Name: 本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: 学ぶ、本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化部位を核磁気共鳴分光法で同定する手法。Tauタンパク質を用いて、リン酸化がタンパク質相互作用に与える影響を解明し、神経変性疾患の治療戦略開発に貢献する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NMR施設は、Région Nord、CNRS、リールパスツール研究所、欧州共同体(FEDER)、フランス研究省、リール科学技術大学から資金提供を受けました。TGE RMN THC(FR-3050、フランス)、FRABio(FR 3688、フランス)、リールNMRおよびRPEヘルス&バイオロジーの中核施設からの支援に感謝します。私たちの研究は、LabEx(Laboratory of Excellence)、DISTALZ(アルツハイマー病への学際的アプローチのための革新的な戦略の開発)、EU、ITN、TASPPI、ANR BinAlzからの助成金によってサポートされています。

15 N、13 C-タウ（図1）の1.生産<ol><li> BL21にをpET15b-タウ組換えT7発現プラスミド13,14を変換（DE3）コンピテント大腸菌細菌細胞15。 注：最長（441アミノ酸残基）タウアイソフォームをコードするcDNAは、たpET15bプラスミド中にNcoIおよびXhoI制限部位の間にクローニングされています。 <ol><li>有能BL21 1.5ミリリットルのプラスチックチューブに100ngのプラスミドDNAとプラスミドDNAのμgのあたり1-5×10 7個のコロニーを形成する（DE3）細胞の穏やか50μlのを混ぜます。 注：真核生物のcDNA発現のためのコドン使用最適化された細菌株は、ヒトのタウを生成するために必須ではありません。 </li><li> 30分間氷上で細胞混合物を配置し、42℃で10秒間ヒートショック。バック氷上で5分間チューブを置き、室温LB（Luria-Bertani）培地の1ミリリットルを追加します。穏やかな下37℃で30分間細菌懸濁液をインキュベート攪拌。 </li></ol></li><li>アンピシリン抗生物質の100μg/ mlを含むLB培地の寒天プレート上に白金耳に均等に100μlの細胞懸濁液を用いて拡散。 </li><li> 37℃で15時間、選択プレートをインキュベートします。 </li><li>約2週間の最大のために、培養工程に進むまで4℃で選択プレートを保管してください。 注：細菌培養液（50％グリセロール）のグリセロールストックを、-80℃で保存されたが、後の段階で培養を開始するために調製することができます。 </li><li>オートクレーブ処理M9塩の1 L（6グラムの Na 2にHPO 4、3グラムのKH 2 PO 4をミリリットルの100mMのCaCl 2、10ミリリットル100倍のMEMビタミン補数1ミリリットルの1MのMgSO 4、1、1ミリリットルを100mg / mlのアンピシリンを追加します。 、0.5グラムのNaCl）。 注：白色の沈殿物はすぐに消散M9塩へのCaCl 2溶液の添加時に形成することになります。 </li><li> 15 Nの300mgを、13 C-完全培地、15 1gを溶解NH 4 ClおよびM9培地10mlで13 C 6 -グルコースの2グラム。フィルター滅菌直接M9培地に、0.2μmのフィルターを用いた同位体ソリューションを。 </li><li> 100μg/ mlのアンピシリンを添加したLB培地20mlに選択プレートから細菌を形質転換したpET15b-タウの接種ループ1コロニーを使用して一時停止します。 </li><li>約6時間、37℃で接種した培地をインキュベートします。 </li><li>プラスチック製の分光計のキュベット中の細菌培養物の10倍希釈の1ミリリットルで600 nmで（OD 600）での光学密度を測定します。 注：3.0から4.0の600を ODに対応する細菌培養物の濁度は、飽和増殖期に到達したことを示しています。 </li><li> 2 Lの三角プラスチックバッフル付き培養フラスコに、アンピシリン（100μg/ mlの最終濃度）を補充したM9成長培地の1Lに飽和LB培地20 mLを加え。 </li><li> 10°に設定し、プログラム可能なインキュベーターで培養フラスコを配置Cと50 rpmで。次の日の朝早く200rpmで、37℃に切り替えるにはインキュベーターをプログラムします。 </li><li>プラスチック製の分光計キュベット中の細菌培養物1ml 1のOD 600を測定します。 OD 600は、組換えタウタンパク質の発現を誘導するために、約1.0の値に達すると（-20℃に保たれ）1 M IPTG（イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド）ストック溶液の400μlのを追加します。 </li><li>さらに3時間37℃でインキュベーションを続けます。 20分間、5000×gでの遠心分離によって菌体を回収。 </li><li> -20℃で細菌ペレットを凍結します。必要に応じて長時間、精製工程まで凍結保管してください。 </li></ol> 15 Nの2精製、13 C-タウ（図2） <ol><li> 20分間、15 psiの下、121℃でオートクレーブ陽イオン交換（CEX）精製バッファー。 4°Cで保存するバッファ。 </li><li>細菌細胞ペレットを解凍し、45ミリリットルで徹底的に再懸濁抽出CEX新たにプロテアーゼ阻害剤カクテル1×（1錠）及びDNアーゼI（2,000単位）を補充した緩衝液（50mMのNaPi緩衝液pH 6.5、1 mMのEDTA）の。 </li><li> 20,000psiで高圧ホモジナイザーを使用して、細菌細胞を破壊します。 3-4パスが必要です。不溶性物質を除去するために40分間20,000×gで遠心分離します。 </li><li>水浴を用いて75℃で15分間、細菌細胞抽出物を加熱します。 注：白色沈殿物が数分後に観察されます。 </li><li> 20分間、15,000×gで遠心分離し、熱安定性タウ蛋白質を含有する上清を保ちます。 </li><li>次の精製工程まで-20°Cで保存し、必要に応じて。 </li><li>高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）システム（ 図3A）を用いて、5 mlの床カラムとしてパック強いCEX樹脂の陽イオン交換クロマトグラフィーを行います。 <ol><li> 2.5ミリリットル/分に設定流量。 </li><li>バッファCEXカラムを平衡化</li><li> 60〜70ミリリットルhea​​ted-をロードタウは、試料ポンプを使用して含有する抽出物、あるいはシステムに応じて、ポンプ。フロースルータウタンパク質を効率的に（2.8を参照）を樹脂に結合されていることを確認するための分析のために収集します。 </li><li> 280nmでの吸光度がベースラインに戻る値になるまで、CEX A緩衝液で樹脂を洗浄します。 </li><li> CEX Bバッファー（1 M NaClでCEX緩衝液）の緩やかな増加により得られた三段階NaCl勾配を用いてカラムから溶出タウ。プログラムFPLC次のように250mMの塩化ナトリウム、500mMのNaClに到達する5 CV 50％CEX Bのバッファに第二工程、第三工程に到達する10カラム容量（CV）で25％CEX Bバッファに傾斜する第一の工程と2 CVで100％CEX B緩衝液は、1MのNaClに到達します。溶出工程の間に1.5ミリリットルの画分を収集します。 </li></ol></li><li> SDS-PAGE（12％SDSアクリルアミドゲル）により溶出工程とクマシー染色（ 図3 A）16の間に収集された画分の10μLを分析します。 ANALYによってだけでなく、カラムに負荷ステップをチェックフロースルーを10μlシュッ。 </li><li>タウを含む画分を選択し、次のステップのためにこれらの画分をプール。 </li><li>タウ含有プールされた画分（ 図3 B）に緩衝液交換を行います。 <ol><li> FPLCシステムを用いて、50mMの重炭酸アンモニウム（揮発性緩衝液）中で53ミリリットルG25樹脂充填床（26×10センチ）の脱塩カラムを平衡化します。 </li><li> 5ミリリットル/分に設定流量。 5ミリリットル注入ループを介してカラム上のタウのサンプルを注入します。 280nmの吸収ピークに対応する画分を収集します。 </li><li>初期CEXプールのボリュームに応じて、注射を3-4回繰り返します。 </li></ol></li><li> （タウ1mgの140 MAU * mlに相当する）、280nmでのクロマトグラムのピーク面積を用いて精製したタウタンパク質の量を計算します。 注：280 nmにおけるタウタンパク質の吸光係数は、7550 M -1 -1です。タウは、任意のTrp残基が含まれていません。 </li><li>プールは、すべてのタウ画分。 </li><li> Aliquoタウの1〜5ミリグラムと同等のものを含むチューブにサンプルトン。溶液の体積は、チューブ（50mlチューブ中の溶液を、例えば、5ml）中の容積に比べて小さいように、これらのチューブを選択します。 </li><li>針を用いて、チューブキャップに穴をパンチ。 -80℃で凍結タウサンプル。 </li><li>凍結乾燥タウサンプル。凍結乾燥されたタウタンパク質は、長期間-20℃で保存することができます。 </li></ol> 15 N-タウのin vitroリン酸化3. <ol><li> 500μlのリン酸化緩衝液（50mMのHepes・KOH、pHは8.0、12.5ミリモルのMgCl 2、1mMのEDTA、50mMのNaCl）中で凍結乾燥されたタウ5mgを溶解させます。 </li><li> 0.5 M株式の2.5 mMのATP（100mMのストック溶液25μlを-20℃で保存）、1mMのDTT（1 Mストック溶液1μlは、-20℃で保存）、1mMのEGTAを追加（2μlの溶液）、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル（1 mlのリン酸化緩衝液中に1錠を溶解した40倍ストックの25μL）および181; Mは、総サンプル体積中（保全バッファーて10mMのHepes、pHが7.3、-80℃で保存1mMのDTT、5mMのMgCl 2、100mMのNaCl、10％グリセロール、250μlの）彼の-ERK2を活性化します1ミリリットル。 注：活性化された彼の-ERK2はMEKキナーゼでリン酸化することにより、社内で5,8調製することができます。 </li><li> 37℃で3時間インキュベートします。 </li><li> ERKキナーゼを不活性化するために15分間75℃で試料を加熱します。 </li><li> 15分20,000×gで遠心分離します。収集し、上清を保持します。 </li><li> 1ミリリットルのサンプルに適して3.45ミリリットルG25樹脂充填床（1.3×2.6センチメートル）のカラムを用いて50mMの重炭酸アンモニウムへのタンパク質試料を脱塩します。 </li><li>その完全性と効率的なリン酸化（ 図4）の両方をチェックするためにタンパク質試料の2.5μlの12％SDS-PAGE 16を実行します 。 </li><li>リン酸化タウのサンプルを凍結乾燥。 -20℃で粉末を保管してください。 </li></ol> NMRスペクトルの4買収（FIグレ5） <ol><li>凍結乾燥された15 Nの4 mgを、400μlのNMRバッファ内の13 C ERKリン酸化タウ（50 mMののNaPiまたはトリス- D11 .Cl重水素化の50mM、pH6.5の、30mMの塩化ナトリウム、2.5mMのEDTAおよび1mM DTT）を可溶化します。 </li><li>内部のNMR信号基準としてNMR分光計のフィールドのロックおよび1mM TMSP（3-（トリメチルシリル）プロピオン-2,2,3,3- D 4酸ナトリウム塩））、5％のD 2 Oを追加します。完全プロテアーゼ阻害剤カクテルの40倍ストック溶液10μlを加えます。 </li><li>長い針またはパスツールピペットで電子注射器を用いて、5mmのNMRチューブにサンプルを転送します。プランジャーを使用して、NMR管を閉じます。プランジャーの動きによってプランジャと液体の間に閉じ込められた任意の気泡を除去します。 </li><li>スピナーでNMR管を配置します。試料溶液のほとんどは、NMRコイルの内側となるように、使用されるNMRプローブヘッドのための適切なゲージでスピナーでその垂直位置を調整します。 </li><li>空気の流れを開始します。 リフト私をクリック磁石制御システムウィンドウをNです。慎重に磁石ボアの上部の気流にチューブをスピナーを置きます。空気の流れを停止します（ リフトをクリックして）、チューブを磁石にプローブヘッド内部の所定の位置に降りてみましょう。 </li><li> 25°C（298 K）に設定された温度。 </li><li>動力伝達を最適化するために、プローブヘッドの半自動チューニング及びマッチングを行います。コマンドラインでatmm入力します。 </li><li>重水素チャンネルで録音したサンプルのD 2 O信号を用いた分光周波数をロックします。磁石制御システムウィンドウでロックをクリックします。 </li><li>試料の位置における磁場の均一性を最適化するために、シミング手順を開始します。シム・ウィンドウを開くには、コマンドラインでtopshim GUIを入力します。シム・ウィンドウで開始 ]をクリックします。シムは（2未満Hzのが良いです）最適であることを確認するために、残留B0標準偏差値を確認してください。 </li><li>プロトンのP1パラメータ（長さのキャリブレーションプロトンスピンの90°の回転を得るために必要であるマイクロ秒での高周波パルス）。水プロトンの1Dスペクトル（ 図6）を用いて、360°パルスを目指します。 </li><li> （ 図6）1Dスペクトルにおけるプロトン水周波数（Hz単位）O1パラメータを設定することにより、周波数オフセットを調整します。 </li><li>サンプル（ 図7）からの信号を確認するために（例えばzggpw5のために、水信号抑圧のためのウォーターゲートの配列を有するパルス・シーケンス）1Dプロトンスペクトルの取得を開始します。相対的なタンパク質濃度にスキャン数を適応させます。取得を開始するには、コマンドラインでZG入力します。 </li><li> （パルスシーケンスhsqcetfpf3gpsi、8-9図 ）2D [1 H、15 N] HSQCスペクトルを取得するための追加パラメータを設定します。 <ol><li> 15 Nについては、13 C、15 N、間接的進化の間に13 Cを切り離す、サンプルを標識しました。 </li><li&gt; 1 H（F2）および15 N（F1）次元での点の数とスペクトル幅（ppm）を設定します。 注：ポイントごとヘルツ同様の数を維持し、デカップリング時間を制限するために、分光器のフィールドに取得データポイントの数を適応：1 H次元で、600 MHzで900 MHzおよび2048ポイントで3072ポイントを使用しています。 </li><li>追加の遅延に対応するパルスシーケンスのパラメータ、パルス長、オフセット周波数、電力レベルを最適化します。タイプは、実験に関連するすべてのパラメータを表示するには、コマンドラインでASED。 </li></ol></li><li> 600 MHzで3D [1 H、15 N、13 C] HNCACBスペクトル（パルスシーケンスhncacbgpwg3d、 図10A）の取得のためのパラメータを設定。 </li><li> 600 MHzで3D [1 H、15 N、15 N] HNCANNH実験（パルスシーケンスhncannhgpwg3d）のためのパラメータを設定。 1 Hに2048ポイントの数を設定して、64そして2 15 N次元で128点。 、25は、百万分率（ppm）25部は4.7、119、1 Hで119 ppmで、15 Nおよび15 N寸法を中心に14としてスペクトル幅を定義します。 16スキャンで取得期間は1日と22時間です。 </li></ol>リン酸化部位の同定5. <ol><li>収集処理NMRソフトウェアを使用して処理スペクトル。 <ol><li>データ（ 図7）のフーリエ変換を実行します。 1Dスペクトルの型フィート 、2DスペクトルのためのXFBまたはコマンドラインで、3Dスペクトルをft3d。 </li><li>対話型のウィンドウを使用して位相およびリファレンスすべてのスペクトル（ 図7C）。 </li></ol></li><li> 2D HSQCが潜在的リン酸化のSerおよびThr残基（ 図9、赤いボックス）に対応するの関心の共振を特定します。 </li><li>抽出面からの（ すなわち 、2D 1 H- 13 Cスペクトル）2Dにおける関心の共鳴の15 N化学シフトを用いた3次元1 H- 15 N- 13 Cスペクトル。可視化する面（W1-W3）に対応した15 Nの周波数（ 図10B）を選択する次元2（W2）のカーソルを使用してください。 </li><li> 「CA」の共振周波数を選択し、それぞれの[1 H、15 N]共鳴のための「私」と「I-1」残基（I残基のものに比べて信号の弱い組）の「CB」13 C核ポインタモードメニューで、共振をクリックしてHNCACB 3Dスペクトルの関心のピークリストファイルに化学シフト値を追加するには、ピークを追加/見つけます。 <ol><li> pSerおよびPTHR 17のCAとCB化学シフトの既知の値にピークリスト内の化学シフトを比較することによって、私の残基の種類、のpSerまたはPTHRを識別します。 </li><li>特徴的な追加の2 ppmのシフトOによってI + 1位のPro残基の存在を特定しますCAの化学シフト値18 F。 </li><li>化学シフトの表に、I-1残基に対応するCAとCB共鳴の化学シフト値を比較し、I-1位の残基の性質を識別するために、タウのアミノ酸残基19を予測しました 。 </li></ol></li><li> &#39;i&#39;はHNCANNHスペクトルの関心の各[1 H、15 N]共鳴のためにと「I-1」残基の15 N核の共鳴周波数を選択してください。 </li><li> 23 -タウタンパク質20の化学シフトの割り当てに15 N化学シフト値を比較します。 </li><li>配列特異的な割り当てを定義するにはタウ・シーケンスで識別ジペプチドを比較してください。 </li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

