本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法
2016年12月27日
この方法論の全体的な目標は、タウタンパク質をケーススタディとして使用して、核磁気共鳴分光法によって天然変性タンパク質の複数のリン酸化を特定することです。この方法は、リン酸化がタンパク質とその分子パートナーとの相互作用に与える影響など、疾患に関連する分子調節における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、無秩序なタンパク質の部位特異的なリン酸化を特定し、それを構造的および機能的変化と関連付けることができることです。
この方法では、関数に関する洞察を得ることができます。それはまたaPtcウイルスからのDNA蛋白質の無秩序な残骸のような他の蛋白質に適用することができるこの技術の適用は蛋白質の開発、蛋白質相互作用の抑制剤の開発によって治療に向かって広がる。この方法は、私たちのグループの博士課程の学生であるClement Danis、Clement Despres、Luiza Bessa、Hamida Merzouguiによってデモンストレーションされます。
まず、50マイクロリットルのコンピテントBL21細胞と100ナノグラムのプラスミドDNAを穏やかに混合し、1.5ミリリットルのプラスチックチューブに血漿DNA1マイクログラムあたり1000万から1500万のコロニーを形成します。細胞混合物を氷上に30分間置いた後、摂氏42度で10秒間熱衝撃を与えます。次に、チューブを氷の上に5分間戻し、1ミリリットルの室温Luria BertaniまたはLB培地を追加します。
細菌懸濁液を摂氏37度で30分間、穏やかに攪拌しながらインキュベートします。スプレッダーを使用して、100マイクロリットルの細胞懸濁液を、1ミリリットルあたり100マイクログラムのアンピシリン抗生物質を含むLB培地の寒天プレートに均等に広げます。選択プレートを摂氏37度で15時間インキュベートします。
次に、300ミリグラムの窒素15と炭素13が濃縮された培地、1グラムの窒素15塩化アンモニウム、および2グラムの炭素13標識グルコースを10ミリリットルのM9培地に可溶化します。フィルターは、0.2ミクロンのフィルターを使用して、同位体溶液をM9培地に直接滅菌します。パスツールピペットを使用して、選択プレートから組換え血漿形質転換細菌の1コロニーを20ミリリットルのLB培地に懸濁し、1ミリリットルあたり100マイクログラムのアンピシリンを補充します。
接種した培地を摂氏37度で約6時間インキュベートします。プラスチック分光器キュベット内の細菌培養物の10倍希釈の1ミリリットルを使用して、600ナノメートルまたはOD600で光学密度を測定します。次に、20ミリリットルの飽和LB培養物を、2リットルの三角ガラスバッフル培養フラスコにアンピシリンを添加したM9成長培地1リットルに加えます。
培養フラスコを摂氏10度、50RPMに設定されたプログラム可能なインキュベーターに入れます。翌日の早朝に200RPMと摂氏37度に切り替えるようにインキュベーターをプログラムします。OD600をプラスチック分光計キュベット内の1ミリリットルの細菌培養物で測定します。
OD600が約1.0の値に達したときに、1モルのIPTGストック溶液を400マイクロリットル追加して、組換えタウタンパク質の発現を誘導します。細菌細胞を摂氏37度でさらに3時間インキュベートした後、5,000倍gで20分間遠心分離してそれらを収集します。細菌細胞ペレットを解凍し、1xプロテアーゼ阻害剤カクテルDNasel 1を新たに補充した45ミリリットルの陽イオン交換バッファーAに再懸濁します。
高圧ホモジナイザーを使用して細菌細胞を20, 000 PSIで破壊し、細胞を適切に破壊するには3〜4回のパスが必要です。破壊された細胞を20, 000倍gで40分間遠心分離し、不溶性物質を除去します。バクテリア細胞抽出物をウォーターバスを使用して摂氏75度で15分間加熱します。
数分後に白い沈殿物が観察されます。次に、加熱した抽出物を15,000倍gで20分間遠心分離し、上清に熱安定性のあるタウタンパク質を含ませます。次に、高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムを使用して、5ミリリットルベッドカラムとして充填された強CEX樹脂で陽イオン交換クロマトグラフィーを実行します。
