Name: 接種ハマダラカ蚊 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 学ぶ、ハマダラカの免疫応答を刺激しメラニン化反応を定量化する接種技術。生態免疫学における遺伝的基盤と環境要因の影響を解明し、無脊椎動物の抗ウイルス・抗菌応答研究にも応用可能です。

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この研究はヌーシャテル大学からの資金提供を通じて可能になりました。この技術の向上に協力してくれたすべての学生、つまり同僚のケビン・ティイーベントに感謝します。また、研究室を開設してくださったトーマス研究室の皆さんにも感謝申し上げます。蚊の飼育に協力してくれたジャネット・ティープルに感謝します。また、トム・ベイカー教授の研究室にあるロイヤル・ホール氏には、マイクロキャピラリーガラス管の調製にご協力いただいたことに感謝いたします。

注射や解剖1.生理食塩水<ol><li> pH値= 6.8で1.3のNaCl、0.5mMのKClと0.2 mMのCaCl 2をを得るために、蒸留水に塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化カルシウムを添加することにより、生理食塩水を準備します。 </li><li>透明ビーズを着色するために生理食塩水の99ミリリットルに0.1％メチルグリーン溶液1mlを追加します。これは、0.001％メチルグリーン」注射液」です。 </li><li>その後、生理食塩水45mlの0.1％メチルグリーン溶液5mlを追加します。この0.01％メチルグリーン」解剖溶液」切開中のビーズの着色とその観察を容易にするために、メチルグリーンで10倍に濃縮します。 注：必要に応じてバッファを殺菌フィルター。 </li></ol> 2.キャピラリーの準備<ol><li>熱プルマイクロキャピラリーガラス管最小のビーズ（φ= 40μm）の42よりもわずかに大きい非常に微細な先端を得ることができます。 </li><li>オープンとAピンセットでチップを破壊したり、先端をオフにソーイングすることにより、各キャピラリをdjust。 </li></ol> 3.蚊飼育<ol><li> 26±1℃でリアのA.ハマダラカ 、70±5％の相対湿度、12：12時間の明：暗サイクル。成人女性を維持し、それらを10％糖液へのアクセスを与えます。 </li></ol>キャピラリー4.ビーズ選択<ol><li> 5センチメートルペトリ皿に負に帯電したビーズ（直径40〜120ミクロン）の0.009グラムを注ぎ、事前に注射液の30分の5ミリリットルを追加します。 注：目標は、注射のためのビーズ選択を容易にするために、染料の色にビーズをできるようにすることです。彼らは無菌ジャーに来ていない場合は、ビーズをオートクレーブ。 </li><li>キャピラリーピペット電球に搭載されたキャピラリーを用いて、視覚的に双眼顕微鏡下での生理食塩水0.1μlの最小のビーズを選択します。 注：同時に複数のビーズを接種すると、0.1マイクロリットルの総容積から3ビーズを選択します。</li></ol> 5.モスキート処理および接種<ol><li>昆虫吸引器を使用して、50ミリリットルチューブに各蚊を置きます。 </li><li>砕いた氷（2-5分）にチューブを配置することによって、簡単に各蚊を冷やします。 </li><li>双眼顕微鏡下でその右側に蚊を置きます。 </li><li>実体顕微鏡下で、しっかりと胸腔のキューティクルの左側を貫通した後、液体やビーズを注入することにより、キャピラリーで蚊を接種します。 注：可能な限り蚊に同様に垂直にキャピラリーを保持することにより、飛翔筋を傷つけないように注意してください。 </li><li>毛細血管を削除します。 </li><li>フェザー級昆虫学の鉗子を使用して、蚊帳で覆われた180ミリリットルのプラスチックカップに個別に女性を配置。彼らに10％の糖溶液へのアクセスを与えます。 注：蚊は、糖液滴にはまり込むことができるように注意、糖液で必要とされます。 </li></ol> 6.モスキート解剖とビーズの写真<ol><li>蚊が接種後24時間生きているかどうかを確認してください。もしそうであれば、その状態を確認し、飛ぶことができますだけで蚊を保ちます。 </li><li> -20℃で、これらの蚊をフリーズします。 注：必要に応じて彼らは、解剖の前に数ヶ月に数日間維持することができます。 </li><li> 32Xの倍率で双眼顕微鏡下でピンセットを使って蚊羽を削除します。透明テープでスライドガラス上に翼を固定してください。各個々の蚊のために使用されるコードを書き留めます。 </li><li>スキャナでガラススライドを入れて、1200 dpiでそれらをスキャンします。 注：コードは、個々の蚊のために読み取り可能であることを確認してください。 </li><li>ガラス顕微鏡スライド上にと解剖溶液中で、頭部と腹部から胸部を分離するために鉗子を使用しています。 </li><li>ビーズを取得するために鉗子で胸部を開きます。 注：腹部に移動しないビーズは、互いに接触しておらず、それらのほとんどがTで自由に浮きます彼は血リンパ。非メラニンビーズを見つけるのは厳しいものになる可能性があるため、ピンセットでビーズを壊さないように注意してください。色を得るためにビーズ1〜5分間待ってください。 </li><li>写真を撮る前に、ガラス顕微鏡スライド上の解剖液の液滴中にビーズを転送します。 注：ビーズを洗浄する必要はありません。 </li><li>カメラを備えた顕微鏡を使用して、標準の照明設定と400Xの倍率で各ビーズのデジタル画像を撮ります。 注：彼らの比較を可能にするために、異なる画像間の照明を変更しないでください。 </li></ol> 7.画像解析：ビーズメラニン<ol><li>画像解析ソフトウェアを開きます。 「ファイル」をクリックして、「開く」をビーズ画像を見つけること。 </li><li>クリックして「分析」。クリックして「設定の測定値。 &quot; 「セット測定」ウィンドウで「グレイ平均値」ボックスにチェックを入れ。 </li><li>サークル選択ツールアイコンをクリックします。ビーズ周囲を選択します。に残りますビーズを左右し、その周りに明るいハローを避けます。 </li><li> 「分析」メニューをクリックします。クリックして「尺度。」ビーズの断面積の平均グレー値とサイズを取得します。 <ol><li> 「 - 灰色の平均値256。」：各ビーズのメラニン値を取得するには、電卓や計算機のソフトウェアを使用して、次の操作を行いますメラニンの尺度は0が完全に白画像を表すと、0と256の間の値です。 </li></ol></li></ol>

