（ゼブラフィッシュにおける癌細胞の血管浸潤能をテストします

この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュ胚モデルにおけるがん細胞の悪性および浸潤性の挙動を評価することです。この方法は、研究者ががん細胞が機能的な循環系から侵入できるかどうかを判断するのに役立ち、それによって転移カスケードの重要なステップをモデル化します。この技術の主な利点は、ゼブラフィッシュの胚モデルがこの評価を提供し、マウスでよく行われる同様の実験よりもターンアラウンドタイムが短いことです。

その手順を実演するのは、ジョージタウン大学のゼブラフィッシュコア施設を運営するエリック・グラスゴー博士です。テキストプロトコルに従ってがん細胞、試薬、ゼブラフィッシュの胚を調製した後、マイクロインジェクションディスペンスシステムを加圧空気源に取り付け、電源をオンにします。フットペダルを踏んで圧力をテストします。

ニードルホルダーから短い空気のパルスが放出されるはずです。20ミリリットルの2X Tricaine Solutionをインジェクションプレートに加え、プレートをシェーカーに置いて平衡化します。次に、2X Tricaineの2番目のアリコートで平衡化を繰り返します。

次に、プラスチック製のピペットを使用して、胚のグループを2X Tricaine Solutionが入った小さな皿に移します。ゲルローディングチップを使用して、マイクロインジェクション針にがん細胞を埋め戻します。針を電極保存ジャーに入れ、先のとがった端を下に向けて、細胞が先端近くに定着するようにします。

20〜30個の麻酔をかけた胚を注入プレートに移し、プラスチックピペットで2Xトリカインをたっぷり含んだ胚を採取します。胚をピペットの先端にセットしてから、胚を注入プレートのトラフに静かに排出し、トラフの長さに沿って胚を広げます。胚を頭を上に向け、腹をトラフの急な壁に向けます。

マイクロマニピュレーターのニードルホルダーに針を取り付けます。次に、注入プレートを60度の壁を左にしてステレオスコープの下に配置し、25倍の倍率で上部の胚に焦点を合わせます。マイクロマニピュレーターを伸ばしたときに針が胚を突き刺すように配置します。

次に、針が胚にほぼ触れるまで目で針を伸ばします。次に、顕微鏡で観察しながら、針を胚に合わせます。細胞を注入するには、卵黄嚢を通して胚のトラフを突き刺します。

フットペダルを踏み込み、先端を心臓前洞ではなくちょうどその位置に置きます。注射の力により、細胞は心臓洞に排出されます。あるいは、卵黄嚢に細胞を注入することで、原稿に記載されている血管浸潤のさまざまな側面を研究することができます。

右手で注射針を伸縮させます。左手で、次の胚の位置を微調整します。プレート全体が注入されたら、針を電極保存ジャーに戻します。

胚を回収皿に移すには、注入プレートを傾けて胚を底から引き出し、胚をトラフから洗い流し、プラスチックピペットを使用して胚を収集します。胚がピペットの底に落ち着くのを待ってから、最小限のトリカインで胚を回収皿に移します。回収皿を摂氏28度で1時間インキュベートしてから、生存可能な胚を死んだ胚や破片から分離します。

スコアリングの準備ができるまで、皿を摂氏33度でインキュベートします。採点する胚のバッチを麻酔した後、テキストプロトコルに従って、麻酔をかけた幼虫をトリカインの滴でうつ病顕微鏡スライドに置きます。尾部の最適なイメージングのために、幼虫を横向きにします。

スライドを10倍対物レンズを備えた複合蛍光顕微鏡に置きます。血管系から正常に侵入したがん細胞の数を数え、尾部を上下に焦点を合わせて無傷の細胞を明確に識別することにより、幼虫を採点します。1.5%アガローストリカイン溶液を溶かし、摂氏37度にします。

前と同じように胚に麻酔をかけた後、トリカイン溶液の滴中の胚をイメージング表面に移します。ガラスピペットを使用して、画像表面に胚を保持している余分なトリカイン溶液を除去します。次に、溶かしたアガロース溶液を1滴胚に重ねます。

アガロースが重合する前に、まつげブラシのような繊細なツールを使用して胚を横向きにしてイメージングし、胚がイメージング表面に沿って平らになるように細心の注意を払います。アガロース液滴が重合したら、トリカイン溶液に浸します。最後に、生きたゼブラフィッシュの胚を顕微鏡イメージングにさらします。

ゼブラフィッシュの胚における血管浸潤能について試験した7つの乳がん細胞株のうち、MDA-MB-231細胞株は、注射後96時間で評価したところ、胚あたりの血管外漏出がん細胞の数が最も多かった。また、BT-474細胞は胚の尾側領域に容易に侵入し、MCF-7、SK-BR-3、T-47Dなどの他の細胞株は低侵襲であることが観察されました。異なる注入部位を利用した改変アサイでは、血管侵襲能が異なるMDA-MB-231細胞の2つの集団を、発生中の胚の卵黄嚢に同時に注入する競争実験が行われました。

スコアリングを行ったところ、注入前にコンフルエント培養条件下で増殖したMDA-MB-231細胞は、循環内への血管内投与の減少を示し、したがって胚の尾側領域における存在が減少したと判断されました。ゼブラフィッシュの胚注入は、一度習得すれば、適切に行えば4時間で行うことができます。この手順を試みる際には、がん細胞の血管外漏出を採点する際に、厳格で一貫した基準を採用することを忘れないでください。

この手順に続いて、結果をマウスモデルでさらに検証できます。このビデオを見た後、注射の実施方法と血管外漏出のスコアリング方法を十分に理解し、ゼブラフィッシュ胚のがん細胞の血管侵襲能力をテストできるようになります。