低密度初代海馬ニューロンの文化

本プロトコルは、もともとDr. Gary Bunkerらによって発表されたものであり、神経細胞をグリア細胞のフィルター層の上に懸垂させることで、胚性海馬ニューロンの高密度かつ高純度な培養を可能にするものです。この手法は、汚染となるグリア細胞を極めて少なく抑えた状態でニューロンを低密度に成長させることができるため、当社の他の海馬培養の結果においても非常に有用です。したがって、本手法は培養中の成熟ニューロンの高解像度イメージングや機能解析に最適です。

本プロトコルの熟練度の向上は、手順の中で記述することが困難な重要な局面がいくつか存在するため、それに沿って進めることで、新規の導入を迅速化させます。本プロトコルは、高品質な初代ニューロンを培養するために必要な3つの独立した工程で構成されています。これらの工程には、グリア細胞の培養、カバーガラスの作成およびコーティング、そして海馬神経細胞の調製が含まれます。

まず、記述プロトコルに従って、出生直後のラット皮質組織を入手します。ここでは直接的に示しませんが、本プロトコルの後半に登場する解剖手順は、皮質の解剖に使用するものとほぼ同一であることに留意してください。そのため、この後のビデオで示す海馬の解剖手順の中で、関連するステップを強調して説明します。

記載されたプロトコルのステップ6に従い、回収した皮質組織からHBSSを除去し、その後、ハサミを用いて組織を可能な限り細かく刻みます。刻んだ組織を50 milliliterのコニカルチューブに移送するのに十分な量のHBSSを加え、さらにHBSSを加えて全量を12 millilitersにします。2.5%trypsinと10 milligram per milliliter DNA溶液をそれぞれ1.5 milliliters加え、転倒混和した後、得られた混合物を37 degree Celsiusのウォーターバスで12分間インキュベートします。

ガラス製パステールピペットを用いて組織を10〜15回トリチュレーションし、その後、ウォーターバスでさらに3分間インキュベートします。組織片がチューブの底に沈殿していることを確認し、上清を5 mLのBGSを含む50 mLコニカルチューブにろ過します。未消化の組織片が残っているチューブに、13.5 mLのHBSSおよび1.5 mLの2.5% trypsinを加え、転倒混和した後、ウォーターバスでさらに10分間インキュベートします。

インキュベーション後、残った組織を10〜15回トリチュレーションし、最初のろ液が入ったチューブにろ過します。次に、さらに3 millilitersのBGSを通過させてフィルターを洗浄します。この時点で、ろ液を複数のチューブに分けることで、ペレット化した細胞のバランス調整と再懸濁の両方を簡便に行うことができます。

懸濁液を130 Gで6分間遠心分離します。遠心分離後、血液成分が含まれているため、ペレットの底部がわずかに赤みを帯びていることに注意してください。上清を除去し、ペレットを乱さないように注意しながら、各チューブに1 milliliterのグリア培地を加えます。赤色の外見を呈していないペレットの部分を、新しい50 milliliterコニカルチューブに移します。

組織の混合物を再懸濁させるため、仔マウス1匹あたり最大2 millilitersのグリア培地を加え、懸濁液2 millilitersを、あらかじめ加温した18 millilitersのグリア培地が入った75 centimeter squaredカルチャーフラスコに転送します。フラスコを37 degrees Celsius、5%CO2のインキュベーターで培養します。細胞を播種した翌日に、各フラスコの培地を新鮮なグリア培地へと交換します。

この時点では、培養物はアストロサイトと他の非標的細胞型の混合物であることに注意してください。非アストロサイト細胞型を除去するには、播種から約4日後にフラスコを強力に撹拌する必要があります。そのためには、フラスコをHBSSで洗浄し、その後、各フラスコに10 millilitersの新鮮なHBSSを加え、それぞれを5〜10回激しく振ってください。

HBSSを吸引して取り除き、さらに2回HBSSで洗浄します。次に、20 millilitersのグリア培地を加え、これまでと同様にフラスコをインキュベーターに戻します。この操作は激しいものとなりますが、培養に必要なアストロサイトはフラスコ表面に強く接着したままとなることに留意してください。

