Name: 低密度初代海馬ニューロンの文化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 46 s
Description: 学ぶ低密度初代海馬ニューロンの培養法。神経膠細胞層上にニューロンを浮遊させて高純度培養を実現し、高解像度イメージングと機能アッセイに最適な方法を解説します。

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<ol><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Res. 126, 397-425 (1977).</li>
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</ol>

著者は、開示することは何もありません。

神経細胞を培養する「サンドイッチ」法は他の場所2、11、よく説明してきたが、それを採用したい研究者のための欲求不満につながることができ、テキストだけで説明するのは非常に困難なプロトコルを通して、いくつかのステップがあります。 グリア培養、カバースリップ調製ニューロン培養および維持：この方法は、3つの広いワークフローに分割することができます。 3つの製剤のそれぞれは、高品質のニューロン培養物のために重要であり、いくつかの重要な考慮事項は念頭に置いておく必要があります。ニューロンをメッキする前に、グリアフィーダー層は、理想的にはアストロサイトの均一な集団であるべきで、50から70パーセントの合流点の間にあります。これは、グリアフィーダー層から十分な栄養支持を確実にするでしょう。アストログリア文化はATTAC緩くしている他の細胞型、特にミクログリア、最小限の汚染を持っていることを確認することが重要ですHEDと丸みを帯びた細胞。ニューロンの健康と生存<sup class="...

脳は、神経細胞の複雑なネットワークに編成されます。ネットワークアクティビティと脳機能への個々のニューロンの寄与は、それらの分子組成およびそれらの生理学的特性の摂動を選択的に変更することによって研究することができます。個々の神経細胞の遺伝的および化学的操作は、後者の細胞の不均一性と複雑さによって邪魔されない、完全な脳組織よりも培養ニューロンで間違いなく簡単です。培養中のニューロンは、明確に定義された軸索及び樹状アーバを開発し、互いに広範囲シナプス結合を形成します。 成体動物から、または神経系の他の領域からニューロン培養は可能であるが、胚海馬培養物は、しばしば、それらの定義された錐体細胞集団と比較的低いグリア密度1,2に好ましいです。培養物中の低密度で成長させた海馬神経細胞は、特にAMEあります細胞内局在、タンパク質輸送、神経細胞の極性とシナプスの開発の研究にNABLE。培養中のニューロンはまた、広範囲シナプス可塑3、4、5、6分子プロセスを研究に使用されてきました。出生後生存しないグローバルな遺伝的欠失を有するマウスからの神経細胞培養物は、特定の遺伝子7の細胞とシナプスの役割を研究する際に特に有用でした。 脳のように、培養海馬神経細胞はグリア細胞からの栄養支持に依存しています。これは、彼らの文化を複雑にし、このサポートが供給されることにより、いくつかの異なる方法の開発につながっています。 1つの一般的に使用される方法は、グリア細胞8の単層上に直接ニューロンをメッキ、又は取得したヒップから汚染グリア細胞を許すことを含みますocampal組織が増殖し、ニューロン9の下の単層を形成します。この方法はある程度の成功を発見したが、得られた神経細胞培養物の不純物は、画像化実験のために不利です。ニューロン培養物の別の一般的に使用される方法は、完全グリアフィーダー層を、除外し、代わりに定義された成長媒体10の形態の栄養サポートを提供することです。 ここでは、「サンドイッチ」またはニューロン文化2、11の「バンカー」の方法について説明します。この方法は、次いで、パラフィンワックスビーズにより分離グリア細胞の単層上に懸架されたガラスカバースリップ上の海馬ニューロンをめっきすることを含みます。これは、基礎となるグリア単層からの栄養支持を可能にしながらグリアを汚染することなく、ニューロンの均一な集団の長期培養を容易にします。ニューロンは十分な年齢や成熟度レベルである場合には、ニューロンカバースリップは、グリア皿のアウト反転及びイメージング又は機能的アッセイに使用することができます。