私たちは、酵素的に修飾タウサンプルを特徴づけるためにNMR分光法を使用しています。全長ヒトタウタンパク質のためにここに記載の組換え発現および精製は、同様に変異タウまたはタウドメインを生成することができます。同位体濃縮されたタンパク質は、組換え発現を必要とする、NMR分光法のために必要とされます。リン酸化部位の同定は、共鳴の割り当てと15 N、13 C二重標識したタンパク質を必要とします。同位体のコストを考えると、良好な収率は、組換え発現工程で必要とされます。グルコースは、したがって、13 C 6 -グルコースの量は、収率を改善するために、増殖培地のリットルにつき4 gまで増加させることができるM9培地における細菌の増殖を制限する要因です。完全培地およびMEMビタミンの添加は必須ではないですが、成長を刺激し、歩留まりを改善するのに役立ちます。完全なラベルされた媒体の高コストを考えると、この製品は、唯一の成長培地として使用されているsupplemenトン。細菌の増殖は、M9培地に遅いです。一般的に、M9培地を用いて細菌培養物は、インキュベーションの約4時...

21世紀の医療の主な課題の1つは、アルツハイマー病（AD）などの神経変性疾患です。タウは、微小管（MT）の形成を刺激する微小管結合タンパク質です。タウは、最もよく知られている、いわゆるタウオパチーは、ADである、いくつかの神経変性疾患においても同様に関与しています。これらの疾患では、タウ対らせん状フィラメント（たPHF）で自己集合体とは、リン酸化の1のような翻訳後修飾（PTMを）により、多くの残基に変更された発見されました。タウタンパク質のリン酸化は、MTの安定化とADの神経細胞を特徴付ける関数の病理学的喪失のその生理学的機能の両方の調節に関与しています。 また、病気のニューロンでのPHFに統合タウタンパク質は、必ず2を過剰リン酸化されています。 2-3リン酸基を含んでいる通常のタウとは異なり、のPHF中の過リン酸化タウは、5から9 phosphatが含まれていますe基3。タウの過剰リンは、いくつかのサイトでの化学量論の増加におよびリン酸化の病理学的部位と呼ばれる追加の部位のリン酸化の両方に対応しています。しかし、オーバーラップはレベル4で量的な違いにもかかわらず、ADおよびリン酸化の正常な成人のパターンとの間に存在します。タウのどの特定のリン酸化事象の影響関数と機能障害はほとんど不明のまま。私たちは、分子レベルでのPTMによってタウ規制を解読することを目指しています。 タウの分子的側面の理解を深めるために、我々は技術的な課題に対処する必要があります。まず、タウは、溶液中で単離された本質的に無秩序なタンパク質（IDP）です。そのようなタンパク質は、生理学的条件下で十分に定義された三次元構造を欠き、その機能（複数可）および構造的特性を研究するために、特定の生物物理学的方法を必要とします。タウは、多くの場合、関連付けられた発見、国内避難民の成長クラスのパラダイムであります神経変性疾患のような病理は、したがって、それらの機能の基礎となる分子パラメータを理解するために関心が高まっ。第二に、タウのリン酸化の特徴付けは最長441アミノ酸のタウアイソフォームの配列に沿って80の潜在的なリン酸化部位で、分析的な課題です。抗体の数は、タウのリン酸化されたエピトープに対して開発されており、ニューロンまたは脳組織中の病理学的タウの検出のために使用されます。リン酸化事象は、プロリンに富む領域内に近接して、プロリン指向性キナーゼによって標的と少なくとも20のサイトにそれらのほとんどを行うことができます。定性（どのサイト？）および定量的（どの化学量論？）キャラクタリゼーションは、最も最近のMS技術5により困難です。 NMR分光法は、配座のアンサンブルから構成される非常に動的なシステムである無秩序なタンパク質を研究するために使用することができます。高分解能NMR分光法は、アプリましたタウタンパク質の構造と機能の両方を調査するために編。 8 -また、タウのリン酸化プロファイルの複雑性は、リン酸化部位6を識別するためのNMRを使用して分子ツール、新しい分析法の開発につながりました。分析方法としてNMRは、リン酸取り込みの程度の全体的な方法で、タウのリン酸化部位の同定、単一の実験内のすべての単一サイトの変更の可視化、定量化を可能にします。タウ上のリン酸化研究は文献にあふれているが、それらのほとんどは、リン酸化の完全なプロファイルの不確実性の大きな程度のため、個々のリン酸化事象の真のインパクトを残して、抗体を用いて行われてきたので、この点は必須です。 PKA、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β（GSK3β）、サイクリン依存性キナーゼ2 /サイクリンA（CDK2 / CycA）、サイクリン依存性キナーゼ5（CDK5）/ P25の行為を含む組換えキナーゼタウ向かっリン酸化活性を示すivatorタンパク質、細胞外シグナル調節キナーゼ2（ERK2）と微小管親和性調節キナーゼ（MARK）は、活性形態で調製することができます。また、十分に特徴付けられたリン酸化パターンと特定のタウタンパク質アイソフォームの生成を可能にするタウ変異体は、タウのリン酸化のコードを解読するために使用されます。 8 - NMR分光法は次に酵素的に修飾されたタウのサンプル6を特徴付けるために使用されます。タウのin vitroリン酸化は、このようなグルタミン酸（Gluの）残基に選択されたセリン/スレオニンの変異などによって擬似リン酸化よりも困難ではあるが、このアプローチは、そのメリットがあります。実際に、リン酸化のいずれも構造的な影響も相互作用パラメータは、常にグルタミン酸によって模倣することができます。例では、Gluの突然変異9で再現されていないホスホセリン202（pSer202）の周りに観察ターンモチーフ/ホスホトレオニン205（pThr205）、です。 インビトロでのリン酸化のタウの詳細なプロトコルが提示されています。 12 - ERK2は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ/ ERKキナーゼ（MEK）10によるリン酸化によって活性化されます。修飾された、同位体標識されたタウタンパク質の調製に加えて、のPTMの同定のために使用されるNMR戦略が記載されています。