アストロサイト培養を維持するため、細胞がコンフルエントになるまで、週に2回、新鮮なグリア培地に交換します。コンフルエントになった後、書面プロトコルに従って、細胞を将来の使用のために凍結保存することができます。グリア細胞は、書面プロトコルの記載通り、ニューロン培養の開始から少なくとも14日前にディッシュに播種しておく必要があります。

カバースリップを濃硝酸に浸し、室温で30分間超音波洗浄します。濃硝酸は極めて腐食性が強いため、取り扱いに十分注意してください。なお、ラボによっては、セラミック製染色ラックを用いてカバースリップを硝酸に一晩浸漬する方法を好む場合もあります。

機関のガイドラインに従い、化学薬品用ドラフトチャンバー内で硝酸を慎重に廃棄し、その後、カバーガラスを脱イオン水で3回すすぎます。カバーガラスを水に浸し、さらに30分間超音波洗浄します。次に、水を取り除き、カバーガラスをもう3回すすぎます。

カバースリップを50ミリリットルの水に浸し、オートクレーブにかける。滅菌済みのラミナーフローフード内で水を取り除き、洗浄のために20～30ミリリットルのエタノールを加える。さらに20～30ミリリットルのエタノールを加え、カバースリップとエタノールを100ミリメートルのシャーレに移す。

鈍端ピンセットを用いて、カラースリップを60 mLのペトリ皿に1枚につき4〜5枚ずつ移し、カバーガラスを皿の縁に立てかけることで風乾させます。エタノールが蒸発した後、カバーガラスを水平な状態に戻します。耐熱ガラス瓶の中で10 gのパラフィンを溶かし、約150〜200 °Cに維持します。

最適な温度にするには微調整が必要な場合があり、温度が不適切だとパラフィン足の適切なサイズを作ることが困難になります。パストールピペットをパラフィンに浸し、各カバーガラスの端に近い3か所に素早く触れさせます。パラフィンの液滴が凝固して、高さ約3～5mm、直径1～2mmのビーズ状になり、これによりカバーガラス上のニューロンと、その下のグリア単層との間に空間を確保することができます。

あらかじめパラフィン足付きのカバーガラスを準備したディッシュを用意します。各カバーガラスの表面に200 µLのポリ-L-リシンおよびホウ酸緩衝液を加え、室温で密封した状態で一晩静置します。コーティングする面は、パラフィンビーズが配置されている面である必要があります。

適切に洗浄されていれば、ポリ-L-リシンはカバースリップの表面を覆うように容易に広がります。翌朝、カバースリップを滅菌水に2時間ずつ2回浸して洗浄します。最後の洗浄後、水を1ディッシュあたり4 mLの播種用培地に交換します。

ポリ-L-リシンでコーティングした後、カバーガラスの表面を乾燥させないことが重要である点に注意してください。カバーガラスを入れたディッシュを37 °Cのインキュベーターに入れます。コーティングしたカバーガラスは、ニューロン培養を開始する前に、少なくとも24時間インキュベートする必要があります。

妊娠18日目または19日目のラットを用意し、承認された方法で安楽死させます。ラットの腹側を70%ethanolでスプレーし、恥骨領域から腹腔の末端まで正中線に沿って切開します。汚染を避けるため、この段階では皮膚のみを切るよう注意してください。

解剖器具を70%エタノールで滅菌し、腹壁を切開して子宮を露出させます。2つの子宮角を取り出し、滅菌ディッシュに入れます。滅菌済みの層流クリーンベンチ内で、胎児を囲んでいる子宮膜を取り除き、胎児の脱頭を行い、頭部を20 mLのHBSSを含む100 mmペトリ皿に入れます。

脳を摘出し、直ちに氷上の2 mLのHBSSを含む60 mmのペトリ皿に移します。次のステップで十分なスペースを確保するため、1枚の皿につき2〜3個の脳のみを回収してください。解剖顕微鏡下で、大脳半球の中心線から髄膜を取り除きます。

次に、海馬を摘出します。海馬は皮質半球の内側面に三日月状の構造として識別でき、外側が脳室に接しているため容易に摘出可能です。摘出した海馬は、4.5 millilitersのHBSSを入れた60 millimeterのペトリ皿に移し、氷上で保持します。