流速を毎分2.5ミリリットルに設定し、CEX Aバッファーでカラムを平衡化します。次に、60〜70ミリリットルの加熱タウ抽出物をサンプルポンプを用いてロードし、分析用のフロースルーを採取して、タウタンパク質が樹脂に効率的に結合していることを確認します。280ナノメートルの吸光度がベースライン値に戻るまで、樹脂をCEX Aバッファーで洗浄します。
10カラム容量で最大25%CEX Bバッファーのグラジエントを使用してFPLCをプログラムすると、250ミリモルの塩化ナトリウムに到達します。これに続いて、5カラム容量の50%CEX Bバッファーを使用して、500ミリモルの塩化ナトリウムに到達します。最後に、グラジエントを 2 カラム容量で 100%CEX B バッファーに増やし、1 モルの塩化ナトリウムに到達させます。
溶出ステップ中に1.5ミリリットルの画分を回収します。次に、プールされたフラクションを含むタウに対してバッファー交換を実行します。FPLCシステムを使用して、15ミリモルの重炭酸アンモニウム緩衝液中の53ミリリットルのG25樹脂充填ベッドで脱塩カラムを平衡化します。
流量を 5 ミリリットル/分に設定し、5 ミリリットルの注入ループを介してタウ試料をカラムに注入します。280ナノメートルの吸収ピークに対応する画分を収集します。サンプルをチューブに割り当てる前に、すべてのタウ画分をプールします。
溶液の体積がチューブの体積に比べて小さくなるように、これらのチューブを選択してください。次に、針を使用してチューブキャップに穴を開けてから、タウサンプルを摂氏マイナス80度で凍結し、後で凍結乾燥します。4ミリグラムの凍結乾燥窒素15および炭素13が豊富なerkリン酸化タウを400マイクロリットルのNMRバッファーに可溶化します。
NMR分光計のフィールドロック用に5%の酸化重水素を追加し、内部NMR信号基準として1ミリモルTMSPを追加します。また、完全なプロテアーゼ阻害剤カクテルの40 EKストック溶液を10マイクロリットル加えます。5ミリリットルのNMRチューブに、長い針付きの電子シリンジまたはパスツールピペットを使用してサンプルを移します。
プランジャーを使用してNMRチューブを閉じます。プランジャーを動かして、プランジャーと液体の間に閉じ込められた気泡を取り除きます。NMRチューブをスピナーに入れます。
適切なゲージを使用して、スピナー内の垂直位置を調整し、サンプル溶液のほとんどがNMRコイルの内側に入るようにします。次に、Magnet Control Systemウィンドウでliftをクリックして、NMR装置のエアフローを開始します。チューブをマグネットボア上部の気流に入れた状態でスピナーを慎重に配置します。
次に、空気の流れを止め、チューブを磁石内のプローブヘッド内の所定の位置に下降させます。サンプルを摂氏25度まで平衡化させた後、コマンドラインにATMMと入力して、プローブヘッドの半自動チューニングとマッチングを実行し、電力伝送を最適化します。次に、[Magnet Control System]ウィンドウで[lock]をクリックして、分光器のフィールド周波数ロックを作動させます。
サンプルの位置での磁場の均一性を最適化するためのシミング手順を開始するには、まずコマンドラインでTopShim GUIと入力してシムウィンドウを開きます。次に、シムウィンドウで[開始]をクリックします。残留B0標準偏差をチェックして、シムが最適であることを確認します。
次に、陽子無線周波数パルスの長さ(マイクロ秒単位)であるP1パラメータを較正します。このパラメータは、プロトンスピン磁化の90度回転を得るために必要です。水陽子の1次元スペクトルを使用して360度のパルスを目指します。
O1パラメータを1次元スペクトルの陽子水周波数に設定して、周波数オフセットを調整します。最後に、コマンドラインに「ZG」と入力して、1次元プロトンスペクトルの収集を開始します。組換えタウの精製の代表的な結果は、溶出勾配中に観察された280ナノメートルでの主要な吸収ピークを示しています。