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<li>Paskewitz, S., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Plasmodium+refractory+and+susceptible+strains+of+Anopheles+gambiae+to+inoculated+Sephadex+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+comp+immunol%22%5BJournal%5D)">Response of Plasmodium refractory and susceptible strains of Anopheles gambiae to inoculated Sephadex beads.</a> Dev comp immunol. 18 (5), 369-375 (1994).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

この注入法は、蚊におけるメラニンの応答を刺激し、検討することが有用です。例えば、ここでは、免疫刺激負荷の影響を検討しました。 この手順の重要なステップは、適切に蚊に接種することです。飛翔筋または蚊自体への過度な損傷が給紙から蚊を防ぐことができるか、解剖の前にそれを殺すことができます。第二の重要なステップは、それらを殺すことなく、それらをノックアウトするのに十分な長さ氷上で蚊を維持することです。それは氷との緊密な接触を可能にするような小さな容器は、プロセスを容易にし、スピードアップします。ピンセットは、そうでない場合は、ビーズを破損する可能性があり最後に、特別な注意が、解剖時に必要とされています。蚊の組織に埋め込まれたビーズは、解剖液で着色するより多くの時間がかかることがあります。 彼らはMと（のような中立的、積極的、または負に帯電したビーズやガラスビーズ）は、異なる結果につながるビーズの複数種類を使用しますAYすべて同じ程度27,43にメラニンされていません。実際に、中性に荷電したビーズに比べて、負に帯電...

