変更されたカフを用いた膵臓移植マウス モデル
2017年12月16日
腹部臓器移植、膵臓移植は早期グラフトの損失に最終的につながる重症虚血再灌流傷害関連付けられているグラフト損傷を開発する傾向があります。このプロトコルでは、これらの初期、劇物の被害解析に最適な非縫合腱を用いたマウス膵移植のモデルについて説明します。
私の名前はベンノ・カルディーニで、インスブルック医科大学内臓・移植・胸部外科のダニエル・スワロフスキー研究所に所属しています。今日は、修正カフ技術を使用した膵臓移植用のマウスモデルを紹介します。ドナー動物にケタミンとキシラジンの腹腔内注射で麻酔をかけ、腹部を剃ります。
次に、レシピエントを仰臥位の手術野に置き、クロルヘキシジンで手術部位を3回こすります。.次に、恥骨領域から剣状突起まで正中線開腹術を行い、切開部を両側に肋骨下方向に拡大して、術野をよりよく見渡します。次に、内臓を左側に外部化し、ヘパリンを腎下大静脈に注入します。
次のステップでは、左腎静脈の交差部に近接する腹部大動脈を特定し、大動脈を弱体化させ、その時点で結束します。次に、肝臓の門に移動し、肝臓に近い総胆管を特定して解剖し、膵臓の近くで結紮します。最後に、結紮糸の上の総胆管を横断します。
次に、肝臓の近くで門脈を解剖して、静脈吻合に十分な長さを達成します。ヒントとして、肝臓の小片を門脈に残して、後で簡単に識別できるようにします。次に、大動脈周囲組織の左腎静脈を弱体化させ、結紮します。
次に、腎静脈と大動脈周囲組織を横断し、結紮糸の右側に留まります。次に、腹腔体幹から横隔膜まで腹部大動脈をぶっきらぼうに解剖し、横隔膜に近い大動脈を弱体化させ、その時点で横断します。次に、すべての腰椎枝を特定して凝固させ、それらを横断します。
次に、前に設定した結紮糸の下で大動脈を横断します。次に、門脈から廃液が出てくるのが見えるまで、氷冷灌流溶液で大動脈パッチを介して膵臓を灌流します。上部には灌流された門脈が見え、下には灌流された大動脈が見えます。
次に、内臓を腹腔に交換し、8-0を使用して膵臓を腸から段階的に分離しますシルクの合字。幽門後領域から始めて、十二指腸を2回弱体化させ、8-0を引きますそれを通して絹の結紮糸。次に、それを結紮し、膵臓を十二指腸から鋭く分離します。
このアプローチは、トレイツの靭帯に到達するまで繰り返し行われます。十二指腸は、汚染の可能性があるため、移植片を実験から除外するため、損傷を与えないことが不可欠です。膵臓が十二指腸から完全に分離した後、腸間膜に移動し、それを弱体化させて結紮し、次にそれを切除します。
前のステップと同様に、膵臓を横行結腸から分離し、それを弱体化させ、結紮し、最後に横行します。次に、同じアプローチを使用して、結紮後に膵臓を胆道領域から鋭く解剖することにより、胆道領域から膵臓を分離します。その後、胃から膵臓を鈍く解剖します。
左胃動脈を特定し、結紮して横断します。最後に、付着した脾臓で膵臓を切除し、さらに着床するまで氷冷再灌流溶液に入れます。脾臓をハンドルとして使用します。
ドナーと同様に、ケタミンとキシラジンの腹腔内注射でレシピエント動物に麻酔をかけ、子宮頸部を剃ります。その後、ドナー動物を仰臥位で手術野に置き、クロルヘキシジンで子宮頸部を3回こすります。次に、頸静脈切開から右下顎角までの皮膚切開を行います。
次に、右外頸静脈のすべての側枝を特定し、それらを動員し、それらを弱体化させ、バイポーラ凝固後にそれらを分割します。その後、右顎下腺の下極をつかみ、頭蓋骨から持ち上げ、栄養血管の双極凝固後に解剖します。次に、バイポーラ凝固後の右外頸静脈のすべての内側枝を横断します。
外頸静脈をできるだけ頭蓋骨に2倍結紮し、結紮糸間で分割します。外頸静脈の近位端をポリエチレンカフに通します。ここでは、カフのハンドルが手術医に面していることが重要です。
次のステップとして、外側から来る微小血管静脈クランプを配置します。次に、静脈をヘパリンで湿らせ、結紮糸を取り除き、ポリエチレンカフの上に静脈をそっと引っ張ります。最後に、円形の8-0でカフの上に静脈を固定します背中に1つ、前に3つの結び目があるシルクの結紮糸。
右総頸動脈にアクセスするには、近位および遠位凝固後に右胸鎖乳突筋を動員して横断します。その後、迷走神経などの隣接する構造を傷つけないように注意しながら、総頸動脈を穏やかに動員します。静脈に類推して、総頸動脈をできるだけ頭蓋状に2回結紮し、結紮糸間で分割します。