<table><tbody><tr><td>解剖器具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖はさみ</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖スプリングハサミ</td><td>Roboz</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖スプリングハサミ</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td></td></tr><tr><td>デュモン鉗子</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>デュモン鉗子 (#PP)</td><td>Roboz</td><td>RS-4950</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Tissue Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (2.5%)</td><td>Gibco</td><td>15-090-046</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>Swinnex フィルターホルダー、25&nbsp;mm</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0002500</td><td>セルストレーナーとして使用されます。フィルターとオートクレーブで最初に組み立て</td></tr>る <tr><td>Isoflorane</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td></td><td></td>CP0406V2</tr><tr><td>血球計算盤</td><td>ハウサー科学</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>グレード 105 レンズ クリーニング ティッシュ</td><td>GE ヘルスケア</td><td>2105-841</td><td>セルストレーナーとして使用されます。フィルターホルダーとオートクレーブで最初に組み立て</td></tr>ます <tr><td>コットンフィルター付きガラスパスツールピペット</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドを含まないハンクスのバランス塩溶液 (HBSS、10x)</td><td>Gibco</td><td>14-185-052</td><td></td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>ウシ膵臓由来デオキシリボヌクレアーゼI(Dnase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Butane Bunsen burner</td><td>Wall-Lenk Mfg. Co.</td><td>モデル 65</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Tissue Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 (100 mm)</td><td>フィッシャー</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 (60 mm)</td><td>フィッシャー</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>ホース セラム</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>BGS の代わりに使用できますが、ロット間のばらつきがあるため、各ロットをテストする必要があります。血清の熱不活化をお勧めします。.</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Gibco</td><td>11-095-080</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21-103-049</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25-030-081</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>NBG培地</td></tr><tr><td>培養皿(60 mm)</td>でL-グルタミンの代わりに使用できますコー<td>ニング社</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>培養フラスコ(75 cm ^ 2)</td><td>グライナーバイオワン</td><td>658170</td><td></td></tr>シ<tr><td>タラビン(Ara-C)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>C3350000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>ウシ成長血清(BGS)</td><td>ハイクローン</td><td>SH3054103</td><td>使用前に熱不活性化をお勧めします。</td></tr><tr><td>B27サプリメント(50x)</td><td>Gibco</td><td>17-504-044</td><td></td></tr>ジ<tr><td>メチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ml</td><td></td></tr><tr><td>極低温バイアルVWR</td><td></td><td>89094-806</td><td></td></tr><tr><td>DL-2-アミノ-5-ホスフォノペンタノ酸(APV)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Coverslip Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>四ホウ酸ナトリウム十水和物(ホウ砂)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Histoplast Paraffin Wax</td><td>Fisher</td><td>22-900-700</td><td></td></tr><tr><td>プロトコルで議論された代替カバースリップ洗浄方法に使用される</td><td>重力対流式</td><td>オーブンVWR</td><td>89511-404</td></tr><tr><td>超音波浴(ソニケーター)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>15337400</td><td></td></tr><tr><td>硝酸</td><td>Anachemia</td><td>62786-460</td><td></td></tr><tr><td>セラミック染色ラックトーマス</td><td>サイエンティフィック8542E40</td><td></td><td>プロトコルで議論された代替カバースリップ洗浄方法に使用されます</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht&nbsp;GmbH</td><td>1001/18</td><td>ニューロンは低品質のガラスにうまく接着しないため、メーカーは非常に重要です&nbsp;</td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Miscellaneous</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌シリンジ</td><td>フィルターVWR</td><td>28145-477</td><td>BDシリンジと使用フィルター滅菌</td></tr><tr><td>シリンジ&nbsp;</td><td>BD</td><td>302832</td><td>VWR滅菌シリンジフィルターと併用</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-460-16Q</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 円錐形滅菌遠心分離チューブ</td><td>ThermoScientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 円錐形滅菌遠心分離チューブ</td><td>ThermoScientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

低密度初代海馬ニューロンの文化

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

文化の中で、個々の神経細胞の構造と生理をプローブする能力は、神経生物学の研究に不可欠である、そして個々のセルまたは定義されたネットワークの遺伝的および化学的操作の柔軟性が可能になります。無傷の脳組織と比較した場合、操作のような容易さは減少培養系で簡単です。これらの一次ニューロンの単離および増殖のための多くの方法が存在するが、それぞれが独自の制限を有します。このプロトコルは、次に、グリア細胞の単層上に懸架されたガラスカバースリップ上に低密度および高純度齧歯類胚の海馬ニューロンを培養するための方法を記載しています。根底にあるグリア単層からの栄養支持を可能にしながらこの「サンドイッチ文化は」ニューロンの人口の排他的な長期的成長が可能になります。ニューロンは十分な年齢や成熟度レベルである場合、ニューロンカバースリップは、グリア皿のアウト反転及びイメージング又は機能的アッセイに使用することができます。ニューロングラムこの方法によるrownは、典型的には、数週間のために生き残るためには、大規模なアーバー、シナプス結合、およびネットワークプロパティを開発しています。