そのキューティクルまたはそれらの中腸上皮4を通して破る3 -昆虫は寄生虫や病原体1から身を守るために免疫応答に依存しています。蚊では、これらの応答は、細菌5、ウイルス6、フィラリア線虫7、およびマラリア原虫1,8,9に対して効率的です。 12 -蚊では、キー免疫応答は、メラニン10で異物をカプセル化したものです。 12 -このカプセル化は、中腸内または血リンパ循環システム10に発生する可能性があります。このメラニン応答は、プロフェノールオキシダーゼカスケード10の結果である- 12、そしてそれは寄生虫の死に、またはそれらの食作用につながることができます。血球細胞の数は限られている大人の蚊では、メラニンは、マラリア原虫の寄生虫やフィラリア線虫7に対してのように、体液性応答です。いくつかの他の昆虫では、それは直接7メラニン化するために寄生虫の周りに集まる血球細胞です。また、メラニンは7治癒産卵とキューティクルの傷のようないくつかの他の生理学的プロセスのためにも不可欠です。 18 -免疫応答の刺激は、いくつかの農業および公衆衛生モデル系13の昆虫耐性を研究するためのツールとして使用されます。 16,19 -宿主-寄生虫相互作用14を研究するハマダラカ蚊、アフリカにおけるマラリアの主要なベクトルで使用されています。これらの技術は、それらのパターン認識受容体（PRR）2で寄生虫を検出するために、昆虫の能力に基づいています。蚊はまた、病原体関連分子パターン（PAMP）のようなそれらの生物学的に干渉する他の分子を検出する、またはコラーゲンおよび核酸の放出に起因する独自の損傷した細胞を検出することができます。蚊免疫細胞23 -このような血球などの検出20のために使用されています。主な免疫シグナル伝達経路は、IMD、トール、JAK / STAT 24、およびリボ核酸干渉（RNAi）25,26です。トールおよびIMD経路の両方は、メラニンの応答に影響を及ぼし、プロフェノールオキシダーゼカスケード10との対話- 12。 メラニンの応答を刺激するために使用される標準的なツールは、胸腔の血リンパ中に小さなビーズと蚊の接種です。メラニンのカプセル化の程度は、その後、蚊の切開を介してビーズを回収した後、19を測定することができます。ほとんどの研究では、唯一のビーズは蚊15,16,27毎に注入したが、より多くのビーズを注入すると、メラニン応答19の限界を研究するために可能です。これらのビーズは、蚊の生理機能の妨害を制限するために、注射液（生理血清）を使用して注入され、蚊15,16,27の乾燥。色素は、ビーズの選択を容易にするためにこの溶液に添加します。これは、ビーズ15,16,27を取得するために使用される解剖ソリューションについても同様です。 非病原性の刺激で虫を接種することの利点は、免疫応答に直接影響に焦点を当てることができることです。 31、または免疫回避31 - - 34による寄生病原28、免疫抑制29への複雑な効果はありません。また、このような寿命や産卵数などの他の生活史形質、上の刺激の結果は、また、研究することができます。したがって、進化生態学を研究する研究者は、このようなツール2,35,36が必要な場合があります。例えば、免疫挑戦マルハナバチは、飢餓の下に短縮寿命を持っています。免疫刺激と展開の同様の負の効果は、多くの場合、短いで、その結果、別の無脊椎動物のモデルで観察されていますえー寿命以下繁殖成功13,27,37。このような研究は、環境に2,4,38を変えて実施することができます。免疫力を刺激することも免疫病理39,40に直接焦点を当てたものに興味があります。 このプロトコルは、メラニン応答を刺激し、直接メラニンの量を測定するために蚊を有するビーズの接種に基づいています。これは、異なる実験設定でメラニン応答の定量的および定性的な研究を可能にします。このようなツールは、加熱死菌41に抗菌性応答などの他の免疫応答の刺激に拡張することができます。また、多くの生態系の設定で行うことができます。

<table><tbody><tr><td>マイクロキャピラリーガラス管 GB120TF-10</td><td>science-products.com</td><td>GB120TF-10</td><td>http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html</td></tr><tr><td>マイクロキャップ キャピラリーピペットバルブ</td><td>Drumond</td><td>1-000-9000</td><td></td></tr><tr><td>負に帯電したセファデックス CM C-25 ビーズ</td><td>シグマ-アルドリッチ、シュタインハイム、ドイツ</td><td>C25120 シグマ</td><td>は、</td></tr><tr><td>メチルグリーン</td><td>を開始するためにほとんど必要ありませんSigma-Aldrich</td><td>323829 ALDRICH</td> は、Software ImageJ オープンソース <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Version 1.47f7 以降</td></tr>を起動するのにほとんど必要ありません</tbody></table>

