検出するための実験プロトコールシアノバクテリア抗体マイクロアレイチップと液体と固体試料中の

この手順の全体的な目標は、蛍光マイクロアレイイムノアッセイを使用して、液体および固体サンプル中の複数のシアノバクテリア株の存在を決定することです。この方法は、ブルームが肉眼で見えるようになる前に、毒素を生成する毒素がプロトキシン産生細菌の存在など、環境、モニタリング、および水管理の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、複数のシアノバクテリア株と複数のサンプルを、in situまたは実験室の両方で3時間から4時間の間に同時に監視できることです。

したがって、これらの方法は生物多様性についての洞察を提供することができます。また、農業設備の監視、ひずみ環境での生命検出、惑星探査など、他の分野にも適用できます。一般的に、この方法に不慣れな個人は苦労しません。

サンプル処理が簡単で、結果の解釈が容易だからです。テキストプロトコルに従って抗体を作製および精製した後、標識用色素を含む市販のバイアルに100マイクロリットルのDMSOを加え、1ミリグラムのタンパク質を添加します。色素が溶解したら、各抗体調製物の50マイクロリットルに2マイクロリットルの色素を加えて、精製した抗体を標識します。

ラベリング反応を、振動プラットフォーム上で連続的に攪拌し、周囲温度で1時間維持します。テキストプロトコルに従って標識抗体を精製した後、分光光度計に小さなアリコートをロードし、280ナノメートルと650ナノメートルでの吸光度を測定します。サプライヤーの推奨事項に従って、ラベリング効率を計算します。

CYANOCHIPを作製するには、Tween 20の1容量あたり01%の容量の1Xタンパク質印刷バッファーに1ミリグラムの抗体を混合することにより、精製された各抗体を30マイクロリットル調製します。コントロールとして、次の印刷ソリューションを30マイクロリットル準備します。Tween 20の体積あたり01%の容量を持つ1Xタンパク質印刷バッファー。

01%Tween 20および01%Tween 20および01%Tween 20を含む1ミリリットルあたり1ミリグラムのBSAおよび1Xタンパク質印刷バッファー中の1ミリグラム/ミリリットルで精製された免疫前血清。調製した印刷溶液のウェルあたり30マイクロリットルを高品質の384ウェルマイクロプレートに追加します。テキストプロトコルに従って印刷ロボットとスライド基板をセットアップした後、すべての抗体とコントロールをスライド上に約180〜200ミクロンのスポット直径の3重のスポットパターンでスポットします。

環境でのサンプリングには、滅菌シリンジを使用して1〜100ミリリットルの液体を採取し、サンプルを3ミクロンの細孔サイズフィルターに通して細胞を濃縮します。必要に応じて、岩石や土壌から固体サンプルを採取し、滅菌チューブに保管します。サンプルは、小規模なフィールドラボでアッセイできます。

1ミリリットルの抽出インキュベーションバッファーを加えて、フィルターに集めたバイオマスを回収し、スパラーを使用してフィルターを15ミリリットルのチューブにこすり落とします。ハンドヘルド超音波プロセッサを使用するか、数回ピペッティングすることで、この凝集体とサンプルの均質化を行います。さらに、別の10ミリリットルチューブに最大0.5グラムの固体サンプルを計量し、最大2ミリリットルの抽出バッファーを追加します。

超音波処理器プローブをチューブに浸し、ハンドヘルド超音波プロセッサまたは他の超音波処理装置で超音波処理します。サンプルを氷上に保持しながら、30キロヘルツで少なくとも5回の30秒サイクルを実行し、超音波処理の合間に30秒間停止します。イムノアッセイ用の濾液抽出物を調製するには、10ミリリットルのシリンジと5〜20ミクロンの細孔サイズのナイロンフィルターホルダーを組み合わせて溶液をろ過し、1.5ミリリットルのチューブにろ過して、砂、粘土、その他の粗い材料を取り除きます。

マイクロアレイスポットを下に向けて、スライドを100〜200マイクロリットルのブロッキング溶液に置き、3〜5分間インキュベートします。先端がプラスチック製の鉗子を使用し、マイクロアレイゾーンを避けて、スライドを慎重に持ち上げます。スライドを新鮮なブロッキング溶液に浸し、スライドを軽度の攪拌で30分間インキュベー

スライドを乾燥させるには、顕微鏡スライドに適合した遠心分離機に入れ、短時間回転させます。プロバイダーの指示に従って、スライドを3×8ウェルのマイクロアレイハイブリダイゼーションカセットにセットアップします。あるいは、抗体の印刷パターンを変更した後、ここに示すようなカスタムメイドのカセットをセットアップするか、単にカバースライドを使用してセットアップします。