次に、血管を動脈カフに通します。最後に、内側から来る微小血管クランプで動脈カフを固定します。次に、結紮糸を取り外し、血管拡張器を使用して動脈の内腔を広げます。
内腔を十分に広げた後、動脈を動脈カフの上に引っ張ります。最後に、静脈に例えて、8-0で動脈を固定しますシルクリガチャー。ここでは、動脈静脈吻合のために修復された静脈と動脈を見ることができます。
移植のためには、移植片を頸部の湿らせたエースに置きます。次に、ポータル静脈を8-0で引き抜きますシルクリガチャーループ、張力のない吻合のために静脈を短くし、次に門脈を静脈カフの上に引っ張ります。最後に、円で静脈を固定します 8-0シルクリガチャー。
静脈と同様に、大動脈の切り株を結紮ループに通し、大動脈を短くします。次に、大動脈を動脈カフの上に引っ張り、最後に円形の8-0で固定しますシルクリガチャー。再灌流の前に、脾臓血管を特定して結紮し、最後にそれらを鋭く解剖して脾臓を取り除きます。
再灌流の場合は、最初に静脈クランプを取り外し、次に動脈クランプを取り外します。移植片の適切な再灌流は、動脈の目に見える脈動と移植片全体のピンクがかった色を示しています。移植片を常温生理食塩水で湿らせます。
創傷を閉じる前に、血管のねじれを避けるために静脈カフのハンドルを取り外してください。最後に、6-0ランニング縫合糸で創傷を閉じ、0.5ミリリットルの常温生理食塩水を皮下に注入します。モデルを検証するために、移植した膵臓の内分泌機能を試験しました。
マウスは、手術の4日前にストレプトゾトシンによる前処理によって低血糖症になり、血糖値が300ミリグラムパーセントを超える場合、低血糖と見なされました。.このラインショットは、移植されていない生きた対照マウスの血糖値を赤で示し、長期の寒冷虚血時間にさらされていない移植片のレシピエントの血糖値を青で示しています。さらに、16時間の寒冷虚血時間に曝露された膵臓移植片のレシピエントの血糖値は緑色で示されています。
生きたマウスは、観察期間全体にわたって低血糖のままでした。対照的に、長期の低温虚血時間にさらされなかった膵臓移植片の移植は、24時間以内に正常な血糖をもたらし、移植片の内分泌機能を確認しました。16時間の低温虚血時間に曝露された移植片の移植は、レシピエントの正常な血糖を回復しませんでした。
さらに、このグループでは、初期の移植片損傷に関連する虚血再灌流障害のために、すべてのマウスを48時間以内に犠牲にしなければなりませんでした。このビデオでは、非縫合カフ技術を使用したマウスの膵臓移植の方法を紹介しました。これは、技術的にも顕微鏡的にも実現可能であり、優れた成功率を誇ります。
しかし、管閉塞による膵臓の進行性線維症を考えると、このモデルは、移植片の損傷に関連する以前の虚血再灌流障害に焦点を当てた研究領域に最も適
していると考えています。概要
本記事では、非縫合カフ法を用いたマウス膵臓移植モデルの詳細なプロトコルを紹介します。この手法は、虚血再灌流障害およびそれが移植片の生存能に及ぼす影響を研究する際に特に有用です。
主要な研究構成要素
科学分野
- 移植生物学
- 虚血再灌流傷害
- マウスモデル
背景
- 膵臓移植片は虚血再灌流障害を受けやすい。
- このような障害は、早期の移植片喪失につながる可能性がある。
- これらのメカニズムを理解することは、移植成績を向上させるために極めて重要である。
- 本研究では、この分野の研究を促進するための新しい手術手技を紹介する。
研究目的
- 膵臓移植の信頼性の高いマウスモデルを確立すること。
- 虚血再灌流傷害による移植片の早期損傷を解析すること。
- 移植片の生存率を高める可能性のある手術手技を改良すること。
使用した手法
- 麻酔および手術部位の洗浄によるドナーマウスの準備。
- 腹部臓器にアクセスするための正中切開。
- 移植前の膵臓の摘出および灌流。
- レシピエントマウスの準備およびカフ法を用いた血管吻合。
主な結果
- 膵臓移植モデルの構築に成功した。
- 血管接続における非縫合カフ法の実証。
- 移植後のグラフト生存能に関する初期観察。
- 虚血再灌流障害の影響に関するさらなる研究の可能性。
結論
- 非縫合カフ法は、マウスにおける膵臓移植に有効である。
- このモデルは、移植片損傷のメカニズムを研究するために利用できる。