初代神経細胞培養物のこの「サンドイッチ」法では、海馬ニューロン（ 図3）は、パラフィンビーズ（ 図2）により分離グリア細胞（ 図1）のベッドの上で成長します。これは、ニューロンが選択的に最小限のグリア細胞の汚染をカバーガラス上で増殖するが、組織培養皿上で成長しているグリア細胞から十分な栄養サポートを受けることを保証します。典型的には、ニューロンは&gt; 3週間の培養で維持し、それぞれ、それらの典型的なデホスホ-tauおよびMAP2免疫染色によって同定よく発達軸索および樹状突起との広範なarborisation、（ 図4）を開発することができます。成熟した神経細胞は、これらの区画に後シナプスマーカーDrebrin1の選択的局在化によって識別されるシナプス棘を開発します。これらのシナプス棘は密接にシナプス小胞マーカーシナプシン免疫染色により識別されシナプス前の専門分野に並置されています。ザ・シナプス前および後のサイトの近接はよく発達し、正し...

この記事では、グリア単層の上に反転したカバーガラス上で成長する低密度初代海馬神経細胞を培養するためのプロトコルを記述しています。ニューロンとグリアの層は、パラフィンワックスビーズで分離されています。この方法によって成長させた神経細胞は、高分解能光学イメージングおよび機能アッセイに適しています。