<table><tbody><tr><td>pET15B 組換え T7 発現プラスミド</td><td>Novagen</td><td>69257</td> -<td>20 °C に保ちます。C</td></tr><tr><td>BL21(DE3) 形質転換有能 E. coli 細菌</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td>-80 >C</td></tr><tr><td>オートクレーブLBブロス レノックス&nbsp;</td><td>DIFCO</td><td>240210</td><td>細菌増殖培地</td></tr><tr><td>MEM ビタミン 100x</td><td>シグマ</td><td>58970C</td><td>細菌増殖培地 サプリメント</td></tr><tr><td>15N、13C-ISOGRO 完全培地粉末</td><td>シグマ</td><td>608297</td><td>細菌増殖培地 サプリメント</td></tr><tr><td>15NH4Cl</td><td>シグマ</td><td>299251</td><td>同位体</td></tr><tr><td>13C6-Glucose</td><td>Sigma</td><td>389374</td><td>Isotope</td></tr><tr><td>Protease阻害剤錠&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>5056489001</td><td>4 °C で維持します。</td></tr><tr><td>1ml中のC 1錠は、-20°Cに保つことができる40倍溶液です。C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>EUROMEDEX</td><td>1307</td><td>-20 °に保ちます。C</td></tr><tr><td>ホモジナイザー(EmulsiFlex-C3)</td><td>AVESTIN</td><td></td><td>Lysisは4°で実現されます。C</td></tr><tr><td>ピアス&トレード;未染色タンパク質MWマーカー</td><td>Pierce</td><td>266109</td><td></td></tr><tr><td>Active human MEK1 kinase, GST Tagged</td><td>Sigma</td><td>M8822</td> -<td>80 >C</td></tr><tr><td>AKT&Auml;純クロマトグラフィーシステム</td><td>GE Healthcare FPLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5156-01</td><td>陽イオン交換クロマトグラフィーカラム</td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 脱塩</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5087-01</td><td>タンパク質脱塩カラム</td></tr><tr><td>PD MidiTrap G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9180-08</td><td>タンパク質脱塩カラム</td></tr><tr><td>Tris D11, 97% D</td><td>コルテクネット</td><td>CD4035P5</td><td>重水素化NMRバッファー</td></tr><tr><td>5mm対称マイクロチューブ SHIGEMI D2O (インナー&アウターパイプ5本セット)&nbsp;</td><td>Euriso-top</td><td>BMS-005B</td><td>NMR 茂美チューブ</td></tr><tr><td>eVol キット-電子シリンジスターターキット</td><td>Cortecnet</td><td>2910000</td><td>ピペッティング</td></tr><tr><td>Bruker 900 MHz AvanceIII 三重共鳴極低温プローブヘッド付き</td><td>データ収集用ブルカーNMR</td><td></td><td>分光計</td></tr><tr><td>Bruker 600 MHz Avance 三重共鳴極低温プローブヘッド付き</td><td>データ収集用ブルカーNMR</td><td></td><td>分光計</td></tr><tr><td>TopSpin 3.1</td><td>Bruker</td><td></td><td>NMR実験用取得・処理ソフトウェア</td></tr><tr><td>Sparky 3.114</td><td>UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller)</td><td></td><td>NMRデータ解析ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