接種<em&gt;ハマダラカ</emメラニン免疫応答を誘導し、測定するためにビーズと&gt;蚊

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

免疫応答の刺激は、有効性と免疫のメカニズムを検討する無脊椎動物研究における一般的なツールです。粒子は免疫系によって検出され、免疫エフェクターの産生を誘導するように、この刺激は、昆虫への非病原性粒子の注射に基づいています。私たちは、蚊ハマダラカにおけるメラニンの応答の刺激にここに焦点を当てます。メラニンの応答は、メラニンの暗い層で異物や寄生虫のカプセル化につながります。この応答を刺激するために、蚊は、微小ガラス管を用いて胸腔内のビーズを用いて接種します。そして、24時間後に、蚊がビーズを取得するために解剖されています。ビーズのメラニンの程度は画像分析ソフトウエアを用いて測定されます。ビーズは、病原性寄生虫の効果、または免疫応答を回避または抑制するための能力を持っていません。これらの注射は、measuする方法です免疫有効性及びそのような繁殖力や長寿などの他の生活史形質、上の免疫刺激の影響再。これは、直接宿主 - 寄生虫相互作用を研究するとまったく同じではありませんが、免疫力とその進化生態学を研究するための興味深いツールです。

<html>いくつかのビーズが少ない他よりもメラニン（ 図1）で覆われていたとして蚊は、同じようにビーズをメラニン化するすべてではないでした。実際、いくつかのビーズが（ 図1）他の人が完全に暗くしたのに対し、理由メラニンの不足の青のままでした。メラニン値（青およびunmelanizedビーズに相当）が0と100（暗いと高メラニンビーズに相当）（ 図2a及び2b）の間の値を線形補間することにより標準化しました。これらの値は、従って、免疫応答の強度は、ビーズのメラニンの程度を示し、。 私たちは、彼らのメラニン値を比較することにより、相互にビーズを比較することができます。メラニンの応答は、一般的ANOVAまたはガウスGLMのような古典的な統計分析を可能にする、ガウス分布に従います。 。 &quot;FO：キープtog...

ビーズの接種を通じて、記載されている技術は、血リンパ循環系における蚊のメラニン化反応の刺激を可能にします。ビーズを覆うメラニンの量は、免疫応答の尺度として解剖後に測定できます。

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

この接種技術の全体的な目標は、蚊の免疫応答を刺激し、メラニン化反応を測定することです。この方法は、ヒトの応答のコストの遺伝的根拠や環境要因の影響など、生態学的免疫学の分野における疑問に答えるのに役立ちます。この方法は免疫反応に関する洞察を提供しますが、他の無脊椎動物系における抗ウイルス応答や他の抗菌応答など、他のシステムにも適用できます。一般的に、この方法に不慣れな個人は、注射が引き起こす可能性のある昆虫の被害のために苦労します。生理食塩水99ミリリットルに0.1%メチルグリーン溶液1ミリリットルを加えて、透明なビーズを着色します。これは0.001%メチルグリーン注射液です。次に、5ミリリットルの0.1%メチルグリーン溶液を45ミリリットルの生理食塩水に加えます。この0.01%メチルグリーン解剖液は、ビーズの着色と解剖中の観察を容易にするために、メチルグリーンに10倍濃縮されています。溶液を摂氏110度で25分間オートクレーブします。キャピラリーを準備するには、マイクロキャピラリーガラス管をヒートプルして、最小のビーズよりもわずかに大きい非常に細い先端を取得します。ピンセットで先端を折るか、先端を切り落とすことにより、各キャピラリーを開いて調整します。キャピラリー付きのビーズを選択するには、5センチメートルのペトリ皿に0.009グラムの負に帯電したビーズを注ぎます。次に、30分前に5ミリリットルの注射液を追加します。これにより、注入用のビーズの選択を容易にするためにビーズが着色されます。キャピラリーピペットバルブに取り付けられたキャピラリーを使用して、双眼顕微鏡下で生理食塩水0.1マイクロリットルの最小ビーズを視覚的に選択します。後部のハマダラカは、摂氏26度プラスマイナス1度、相対湿度70プラスマイナス5%で、12時間の明るい、12時間の暗いサイクルで見られます。成人女性を飼い、10%の砂糖溶液にアクセスできるようにします。昆虫吸引器を使用して、各蚊を50ミリリットルのチューブに入れます。チューブを砕いた氷に入れて、各蚊を短時間冷やします。双眼顕微鏡の下で蚊を右側に置きます。蚊を適切に作成することは重要であり、ある程度のトレーニングが必要です。昆虫のキューティクルを貫通する方法を学び、ビーズが注入されたと信じることは非常に困難です。胸腔のキューティクルの左側をしっかりと突き刺し、その後、液体とビーズを注入することにより、毛細血管で蚊に接種します。毛細血管を蚊に対してできるだけ垂直に保持することにより、飛行筋を損傷しないように注意してください。注入後にキャピラリーを取り外します。.フェザー級昆虫学鉗子を使用して、各女性を個別に100%砂糖溶液にアクセスできる10ミリリットルのプラスチックカップに入れます。接種後24時間で蚊が生きているか確認してください。その

inoculating-anopheles-gambiae-mosquitoes-with-beads-to-induce-measure

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ハマダラカ蚊は、インドやアジア各地に生息するマラリアのためのベクトルです。このビデオでは、蚊にマラリアに抵抗性を付与される導入遺伝子でこの種のmicroinjectionsを実行するためのテクニックを示しています。このビデオで示されて方法論の多くは、他の蚊の種のマイクロインジェクション技術に適用可能である。...