このピークは、クロマトグラムの上のアクリルアミドゲルに見られる精製タウタンパク質に対応します。組換え精製タウの脱塩用クロマトグラムは、280ナノメートルの吸収ピークと導電率のピークが十分に分離されていることを示しており、タンパク質の脱塩が凍結乾燥ステップで効率的であることが保証されています。900メガヘルツの組換え窒素15タウの1次元NMRスペクトルは、タンパク質サンプルからのNMRシグナルを検出できることを裏付けています。
良好な信号対雑音比は、基本的な集録パラメータが正しく設定されたことを示します。リン酸化タンパク質の二次元スペクトルは良好な分解能を示し、共鳴は狭く、よく分離されています。赤で囲まれたスペクトル領域の共鳴は、リン酸化残基に対応します。
このビデオを見れば、簡単に選べるラベリングで組換えタンパク質を作製し、このタンパク質を精製し、スペクトルデータ取得の基本パラメータを設定できるようになるはずです。このプロトコルは、一度マスターすれば、適切に整理されていれば2週間で完了します。NMR分光法では、金属物体に近づかないように非常に強力な磁石を使用していることを忘れないでください。
この手順を試みる際には、これらの他のタンパク質がプロテアーゼ溶解に敏感であり、サンプルの分解を避けるためにいくつかの予防措置を講じる必要があることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、固体NMRなどの他の方法を適用して、無秩序なタンパク質によって形成されることが多いアミロイド様凝集体を調べることができます。その開発後、この技術は、ケミカルバイオロジーの分野の研究者が、in vitroモデル系でセラパティックな可能性を持つ活性化合物を探索する道を開きました。
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概要
本記事では、Tauタンパク質をケーススタディとして、核磁気共鳴分光法（NMR）を用いて内在性無秩序タンパク質の多点リン酸化を同定するための手法を提示します。この手法により、部位特異的なリン酸化の同定が可能となり、これらの修飾をタンパク質の構造的および機能的な変化と関連付けることができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生化学
- 構造生物学
背景
- リン酸化は、タンパク質の機能および相互作用において重要な役割を果たします。
- 固有不規則タンパク質は、その柔軟な性質のため研究が困難です。
- NMR分光法は、タンパク質のダイナミクスを解析するための強力なツールです。
- Tauタンパク質は、神経変性疾患に関与しています。
研究の目的
- 不規則構造タンパク質におけるリン酸化部位を同定するための手法を開発すること。
- リン酸化がタンパク質相互作用に及ぼす影響を理解すること。
- 疾患に関連する分子制御についての知見を提供すること。
使用した手法
- リコンビナントTauタンパク質の同位体濃縮。
- キナーゼによるTauのin vitro修飾。
- データ取得のための核磁気共鳴分光法。
- リン酸化後の構造的および機能的変化の解析。
主な結果
- Tauタンパク質における複数のリン酸化部位の同定に成功した。
- リン酸化とタンパク質相互作用ダイナミクスの間の関連性を実証した。
- タンパク質相互作用阻害剤による治療薬開発への応用の可能性が示された。
- 本手法は、他の天然変性タンパク質にも適用可能である。
結論
- 開発された手法により、天然変性タンパク質のリン酸化に関する理解が深まります。
- 得られた知見は、神経変性疾患の治療戦略に活用できます。
- このアプローチは、同様の特性を持つ他のタンパク質にも応用可能です。
よくある質問
産業界における重要性
NMR分光法を用いることで、天然変性タンパク質における部位特異的なリン酸化マッピングが可能となり、疾患関連のタンパク質修飾に関するメカニズム的な知見が得られます。このアプローチは、翻訳後修飾を構造的および機能的変化に結びつけることでターゲットのバリデーションを支援し、治療仮説の検証に寄与します。本手法により、免疫測定法や質量分析法のみでは検出が困難なリン酸化パターンを解明できるため、初期創薬段階における予測の信頼性が向上します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：Tauなどの不規則的に折りたたまれたタンパク質における部位特異的なリン酸化を同定し、キナーゼシグナル伝達経路に関連する治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：同位体濃縮と熱ベースの精製を用いることで、一貫した標的解析に適した、NMR解析可能な均一サンプルを調製する。