ニューロンのタウタンパク質の凝集体は、アルツハイマー病患者のニューロンの内部に見られます。この疾患の発症は、タウの異常なリン酸化の増加を伴います。タウの疾患における機能不全の分子研究の過程で、核磁気共鳴(NMR)分光法を使用して、タウの複数のリン酸化を同定します。ここでは、細菌におけるタウの組換え生産の詳細なプロトコルと、NMR研究のための同位体濃縮を紹介します。タウの熱安定性と高等電点を活かした精製ステップについて記載します。組換え活性化ERK2によるタウのin vitroリン酸化のプロトコールは、複数のリン酸化の生成を可能にします。タンパク質サンプルは、これらのステップの問題でデータ取得の準備ができています。次に、分光器で記録を開始するためのパラメータ設定を検討します。最後に、NMRデータに基づいて修飾タウのリン酸化部位を同定する戦略について説明します。この分析法の利点について、免疫検出法や質量分析法(MS)など、リン酸化部位の同定に使用される他の手法と比較した場合の点について説明します。

図3Aは、溶出勾配の間に観察された280nmの主要な吸収ピークを示します。クロマトグラム以上のアクリルアミドゲル上で見られるように、このピークは、精製されたタウタンパク質に相当します。 図3Bは、タンパク質の脱塩が効率的であることを確認して、280 nmおよび導電率のピーク時によく分離吸収ピークを示しています。 図4は、タンパク質のSDS-PAGE分析により、複数のタンパク質のリン酸化の16の特性を観察したゲルシフト（比較レーン2及び3）を示します図6は、（マイクロ秒単位）パルス長の増加とともにプロトン（1 H）1Dの一連のスペクトルを示しています。信号を最小化することによって較正することが容易であるように設定に90°1 Hスピン磁化を回転させるパルスの長さは、360°の回転に対応するパルスは、実際に使用されます。 360°パルスの長さが適切に定義されているときに水プロトンの信号はnullです。 360に対応した値76;回転は、この実験では4 p1で分割さ10.5マイクロ秒です...

>jove_content<ここでは、タウタンパク質をケーススタディとして、核磁気共鳴分光法(NMR)によって天然変性タンパク質の複数のリン酸化を特定する方法について説明します。組換えタウは、データ取得および解析の前に、キナーゼによって同位体的に濃縮および修飾されます。