ここまでの手順は皮質切断においても同様ですが、海馬ではなく皮質を保持する点が異なります。皮質切断の場合、次のステップはここに示されているように皮質を脳の残りの部分から分離し、前述のように皮質とHBSSを回収することになります。すべての海馬組織をHBSSに回収したら、それを15 mLコニカルチューブに移します。

2.5%トリプシンを5 milliliters加え、37 °Cで10分間インキュベートします。チューブ底部の海馬組織を乱さないように注意しながら、パストゥールピペットでトリプシン溶液を静かに取り除きます。5 millilitersのHBSSを静かに加え、37 °Cで5分間インキュベートした後、再びパストゥールピペットで除去するという洗浄操作を2回行います。この際、底部の組織を乱さないようにしてください。

前述のインキュベーションステップの待機時間中に、組織解離用のフレームポリッシュ（火炎研磨）したピペットを2種類のバリエーションで準備します。まず、ガラス製パストールピペットの先端を短時間火炎にさらし、先端の状態を確認します。1種類目のバリエーションについては、ピペット先端の縁が滑らかになるまでこの操作を繰り返しますが、直径は変化させないようにします。

2回目については、エッジが滑らかになり、チップの直径が約半分に減少するまで繰り返します。この過程で細胞を損傷させることなく、組織を解離させて単一細胞を得るための最適な直径を見つけるには、練習することが重要です。2回目の洗浄後、組織に十分な量のHBSSを加え、全量を5 millilitersにします。

まず、海馬組織を縁が滑らかな通常ピペットで約10回トリチュレーションし、その後、先端径を小さくしたピペットでさらに5〜10回トリチュレーションします。ここでの目的は、組織の塊が全くない、あるいは極めて少ない均一な細胞懸濁液を得ることです。ヘモサイトメーターを用いて細胞密度を測定します。

一般的な収量は、1匹の子仔あたり約800,000から1,000,000個の細胞です。目的の実験に応じて、60 mmディッシュあたり100,000から500,000個の播種密度となるよう、4 mLの播種用培地が入ったpoly-l-lysineコートカバースリップ付きディッシュに、十分な量の細胞懸濁液を移します。ディッシュを37 °C、5% CO2インキュベーターに入れます。

3〜4時間後、ニューロンが付着したカバーグラスを、グリア細胞とNBG培地を含むディッシュに転移させます。この際、ニューロンを播種した面がグリア細胞層に接するように配置してください。1つのグリアディッシュにつき、合計4〜5枚のカバーグラスを加えてください。

播種から2〜3日後、グリア細胞の増殖を停止させるため、1ディッシュあたり最終濃度5 µMとなるようにaerocele溶液を添加します。週に1回、古い培地2 mLを新鮮な培地2.5 mLに交換して細胞に栄養を与えます。培地を多めに添加するのは、経時的な蒸発を補うためです。

また、グリア細胞による培地のコンディショニングを一定に保つため、培地の一部のみを交換します。これらの培養細胞は、通常少なくとも1か月間は良好な状態を維持します。ニューロンを4%paraformaldehydeで固定し、その後、蛍光イメージングのために一次抗体でインキュベートしました。

TauおよびMAP2の免疫染色で示されるように、これらのニューロンは高度に発達した軸索と樹状突起を伴う広範な分枝を発達させます。成熟したニューロンは、Drebrin Oneの選択的な局在によって特定されるシナプススパインを形成し、これらはシナプス免疫染色で特定されるシナプス前特異化構造と密接に対面しています。これらの初代ニューロンは、信号伝達、ニューロンの極性、細胞内輸送、ならびにシナプスの形成と可塑性の研究など、ニューロンおよびシナプスの機能的・構造的研究に適しています。

このビデオは、本プロトコルのいくつかの重要なステップを理解し、正確に実行するための助けとなります。記載された方法を適切に遵守することで、広範な樹状分枝を持ち、形態的および機能的に十分に発達したシナプスを有する、健康的で高密度のニューロン培養が得られるはずです。