- 科学的価値：リン酸化を構造的および機能的な変化に結びつけ、神経変性疾患モデルにおける標的のメカニズム的なリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： キナーゼ阻害剤スクリーニングにおけるアッセイ標準化のバイオマーカーとして利用可能な、定量的に解像されたリン酸化シグネチャーを生成します。
- 運用の価値： 複数のリン酸化状態の再現性のある検出を可能にし、アッセイの堅牢性とラボ間の比較可能性を向上させます。
- 科学的価値： リン酸化依存的なタンパク質相互作用を標的としたリード化合物同定の指針となる、残基レベルの修飾データを提供します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： アルツハイマー病の病理学的特徴であるTauの異常リン酸化をマッピングすることにより、疾患に関連するシステムを支援します。
- 運用の価値： 前臨床検証における後続の生物物理学的および機能的アッセイに適した、精製されたリン酸化タンパク質を生成します。
- 科学的価値： リン酸化状態とタンパク質相互作用のダイナミクスの相関を可能にし、リスク調整後の進展決定に情報を与えます。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットバリデーションからリード化合物同定に至る創薬の連続的なプロセスに適合し、化合物のスクリーニングおよび最適化に資するメカニズム的な知見を提供します。
- 探索生物学：リン酸化が天然変性タンパク質の構造および相互作用能をどのように変化させるかを解明することで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：部位特異的なリン酸化の定量データを提供し、キナーゼ活性やホスファターゼ機能に対する化合物の影響を評価します。
- 分析：リン酸化状態と非リン酸化状態を比較するための客観的なリードアウトとして、NMRから得られる化学シフトおよび共鳴割り当てを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：神経変性と関連するTauのリン酸化パターンを通じて、分子修飾と疾患表現型を結びつけます。
- 企業内での再利用：Tau以外の天然変性タンパク質におけるリン酸化研究に再利用可能なプラットフォームを構築し、インフラ投資を最大化します。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値： phosphorylation site（リン酸化部位）とその構造的影響に関する原子分解能データを提供することで、メカニズム上の曖昧さを軽減する。
- 運用上の価値： サンプル調製およびデータ取得のワークフローを標準化し、プロジェクトをまたいで再現可能なリン酸化マッピングを実現する。
- 戦略的価値： ターゲットの創薬可能性（druggability）を変化させる可能性のある、機能的に重要な修飾を早期に検出可能にすることで、Go/No-Go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響： 修飾部位の検証および機能的関連性への信頼度に基づき、リスクを調整したターゲットの優先順位付けを促進する。
実施上の検討事項
- 正常に実施するためには、タンパク質発現、同位体標識、およびNMR分光法の専門知識が必要です。
- 高磁場NMR分光計、およびサンプルハンドリングとデータ収集のための補助設備へのアクセスに依存します。
- バッファー条件、リン酸化プロトコル、およびデータ解析パイプラインについて、チームを横断した標準化が必要です。
- 溶解性、安定性、または電荷特性が異なる他の天然変性タンパク質に本手法を適用する場合、適応に関する検討が必要となります。
- 標的タンパク質の固有の不規則性により、相補的な手法を用いない場合、スペクトルのアサインメントが困難になる可能性があります。