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

この方法論の全体的な目標は、タウタンパク質をケーススタディとして使用して、核磁気共鳴分光法によって天然変性タンパク質の複数のリン酸化を特定することです。この方法は、リン酸化がタンパク質とその分子パートナーとの相互作用に与える影響など、疾患に関連する分子調節における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、無秩序なタンパク質の部位特異的なリン酸化を特定し、それを構造的および機能的変化と関連付けることができることです。この方法では、関数に関する洞察を得ることができます。それはまたaPtcウイルスからのDNA蛋白質の無秩序な残骸のような他の蛋白質に適用することができるこの技術の適用は蛋白質の開発、蛋白質相互作用の抑制剤の開発によって治療に向かって広がる。この方法は、私たちのグループの博士課程の学生であるClement Danis、Clement Despres、Luiza Bessa、Hamida Merzouguiによってデモンストレーションされます。まず、50マイクロリットルのコンピテントBL21細胞と100ナノグラムのプラスミドDNAを穏やかに混合し、1.5ミリリットルのプラスチックチューブに血漿DNA1マイクログラムあたり1000万から1500万のコロニーを形成します。細胞混合物を氷上に30分間置いた後、摂氏42度で10秒間熱衝撃を与えます。次に、チューブを氷の上に5分間戻し、1ミリリットルの室温Luria BertaniまたはLB培地を追加します。細菌懸濁液を摂氏37度で30分間、穏やかに攪拌しながらインキュベートします。スプレッダーを使用して、100マイクロリットルの細胞懸濁液を、1ミリリットルあたり100マイクログラムのアンピシリン抗生物質を含むLB培地の寒天プレートに均等に広げます。選択プレートを摂氏37度で15時間インキュベートします。次に、300ミリグラムの窒素15と炭素13が濃縮された培地、1グラムの窒素15塩化アンモニウム、および2グラムの炭素13標識グルコースを10ミリリットルのM9培地に可溶化します。フィルターは、0.2ミクロンのフィルターを使用して、同位体溶液をM9培地に直接滅菌します。パスツールピペットを使用して、選択プレートから組換え血漿形質転換細菌の1コロニーを20ミリリットルのLB培地に懸濁し、1ミリリットルあたり100マイクログラムのアンピシリンを補充します。接種した培地を摂氏37度で約6時間インキュベートします。プラスチック分光器キュベット内の細菌培養物の10倍希釈の1ミリリットルを使用して、600ナノメートルまたはOD600で光学密度を測定します。次に、20ミリリットルの飽和LB培養物を、2リットルの三角ガラスバッフル培養フラスコにアンピシリンを添加したM9成長培地1リットルに加えます。培養フラスコを摂氏10度、50RPMに設定されたプログラム可能なインキュベーターに入れます。翌日の早朝に200RPMと摂氏37度に切り替えるようにインキュベーターをプログラムします。OD600をプラスチック分光計キュベット内の1ミリリットルの細菌培養物で測定します。OD600が約1.0の値に達したときに、1モルのIPTGストック溶液を400マイクロリットル追加して、組換えタウタンパク質の発現を誘導します。細菌細胞を摂氏37度でさらに3時間インキュベートした後、5,000倍gで20分間遠心分離してそれらを収集します。細菌細胞ペレットを解凍し、1xプロテアーゼ阻害剤カクテルDNasel 1を新たに補充した45ミリリットルの陽イオン交換バッファーAに再懸濁します。高圧ホモジナイザーを使用して細菌細胞を20, 000 PSIで破壊し、細胞を適切に破壊するには3〜4回のパスが必要です。破壊された細胞を20, 000倍gで40分間遠心分離し、不溶性物質を除去します。バクテリア細胞抽出物をウォーターバスを使用して摂氏75度で15分間加熱します。数分後に白い沈殿物が観察されます。次に、加熱した抽出物を15,000倍gで20分間遠心分離し、上清に熱安定性のあるタウタンパク質を含ませます。次に、高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムを使用して、5ミリリットルベッドカラムとして充填された強CEX樹脂で陽イオン交換クロマトグラフィーを実行します。流速を毎分2.5ミリリットルに設定し、CEX Aバッファーでカラムを平衡化します。次に、60〜70ミリリットルの加熱タウ抽出物をサンプルポンプを用いてロードし、分析用のフロースルーを採取して、タウタンパク質が樹脂に効率的に結合していることを確認します。280ナノメートルの吸光度がベースライン値に戻るまで、樹脂をCEX Aバッファーで洗浄します。10カラム容量で最大25%CEX Bバッファーのグラジエントを使用してFPLCをプログラムすると、250ミリモルの塩化ナトリウムに到達します。これに続いて、5カラム容量の50%CEX Bバッファーを使用して、500ミリモルの塩化ナトリウムに到達します。最後に、グラジエントを 2 カラム容量で 100%CEX B バッファーに増やし、1 モルの塩化ナトリウムに到達させます。溶出ステップ中に1.5ミリリットルの画分を回収します。次に、プールされたフラクションを含むタウに対してバッファー交換を実行します。FPLCシステムを使用して、15ミリモルの重炭酸アンモニウム緩衝液中の53ミリリットルのG25樹脂充填ベッドで脱塩カラムを平衡化します。流量を 5 ミリリットル/分に設定し、5 ミリリットルの注入ループを介してタウ試料をカラムに注入します。280ナノメートルの吸収ピークに対応する画分を収集します。サンプルをチューブに割り当てる前に、すべてのタウ画分をプールします。溶液の体積がチューブの体積に比べて小さくなるように、これらのチューブを選択してください。次に、針を使用してチューブキャップに穴を開けてから、タウサンプルを摂氏マイナス80度で凍結し、後で凍結乾燥します。4ミリグラムの凍結乾燥窒素15および炭素13が豊富なerkリン酸化タウを400マイクロリットルのNMRバッファーに可溶化します。NMR分光計のフィールドロック用に5%の酸化重水素を追加し、内部NMR信号基準として1ミリモルTMSPを追加します。また、完全なプロテアーゼ阻害剤カクテルの40 EKストック溶液を10マイクロリットル加えます。5ミリリットルのNMRチューブに、長い針付きの電子シリンジまたはパスツールピペットを使用してサンプルを移します。プランジャーを使用してNMRチューブを閉じます。プランジャーを動かして、プランジャーと液体の間に閉じ込められた気泡を取り除きます。NMRチューブをスピナーに入れます。適切なゲージを使用して、スピナー内の垂直位置を調整し、サンプル溶液のほとんどがNMRコイルの内側に入るようにします。次に、Magnet Control Systemウィンドウでliftをクリックして、NMR装置のエアフローを開始します。チューブをマグネットボア上部の気流に入れた状態でスピナーを慎重に配置します。次に、空気の流れを止め、チューブを磁石内のプローブヘッド内の所定の位置に下降させます。サンプルを摂氏25度まで平衡化させた後、コマンドラインにATMMと入力して、プローブヘッドの半自動チューニングとマッチングを実行し、電力伝送を最適化します。次に、[Magnet Control System]ウィンドウで[lock]をクリックして、分光器のフィールド周波数ロックを作動させます。サンプルの位置での磁場の均一性を最適化するためのシミング手順を開始するには、まずコマンドラインでTopShim GUIと入力してシムウィンドウを開きます。次に、シムウィンドウで[開始]をクリックします。残留B0標準偏差をチェックして、シムが最適であることを確認します。次に、陽子無線周波数パルスの長さ(マイクロ秒単位)であるP1パラメータを較正します。このパラメータは、プロトンスピン磁化の90度回転を得るために必要です。水陽子の1次元スペクトルを使用して360度のパルスを目指します。O1パラメータを1次元スペクトルの陽子水周波数に設定して、周波数オフセットを調整します。最後に、コマンドラインに「ZG」と入力して、1次元プロトンスペクトルの収集を開始します。組換えタウの精製の代表的な結果は、溶出勾配中に観察された280ナノメートルでの主要な吸収ピークを示しています。このピークは、クロマトグラムの上のアクリルアミドゲルに見られる精製タウタンパク質に対応します。組換え精製タウの脱塩用クロマトグラムは、280ナノメートルの吸収ピークと導電率のピークが十分に分離されていることを示しており、タンパク質の脱塩が凍結乾燥ステップで効率的であることが保証されています。900メガヘルツの組換え窒素15タウの1次元NMRスペクトルは、タンパク質サンプルからのNMRシグナルを検出できることを裏付けています。良好な信号対雑音比は、基本的な集録パラメータが正しく設定されたことを示します。リン酸化タンパク質の二次元スペクトルは良好な分解能を示し、共鳴は狭く、よく分離されています。赤で囲まれたスペクトル領域の共鳴は、リン酸化残基に対応します。このビデオを見れば、簡単に選べるラベリングで組換えタンパク質を作製し、このタンパク質を精製し、スペクトルデータ取得の基本パラメータを設定できるようになるはずです。このプロトコルは、一度マスターすれば、適切に整理されていれば2週間で完了します。NMR分光法では、金属物体に近づかないように非常に強力な磁石を使用していることを忘れないでください。この手順を試みる際には、これらの他のタンパク質がプロテアーゼ溶解に敏感であり、サンプルの分解を避けるためにいくつかの予防措置を講じる必要があることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、固体NMRなどの他の方法を適用して、無秩序なタンパク質によって形成されることが多いアミロイド様凝集体を調べることができます。その開発後、この技術は、ケミカルバイオロジーの分野の研究者が、in vitroモデル系でセラパティックな可能性を持つ活性化合物を探索する道を開きました。