の注入。ハマダラカの胚は、マラリア耐性の蚊を生成する

このビデオでは、胚マイクロインジェクション技術を通じて、ハマダラカの蚊の胚への遺伝子ドライブ構築物の送達を実演します。この手順により、相同組換えを通じて送達されたDNAコンストラクトを生殖細胞に統合し、形質転換された蚊の集団を生成することができます。...

蚊胚マイクロインジェクション:ハマダラカの胚卵黄に外因性DNAを送達して生殖細胞変異を生成する技術

このビデオは、弱毒化した生きたスポロゾイトでマウスモデルを免疫するためのアッセイを示しています。放射線が弱毒化されたマラリア原虫スポロゾイトは、マウスの耳の背側に注入されます。両耳の複数の場所に注射した後、マウスは回復します。...

マウスモデルにおける生弱毒スポロゾイトによる皮内免疫

ヒトの同時感染はin vitroで再現するのが困難です。しかし、ヒトマラリア原虫は、新たに分離されたヒト末梢血単核細胞がHIVに自然に感染したのと同様に、in...

アン<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV重感染のコンテキストでのマラリアに対する免疫応答を測定するためのモデル

RNA干渉（RNAi）は、遺伝子の機能を明らかにするための非常に貴重なツールです。しかし、成人前の段階でRNAiを使用して遺伝子を標的とする能力は、主要なヒトマラリアベクターであるAnopheles...

RNAiのトリガ配信へ<em&gt;ハマダラカ</em&gt;蛹

ここでは、マウスの皮膚から骨髄細胞を分離し、マラリア原虫のスポロゾイトの皮内注射後にリンパ節を排出するためのプロトコルについて説明します。採取した細胞のフローサイトメトリーは、寄生虫に対する皮膚およびリンパ節の炎症反応を特徴付けるための信頼性の高いアッセイを提供します。...

弱毒で皮内免疫後のマウスの皮膚及び排出リンパノードから骨髄性細胞の単離<em&gt;マラリア原虫</em&gt;スポロゾイト

私たちは、実験的な脳マラリアのマウスモデルを記述し、磁気共鳴画像法を用いて生体内で炎症性および微小血管の病理をどのように追跡できるかを示します。...

磁気共鳴映像法を用いた実験的大脳マラリアモデルにおける浮腫発生と微小血管病変のin vivo追跡

このプロトコルは、φC31システムを使用してアノフェレスマラリア蚊のゲノムにおいて部位特異的修飾を達成する方法を記述している。記載される改変には、attP含有ドッキングラインのゲノムにおけるトランスジェニックカセットの統合および交換の両方が含まれる。...

マラリアのアノフェレスベクターにおける部位特異的φC31媒介集積分とカセット交換

蚊のゲノムに外因性遺伝子を導入するには、マイクロインジェクション技術が不可欠です。このプロトコルは、変換された蚊を生成するために アノフェレスガンビア 胚にDNA構築物をマイクロ注入するためにジェームズ研究所によって使用される方法を説明します。...

アノフェレスガンビア胚の微小注入法

細菌によって産生されるdsRNAの経口投与は、 カエノラブディティス・エレガンス...

成虫 のアノフェレスガンビアエ 蚊への効果的な経口RNA干渉(RNAi)投与

標準的な膜供給アッセイ(SMFA)は、潜在的な抗マラリア化合物の評価と同定のためのゴールドスタンダードと見なされています。この人工給餌システムは、熱帯 熱...

ハマダラカ媒介動物における熱帯熱マラリア原虫感染の検出のための標準的な膜摂食アッセイ

学ぶ、ハマダラカの免疫応答を刺激しメラニン化反応を定量化する接種技術。生態免疫学における遺伝的基盤と環境要因の影響を解明し、無脊椎動物の抗ウイルス・抗菌応答研究にも応用可能です。

接種

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