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

本プロトコルは、もともとDr. Gary Bunkerらによって発表されたものであり、神経細胞をグリア細胞のフィルター層の上に懸垂させることで、胚性海馬ニューロンの高密度かつ高純度な培養を可能にするものです。この手法は、汚染となるグリア細胞を極めて少なく抑えた状態でニューロンを低密度に成長させることができるため、当社の他の海馬培養の結果においても非常に有用です。したがって、本手法は培養中の成熟ニューロンの高解像度イメージングや機能解析に最適です。本プロトコルの熟練度の向上は、手順の中で記述することが困難な重要な局面がいくつか存在するため、それに沿って進めることで、新規の導入を迅速化させます。本プロトコルは、高品質な初代ニューロンを培養するために必要な3つの独立した工程で構成されています。これらの工程には、グリア細胞の培養、カバーガラスの作成およびコーティング、そして海馬神経細胞の調製が含まれます。まず、記述プロトコルに従って、出生直後のラット皮質組織を入手します。ここでは直接的に示しませんが、本プロトコルの後半に登場する解剖手順は、皮質の解剖に使用するものとほぼ同一であることに留意してください。そのため、この後のビデオで示す海馬の解剖手順の中で、関連するステップを強調して説明します。記載されたプロトコルのステップ6に従い、回収した皮質組織からHBSSを除去し、その後、ハサミを用いて組織を可能な限り細かく刻みます。刻んだ組織を50 milliliterのコニカルチューブに移送するのに十分な量のHBSSを加え、さらにHBSSを加えて全量を12 millilitersにします。2.5%trypsinと10 milligram per milliliter DNA溶液をそれぞれ1.5 milliliters加え、転倒混和した後、得られた混合物を37 degree Celsiusのウォーターバスで12分間インキュベートします。ガラス製パステールピペットを用いて組織を10〜15回トリチュレーションし、その後、ウォーターバスでさらに3分間インキュベートします。組織片がチューブの底に沈殿していることを確認し、上清を5 mLのBGSを含む50 mLコニカルチューブにろ過します。未消化の組織片が残っているチューブに、13.5 mLのHBSSおよび1.5 mLの2.5% trypsinを加え、転倒混和した後、ウォーターバスでさらに10分間インキュベートします。インキュベーション後、残った組織を10〜15回トリチュレーションし、最初のろ液が入ったチューブにろ過します。次に、さらに3 millilitersのBGSを通過させてフィルターを洗浄します。この時点で、ろ液を複数のチューブに分けることで、ペレット化した細胞のバランス調整と再懸濁の両方を簡便に行うことができます。懸濁液を130 Gで6分間遠心分離します。遠心分離後、血液成分が含まれているため、ペレットの底部がわずかに赤みを帯びていることに注意してください。上清を除去し、ペレットを乱さないように注意しながら、各チューブに1 milliliterのグリア培地を加えます。赤色の外見を呈していないペレットの部分を、新しい50 milliliterコニカルチューブに移します。組織の混合物を再懸濁させるため、仔マウス1匹あたり最大2 millilitersのグリア培地を加え、懸濁液2 millilitersを、あらかじめ加温した18 millilitersのグリア培地が入った75 centimeter squaredカルチャーフラスコに転送します。フラスコを37 degrees Celsius、5%CO2のインキュベーターで培養します。細胞を播種した翌日に、各フラスコの培地を新鮮なグリア培地へと交換します。この時点では、培養物はアストロサイトと他の非標的細胞型の混合物であることに注意してください。非アストロサイト細胞型を除去するには、播種から約4日後にフラスコを強力に撹拌する必要があります。そのためには、フラスコをHBSSで洗浄し、その後、各フラスコに10 millilitersの新鮮なHBSSを加え、それぞれを5〜10回激しく振ってください。HBSSを吸引して取り除き、さらに2回HBSSで洗浄します。次に、20 millilitersのグリア培地を加え、これまでと同様にフラスコをインキュベーターに戻します。この操作は激しいものとなりますが、培養に必要なアストロサイトはフラスコ表面に強く接着したままとなることに留意してください。アストロサイト培養を維持するため、細胞がコンフルエントになるまで、週に2回、新鮮なグリア培地に交換します。コンフルエントになった後、書面プロトコルに従って、細胞を将来の使用のために凍結保存することができます。グリア細胞は、書面プロトコルの記載通り、ニューロン培養の開始から少なくとも14日前にディッシュに播種しておく必要があります。カバースリップを濃硝酸に浸し、室温で30分間超音波洗浄します。濃硝酸は極めて腐食性が強いため、取り扱いに十分注意してください。なお、ラボによっては、セラミック製染色ラックを用いてカバースリップを硝酸に一晩浸漬する方法を好む場合もあります。機関のガイドラインに従い、化学薬品用ドラフトチャンバー内で硝酸を慎重に廃棄し、その後、カバーガラスを脱イオン水で3回すすぎます。カバーガラスを水に浸し、さらに30分間超音波洗浄します。次に、水を取り除き、カバーガラスをもう3回すすぎます。カバースリップを50ミリリットルの水に浸し、オートクレーブにかける。滅菌済みのラミナーフローフード内で水を取り除き、洗浄のために20～30ミリリットルのエタノールを加える。さらに20～30ミリリットルのエタノールを加え、カバースリップとエタノールを100ミリメートルのシャーレに移す。鈍端ピンセットを用いて、カラースリップを60 mLのペトリ皿に1枚につき4〜5枚ずつ移し、カバーガラスを皿の縁に立てかけることで風乾させます。エタノールが蒸発した後、カバーガラスを水平な状態に戻します。耐熱ガラス瓶の中で10 gのパラフィンを溶かし、約150〜200 °Cに維持します。最適な温度にするには微調整が必要な場合があり、温度が不適切だとパラフィン足の適切なサイズを作ることが困難になります。パストールピペットをパラフィンに浸し、各カバーガラスの端に近い3か所に素早く触れさせます。パラフィンの液滴が凝固して、高さ約3～5mm、直径1～2mmのビーズ状になり、これによりカバーガラス上のニューロンと、その下のグリア単層との間に空間を確保することができます。あらかじめパラフィン足付きのカバーガラスを準備したディッシュを用意します。各カバーガラスの表面に200 µLのポリ-L-リシンおよびホウ酸緩衝液を加え、室温で密封した状態で一晩静置します。