nuclear-magnetic-resonance-spectroscopy-for-identification-multiple

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このビデオでは、核磁気共鳴分光法(NMR)技術を使用してタンパク質内の複数のリン酸化を特定する方法を示します。特定のアミノ酸でのタンパク質のリン酸化は、隣接するアミド水素のシールド解除を引き起こし、スペクトルの違いを生じさせます。...

タンパク質中の複数のリン酸化を同定するための核磁気共鳴分光法

ここでは植物性タンパク質複合体の精製および特性評価のためのプロトコルを記述します。私たちは、複雑な内部に単一のタンパク質を免疫沈降によって、私たちはその翻訳後修飾とその相互作用パートナーを識別できることを実証している。...

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

コンフォメーションの柔軟性は、タンパク質の機能に重要な役割を果たしています。本明細書において、我々は、規則及び不規則タンパク質に機能を駆動急速な構造変化をプロービングするための水素 - 重水素交換に結合された時間分解エレクトロスプレーイオン化質量分析法の使用を記載しています。...

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

ペプチド競合アッセイは、種々の分子および免疫学的実験において広く使用されている。本稿では、in vitroオリゴペプチド競合キナーゼアッセイの詳細な方法と、特定のリン酸化部位を見出すのに有用な関連する検証手順について説明します。...

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

原子分解能で分子タンパク質複合体の構造は、多様な生命現象で重要な役割のため関連性が高いです。ここで、マジック角回転固体核磁気共鳴分光法 (MAS SSNMR) による不溶性と非晶質高分子タンパク質複合体の高分解能構造解析を実行するためのプロトコルを提案する.

固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

サイクリン依存性キナーゼ 1 (Cdk1) 細胞周期 G2 段階で活性化し、多くの細胞経路を調節します。この重要なキナーゼの細胞内標的を確立するため Cdk1 固有のリン酸化部位の同定を可能にする Cdk1...

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

天然変性タンパク質の弱く一過性の分子間および分子内相互作用を検出するための常磁性緩和増強NMR分光法の適用のためのプロトコルが提示されています。...

天然的に無秩序なタンパク質の自己会合の検出と特性評価のための常磁性緩和増強

本プロトコルは、改良された一分子プルダウン(SiMPull)アッセイを用いてタンパク質リン酸化を定量するためのサンプル調製およびデータ分析について記載する。...

タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ

ここでは、細胞および組織からの内因性リンタンパク質ホスファターゼおよびそれらの相互作用タンパク質の濃縮、ならびに質量分析ベースのプロテオミクスによるそれらの同定および定量のためのプロトコルを提示する。...

リンタンパク質ホスファターゼとそのインターアクターを同定するための質量分析ベースのアプローチ

核磁気共鳴(NMR)分光法は、構造タンパク質のダイナミクスを残留物特異的な方法で特徴付けることができます。私たちは、ピコ秒からナノ秒の時間スケールに敏感なNMR 15N R1 およびR2...

タンパク質のピコ秒からナノ秒の構造ダイナミクスを調べるためのNMR 15N緩和実験

学ぶ、本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化部位を核磁気共鳴分光法で同定する手法。Tauタンパク質を用いて、リン酸化がタンパク質相互作用に与える影響を解明し、神経変性疾患の治療戦略開発に貢献する。

本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法

さらに動画を探す