販のバイアルに100マイクロリットルのDMSOを加え、1ミリグラムのタンパク質を添加します。色素が溶解したら、各抗体調製物の50マイクロリットルに2マイクロリットルの色素を加えて、精製した抗体を標識します。ラベリング反応を、振動プラットフォーム上で連続的に攪拌し、周囲温度で1時間維持します。テキストプロトコルに従って標識抗体を精製した後、分光光度計に小さなアリコートをロードし、280ナノメートルと650ナノメートルでの吸光度を測定します。サプライヤーの推奨事項に従って、ラベリング効率を計算します。CYANOCHIPを作製するには、Tween 20の1容量あたり01%の容量の1Xタンパク質印刷バッファーに1ミリグラムの抗体を混合することにより、精製された各抗体を30マイクロリットル調製します。コントロールとして、次の印刷ソリューションを30マイクロリットル準備します。Tween 20の体積あたり01%の容量を持つ1Xタンパク質印刷バッファー。01%Tween 20および01%Tween 20および01%Tween 20を含む1ミリリットルあたり1ミリグラムのBSAおよび1Xタンパク質印刷バッファー中の1ミリグラム/ミリリットルで精製された免疫前血清。調製した印刷溶液のウェルあたり30マイクロリットルを高品質の384ウェルマイクロプレートに追加します。テキストプロトコルに従って印刷ロボットとスライド基板をセットアップした後、すべての抗体とコントロールをスライド上に約180〜200ミクロンのスポット直径の3重のスポットパターンでスポットします。環境でのサンプリングには、滅菌シリンジを使用して1〜100ミリリットルの液体を採取し、サンプルを3ミクロンの細孔サイズフィルターに通して細胞を濃縮します。必要に応じて、岩石や土壌から固体サンプルを採取し、滅菌チューブに保管します。サンプルは、小規模なフィールドラボでアッセイできます。1ミリリットルの抽出インキュベーションバッファーを加えて、フィルターに集めたバイオマスを回収し、スパラーを使用してフィルターを15ミリリットルのチューブにこすり落とします。ハンドヘルド超音波プロセッサを使用するか、数回ピペッティングすることで、この凝集体とサンプルの均質化を行います。さらに、別の10ミリリットルチューブに最大0.5グラムの固体サンプルを計量し、最大2ミリリットルの抽出バッファーを追加します。超音波処理器プローブをチューブに浸し、ハンドヘルド超音波プロセッサまたは他の超音波処理装置で超音波処理します。サンプルを氷上に保持しながら、30キロヘルツで少なくとも5回の30秒サイクルを実行し、超音波処理の合間に30秒間停止します。イムノアッセイ用の濾液抽出物を調製するには、10ミリリットルのシリンジと5〜20ミクロンの細孔サイズのナイロンフィルターホルダーを組み合わせて溶液をろ過し、1.5ミリリットルのチューブにろ過して、砂、粘土、その他の粗い材料を取り除きます。マイクロアレイスポットを下に向けて、スライドを100〜200マイクロリットルのブロッキング溶液に置き、3〜5分間インキュベートします。先端がプラスチック製の鉗子を使用し、マイクロアレイゾーンを避けて、スライドを慎重に持ち上げます。スライドを新鮮なブロッキング溶液に浸し、スライドを軽度の攪拌で30分間インキュベートします。スライドを乾燥させるには、顕微鏡スライドに適合した遠心分離機に入れ、短時間回転させます。プロバイダーの指示に従って、スライドを3×8ウェルのマイクロアレイハイブリダイゼーションカセットにセットアップします。あるいは、抗体の印刷パターンを変更した後、ここに示すようなカスタムメイドのカセットをセットアップするか、単にカバースライドを使用してセットアップします。スライドとカセットの組み立て後、各サンプル抽出物を最大50マイクロリットルまでピペットで移すか、抽出インキュベーションバッファーで希釈してカセットの各ウェルに入れます。あるいは、サンプルを他のインキュベーションデバイスにロードするか、単にカバースライドを使用します。ブランクコントロールとして、50マイクロリットルのTBSTRRバッファーをカセットの少なくとも2つの別々のウェルにピペットで移します。