スライドとカセットの組み立て後、各サンプル抽出物を最大50マイクロリットルまでピペットで移すか、抽出インキュベーションバッファーで希釈してカセットの各ウェルに入れます。あるいは、サンプルを他のインキュベーションデバイスにロードするか、単にカバースライドを使用します。ブランクコントロールとして、50マイクロリットルのTBSTRRバッファーをカセットの少なくとも2つの別々のウェルにピペットで移します。

サンプルを周囲温度で1時間インキュベートし、15分ごとにピペッティングして混合するか、摂氏4度で12時間インキュベートします。マイクロアレイを洗浄するには、カセットを下にして、清潔な吸収紙に慎重に軽くたたきます。次に、ウェルに150マイクロリットルの抽出インキュベーションバッファーをそれぞれに加えてウェルを洗浄し、以前と同様に吸収紙をたたいてバッファーを取り除きます。

洗濯をさらに3回繰り返します。各ウェルに、17種類の抗シアノバクテリア株抗体を含む蛍光抗体混合物を50マイクロリットル加えます。サンプルを周囲温度で1時間、または摂氏4度で12時間インキュベー

マイクロアレイを洗浄するには、カセットを慎重に下に置き、清潔な吸収紙に軽くたたきます。次に、150マイクロリットルの抽出インキュベーションバッファーを加えてから、ペーパータオルで軽くたたいて取り出します。洗濯を3回繰り返します。

次に、カセットを分解し、スライドを0.1X PBS溶液に浸してすばやくすすぎます。以前と同様に素早く遠心分離し、スライドを乾燥させます。蛍光スキャナーを使用して、スライドをスキャンして、遠赤色蛍光色素の最大発光ピークで蛍光を発します。

ゲイン値を変更して、異なるスキャンパラメータでマイクロアレイの複数の画像を撮影します。最後に、グリッドをロードし、定量化してから、テキストプロトコルに従ってデータを処理および分析します。このビデオで実証されているCYANOCHIPマルチプレックスイムノアッセイは、この表にリストされている最も関連性の高い淡水シアノバクテリア種の同時同定をテストするために使用されました。

淡水貯留層の海岸で採取した水サンプルを、マイクロアレイアッセイを用いて分析しました。主な陽性免疫反応は、プランクトン性シアノバクテリアmicrocystis種および底生性leptolyngbya種に対する抗体に対応していました。プランクトン性鼻腔アファニゾメノン種、アナバエナ種、ミクロシスティス・フロス・アクアエ、底生リブラリア種では、より低い蛍光シグナルが得られました。

マイクロアレイは、シアノバクテリアマーカーの存在をテストするために、南極の乾燥微生物マットをアッセイすることによっても検証されました。抗体の陽性反応は、底生シアノバクテリア、アナバエナ種、およびレプトリンビヤ種に対して生成されました。さらに、ミクロシスティス種、アファニゾメノン種、プランクトスリック・ルベッセンス種などのプランクトン性シアノバクテリアに対する抗体を用いて、陽性の免疫反応が検出されました。

最後に、これらのシグナルは、tolypothrix種やanabaena種を含む他の底生生物種に対する抗体から得られたものです。一度習得すると、この技術は、抗体の産生とレベリングを除いて、適切に実行されれば、3、4時間で行うことができます。サンプルと蛍光抗体を同時にインキュベートすることで、1時間短縮できます。

これらの手順を試みる際には、蛍光抗体混合物を最適な使用希釈率で抗体を準備しておくことを忘れないでください。これらの手順に続いて、光学顕微鏡法やDNA抽出、特異的PCR増幅などの他の方法を実行して、土壌濃度などの追加の質問に答えたり、検出された菌株の種類を確認したりすることができます。開発後、この技術は、環境モニタリングの分野の研究者が、サンプルの種類に関係なく、バイカルチャープロセス、淡水管理、または微生物生態学研究で水域を探索するための道を開くでしょう。

このビデオを見れば、蛍光による抗体の標識方法、抗体マイクロアレイの操作方法、マルチプレックスイムノアッセイの実施方法、マイクロアレイイムノアッセイ結果の分析と解釈の方法について十分に理解できるはずです。超音波での作業は危険な場合があり、これらの手順を実行する際には、耳の保護具の着用やその他の特定のケア対策を常に講じる必要があることを忘れないでください。