- 今後の研究により、移植片保存のための戦略が改善される可能性がある。
よくある質問
産業上の重要性
本プロトコルは、再現性の高いマウス膵臓移植を高い成功率で実現することを可能にし、移植片不全における虚血再灌流傷害の機序研究を支援します。非縫合カフ法（non-suture cuff technique）を用いることで血栓形成による合併症が軽減され、移植片保存戦略の前臨床評価における開通性と信頼性が向上します。これにより、移植生物学におけるターゲット検証、特に初期段階の移植片損傷機序に関する拡張可能なプラットフォームが提供されます。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 膵臓移植片における虚血再灌流経路に関連する治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： 90%以上の成功率で、機能的ターゲット検証のための生物学的に適切なシステムを提供する。
- 予測的価値： 移植片保存介入のメカニズム的なリスク低減に向けた、前臨床モデルの開発を支援する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値：血管の完全性と機能の定量的評価に向けて、標準化され再灌流可能なグラフトを作製する。
- 運用的価値：カフを用いた一貫性のある吻合と高い開存率により、アッセイの再現性を確保する。
- 拡張性：手順の簡便さと堅牢性により、複数の実験群にわたるプラットフォームの再利用を容易にする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性： ヒト膵臓移植における臨床的な虚血再灌流障害に関連した、初期の移植片損傷をモデル化します。
- バイオマーカーの整合性： 移植片の生存能のトランスレーショナルバイオマーカーとして、内分泌機能回復の評価をサポートします。
- リスク調整済みの進展： 長時間の冷虚血曝露がある移植片とない移植片を判別し、実施可否（go/no-go）の決定を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットバリデーションから前臨床モデルの精緻化に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれるものであり、特にリード化合物の同定に先立つ血管グラフト保存戦略の評価を可能にします。
- 基礎生物学研究： 再灌流後の早期移植片損傷の分子メカニズムに関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング： 再灌流の成功と移植片の開存性に関する定量的な出力が得られ、アッセイにそのまま利用可能な血管接続を提供します。
- 分析： 再灌流の可視性、移植片の色調、血糖値の回復など、条件間の比較分析が可能な測定エンドポイントを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： 糖尿病レシピエントモデルにおける内分泌機能評価を通じて、前臨床検証へと繋げます。
- 企業の再利用： 移植設定における細胞保護剤や抗炎症化合物の反復試験に利用可能な、再利用可能な外科的プラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：虚血再灌流障害モデルにおけるメカニズムの曖昧さを軽減することで、予測の信頼性を高める。
- 運用的価値：微小外科的血管吻合において、標準化、再現性、および拡張性を提供する。
- 戦略的価値：移植プログラムにおけるゴー/ノーゴー判断の質を向上させ、後期の生物学的リスクを軽減する。
- ポートフォリオへの影響：機能的な再灌流結果に基づいた、リスク調整済みの移植片保存候補の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 血管の剥離、結紮、およびカフの操作におけるマイクロサージャリーの専門技術が必要です。
- 血管拡張器、微小血管クランプ、および縫合器具などの精密機器に依存します。
- 術者チーム間での灌流および再灌流プロトコルの標準化が必要です。
- 異なるマウス系統やグラフトサイズに対する適応上の検討が含まれます。
- 長期グラフトにおける管閉塞に伴う線維化のため、虚血再灌流研究に限定されます。