サンプルを周囲温度で1時間インキュベートし、15分ごとにピペッティングして混合するか、摂氏4度で12時間インキュベートします。マイクロアレイを洗浄するには、カセットを下にして、清潔な吸収紙に慎重に軽くたたきます。次に、ウェルに150マイクロリットルの抽出インキュベーションバッファーをそれぞれに加えてウェルを洗浄し、以前と同様に吸収紙をたたいてバッファーを取り除きます。洗濯をさらに3回繰り返します。各ウェルに、17種類の抗シアノバクテリア株抗体を含む蛍光抗体混合物を50マイクロリットル加えます。サンプルを周囲温度で1時間、または摂氏4度で12時間インキュベートします。マイクロアレイを洗浄するには、カセットを慎重に下に置き、清潔な吸収紙に軽くたたきます。次に、150マイクロリットルの抽出インキュベーションバッファーを加えてから、ペーパータオルで軽くたたいて取り出します。洗濯を3回繰り返します。次に、カセットを分解し、スライドを0.1X PBS溶液に浸してすばやくすすぎます。以前と同様に素早く遠心分離し、スライドを乾燥させます。蛍光スキャナーを使用して、スライドをスキャンして、遠赤色蛍光色素の最大発光ピークで蛍光を発します。ゲイン値を変更して、異なるスキャンパラメータでマイクロアレイの複数の画像を撮影します。最後に、グリッドをロードし、定量化してから、テキストプロトコルに従ってデータを処理および分析します。このビデオで実証されているCYANOCHIPマルチプレックスイムノアッセイは、この表にリストされている最も関連性の高い淡水シアノバクテリア種の同時同定をテストするために使用されました。淡水貯留層の海岸で採取した水サンプルを、マイクロアレイアッセイを用いて分析しました。主な陽性免疫反応は、プランクトン性シアノバクテリアmicrocystis種および底生性leptolyngbya種に対する抗体に対応していました。プランクトン性鼻腔アファニゾメノン種、アナバエナ種、ミクロシスティス・フロス・アクアエ、底生リブラリア種では、より低い蛍光シグナルが得られました。マイクロアレイは、シアノバクテリアマーカーの存在をテストするために、南極の乾燥微生物マットをアッセイすることによっても検証されました。抗体の陽性反応は、底生シアノバクテリア、アナバエナ種、およびレプトリンビヤ種に対して生成されました。さらに、ミクロシスティス種、アファニゾメノン種、プランクトスリック・ルベッセンス種などのプランクトン性シアノバクテリアに対する抗体を用いて、陽性の免疫反応が検出されました。最後に、これらのシグナルは、tolypothrix種やanabaena種を含む他の底生生物種に対する抗体から得られたものです。一度習得すると、この技術は、抗体の産生とレベリングを除いて、適切に実行されれば、3、4時間で行うことができます。サンプルと蛍光抗体を同時にインキュベートすることで、1時間短縮できます。これらの手順を試みる際には、蛍光抗体混合物を最適な使用希釈率で抗体を準備しておくことを忘れないでください。これらの手順に続いて、光学顕微鏡法やDNA抽出、特異的PCR増幅などの他の方法を実行して、土壌濃度などの追加の質問に答えたり、検出された菌株の種類を確認したりすることができます。開発後、この技術は、環境モニタリングの分野の研究者が、サンプルの種類に関係なく、バイカルチャープロセス、淡水管理、または微生物生態学研究で水域を探索するための道を開くでしょう。このビデオを見れば、蛍光による抗体の標識方法、抗体マイクロアレイの操作方法、マルチプレックスイムノアッセイの実施方法、マイクロアレイイムノアッセイ結果の分析と解釈の方法について十分に理解できるはずです。超音波での作業は危険な場合があり、これらの手順を実行する際には、耳の保護具の着用やその他の特定のケア対策を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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