コーティングする面は、パラフィンビーズが配置されている面である必要があります。適切に洗浄されていれば、ポリ-L-リシンはカバースリップの表面を覆うように容易に広がります。翌朝、カバースリップを滅菌水に2時間ずつ2回浸して洗浄します。最後の洗浄後、水を1ディッシュあたり4 mLの播種用培地に交換します。ポリ-L-リシンでコーティングした後、カバーガラスの表面を乾燥させないことが重要である点に注意してください。カバーガラスを入れたディッシュを37 °Cのインキュベーターに入れます。コーティングしたカバーガラスは、ニューロン培養を開始する前に、少なくとも24時間インキュベートする必要があります。妊娠18日目または19日目のラットを用意し、承認された方法で安楽死させます。ラットの腹側を70%ethanolでスプレーし、恥骨領域から腹腔の末端まで正中線に沿って切開します。汚染を避けるため、この段階では皮膚のみを切るよう注意してください。解剖器具を70%エタノールで滅菌し、腹壁を切開して子宮を露出させます。2つの子宮角を取り出し、滅菌ディッシュに入れます。滅菌済みの層流クリーンベンチ内で、胎児を囲んでいる子宮膜を取り除き、胎児の脱頭を行い、頭部を20 mLのHBSSを含む100 mmペトリ皿に入れます。脳を摘出し、直ちに氷上の2 mLのHBSSを含む60 mmのペトリ皿に移します。次のステップで十分なスペースを確保するため、1枚の皿につき2〜3個の脳のみを回収してください。解剖顕微鏡下で、大脳半球の中心線から髄膜を取り除きます。次に、海馬を摘出します。海馬は皮質半球の内側面に三日月状の構造として識別でき、外側が脳室に接しているため容易に摘出可能です。摘出した海馬は、4.5 millilitersのHBSSを入れた60 millimeterのペトリ皿に移し、氷上で保持します。ここまでの手順は皮質切断においても同様ですが、海馬ではなく皮質を保持する点が異なります。皮質切断の場合、次のステップはここに示されているように皮質を脳の残りの部分から分離し、前述のように皮質とHBSSを回収することになります。すべての海馬組織をHBSSに回収したら、それを15 mLコニカルチューブに移します。2.5%トリプシンを5 milliliters加え、37 °Cで10分間インキュベートします。チューブ底部の海馬組織を乱さないように注意しながら、パストゥールピペットでトリプシン溶液を静かに取り除きます。5 millilitersのHBSSを静かに加え、37 °Cで5分間インキュベートした後、再びパストゥールピペットで除去するという洗浄操作を2回行います。この際、底部の組織を乱さないようにしてください。前述のインキュベーションステップの待機時間中に、組織解離用のフレームポリッシュ（火炎研磨）したピペットを2種類のバリエーションで準備します。まず、ガラス製パストールピペットの先端を短時間火炎にさらし、先端の状態を確認します。1種類目のバリエーションについては、ピペット先端の縁が滑らかになるまでこの操作を繰り返しますが、直径は変化させないようにします。2回目については、エッジが滑らかになり、チップの直径が約半分に減少するまで繰り返します。この過程で細胞を損傷させることなく、組織を解離させて単一細胞を得るための最適な直径を見つけるには、練習することが重要です。2回目の洗浄後、組織に十分な量のHBSSを加え、全量を5 millilitersにします。まず、海馬組織を縁が滑らかな通常ピペットで約10回トリチュレーションし、その後、先端径を小さくしたピペットでさらに5〜10回トリチュレーションします。ここでの目的は、組織の塊が全くない、あるいは極めて少ない均一な細胞懸濁液を得ることです。ヘモサイトメーターを用いて細胞密度を測定します。一般的な収量は、1匹の子仔あたり約800,000から1,000,000個の細胞です。目的の実験に応じて、60 mmディッシュあたり100,000から500,000個の播種密度となるよう、4 mLの播種用培地が入ったpoly-l-lysineコートカバースリップ付きディッシュに、十分な量の細胞懸濁液を移します。ディッシュを37 °C、5% CO2インキュベーターに入れます。3〜4時間後、ニューロンが付着したカバーグラスを、グリア細胞とNBG培地を含むディッシュに転移させます。この際、ニューロンを播種した面がグリア細胞層に接するように配置してください。1つのグリアディッシュにつき、合計4〜5枚のカバーグラスを加えてください。播種から2〜3日後、グリア細胞の増殖を停止させるため、1ディッシュあたり最終濃度5 µMとなるようにaerocele溶液を添加します。週に1回、古い培地2 mLを新鮮な培地2.5 mLに交換して細胞に栄養を与えます。培地を多めに添加するのは、経時的な蒸発を補うためです。また、グリア細胞による培地のコンディショニングを一定に保つため、培地の一部のみを交換します。これらの培養細胞は、通常少なくとも1か月間は良好な状態を維持します。ニューロンを4%paraformaldehydeで固定し、その後、蛍光イメージングのために一次抗体でインキュベートしました。TauおよびMAP2の免疫染色で示されるように、これらのニューロンは高度に発達した軸索と樹状突起を伴う広範な分枝を発達させます。成熟したニューロンは、Drebrin Oneの選択的な局在によって特定されるシナプススパインを形成し、これらはシナプス免疫染色で特定されるシナプス前特異化構造と密接に対面しています。これらの初代ニューロンは、信号伝達、ニューロンの極性、細胞内輸送、ならびにシナプスの形成と可塑性の研究など、ニューロンおよびシナプスの機能的・構造的研究に適しています。このビデオは、本プロトコルのいくつかの重要なステップを理解し、正確に実行するための助けとなります。記載された方法を適切に遵守することで、広範な樹状分枝を持ち、形態的および機能的に十分に発達したシナプスを有する、健康的で高密度のニューロン培養が得られるはずです。

low-density-primary-hippocampal-neuron-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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超低密度のために簡略化された方法、長期初代海馬ニューロンの文化

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学ぶ低密度初代海馬ニューロンの培養法。神経膠細胞層上にニューロンを浮遊させて高純度培養を実現し、高解像度イメージングと機能アッセイに最適な方法を解説します。

低密度初代海馬ニューロンの文化

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