Name: TGF-βを含むプロトコルを使用したナイーブCD4 + T細胞からのヒトCD4 + FOXP3 +誘導された調節性T細胞（iTregs）のインビトロ分化における (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 学ぶナイーブCD4陽性T細胞からTGF-βを用いてヒトFOXP3陽性iTregを誘導する方法。密度勾配遠心と磁気ビーズ分離で単離し、表面マーカーと細胞内FOXP3発現をフローサイトメトリーで解析する再現性の高い技術です。

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Nina Nagelは、ビデオ撮影と実験準備中の技術支援に感謝しています。細胞内FOXP3染色プロトコルの支援を提供してくださったEva-Maria Weiss氏と、nTreg分離プロトコルを確立してくださったElisabeth Suri-Payer氏とNina Oberle氏に感謝します。Matilda ErikssonとPeri Nooriは、ラボラトリーマネジメントで認められています。
Funding: A.S.は第7回欧州共同体フレームワークプログラム内のMarie Curie Intra European Fellowship、Dr. Åke Olsson Foundation、KI研究財団の支援を受けました。A.S.とJ.T.はCERIC(Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease)助成金の支援を受け、J.T.はVetenskapsrådet Medicine and Health (Dnr 2011-3264)の支援を受けました。 Torsten Söderberg Foundation、FP7 STATegra、AFA Insurance、Stockholm County Council。

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著者らは開示するものは何もない。

記載されているプロトコルは、人間のナイーブCD4 + T細胞からのヒトCD4 + FOXP3 + iTregsの堅牢な誘導を可能にします。それは我々が優れたin vitroでの抑制機能22とiTregsの誘導のために、TGF-β、ATRA及びラパマイシンの組み合わせを使用して、最近記載新しいプロトコルが含まれています。他の公表されたプロトコルに比べ、他の利点は、単独で、IL-2の存在下で活性化されたコントロール細胞と一緒に、特定のiTreg誘導因子の効果の直接比較を可能にする、異なるプロトコルによって並列に異なるiTreg集団の誘導であります。記載されているプロトコルは、低ドナー変動とFOXP3の再現可能な誘導を可能にします。このプロトコルでのナイーブCD4 + T細胞を、磁気活性化細胞選別により単離したが、蛍光活性化細胞選別も可能であるしています。このプロトコルにナイーブCD4 + T細胞の予想収量は、典型的には5〜10％の間であります<html>しかし、強くドナー（年齢）に依存し、赤血球の高い画分が存在する場合にも、下に表示され...

CD4 + CD25 + FOXP3 +調節性T細胞（Tregは）他の免疫細胞を抑制し、末梢寛容の重要なメディエーターであり、自己免疫及び過度の炎症1を防止します 。 Tregの重要性は、重度の全身性の自己免疫疾患につながるTregの損失による `master&#39;のTreg転写因子フォークヘッドボックスP3における変異にヒトの疾患immunodysregulationの多発性内分泌腺の腸のX連鎖症候群（IPEX）、（FOXP3）が例示されます早い年齢で致死。しかし、Tregは、彼らはまた、特定の設定2での抗腫瘍免疫を妨げることができますように免疫系における両刃の剣として作用します。 Treg細胞の数および機能の治療的操作は、したがって、多数の臨床研究の対象です。癌では、Tregの枯渇が望ましい可能性があると臨床的アプローチのいくつかの成功は、さらなる研究3を奨励しています。自己免疫および炎症性疾患において、セベにおけるTregの治療効果に加えてRALマウス疾患モデル、-host病（GVHD）4 対移植片を防ぐために、養子のTreg転送の最近の最初の人の試験- 7と1型糖尿病8は非常に有望な結果を示した治療の安全性を評価すること。 11 -当然のTreg（nTregs）を発生することは健康に9を維持する上で非冗長本質的な機能で、胸腺由来tTregsおよび末梢誘導さpTregsを備えます。しかし、nTreg番号は、ナイーブT細胞前駆体12からのin vitroで誘導したTreg（iTregs）の補完的なアプローチを奨励し、限られています。まだiTregsの安定性は、おそらくFOXP3遺伝子座13におけるいわゆるTreg細胞に特異的脱メチル化領域（TSDR）における脱メチル化の欠如のため、懸念のままであり、いくつかの研究は、 生体内でのTregを誘導することを示している14以上の安定しています。 現在までに、FOXP3は、最良のタンパク質メートルのままTregのためのarker人間従来のCD4 + CD25-T細胞は一過性の活性化15,16時FOXP3の中間レベルで発現するので、それは絶対に固有のものではありません。重要な進歩は、FOXP3発現の調節を明らかにしたが、多くは、特にヒト細胞におけるFOXP3の誘導、安定性及び機能に関する発見されていません。 nTregsの違いにもかかわらず、in vitroでの FOXP3誘導さ+ CD4 + T細胞はFoxp3誘発の分子機構を研究するためのモデル系として使用することができ、 中に、より類似しているiTregsの生成を可能にする将来のプロトコルを開発するための出発点として将来的に養子移入戦略の適用可能性が生成されたTregを、 生体内 。 そこに人間iTregsを誘導する全く`金standard&#39;プロトコルはなく、現在のプロトコルは、 生体内でのTreg誘導条件を模倣することに基づいて開発されている：2（IL-2、インターロイキン）およびトランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）シグナル伝達は、 インビボ 17 における Foxp3誘発のために重要であり、全トランスレチノイン酸（ATRA） -腸管関連樹状細胞によってインビボで産生される-頻繁Foxp3誘発を増強するために使用されます21 - 試験管 18インチ我々は、酪酸22、最近マウスのTreg誘導23,24を増強することが示された腸内細菌叢由来の短鎖脂肪酸を使用して、追加のヒトTregの誘導プロトコールを開発しました。我々はまた、最近、それが促進することが知られている阻害剤、後者はラパマイシン（mTORの）の臨床的に承認された哺乳類の対象となる、TGF-β、ATRAの組み合わせを使用し、22ラパマイシン することにより、in vitroでの優れた抑制機能付きiTregsの世代のための新しいプロトコルを確立しました人間のTreg拡張25,26の間にFOXP3のメンテナンス。 この方法は、再現性の中での説明しますFOXP3の発現のプロトコル固有のパターンや、その他のTreg署名分子を明らかにするために、フローサイトメトリーおよび定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）により、異なる条件のセット、およびその後続の表現型を用いて、ヒトCD4 + FOXP3 + iTregsのインビトロでの生成CD25、CTLA-4、EOS、ならびにIFN-γおよびSATB1 式 22の抑制など。生成された細胞集団は、一般的なFOXP3レギュレータに関するあるいは酪酸またはラパマイシンなどの特定の化合物に特有の効果を研究するか、抑制活性に関する機能アッセイまたは分子的研究のために使用することができます。 Treg細胞の分化を駆動する分子メカニズムのさらなる理解は、具体的Treg細胞の発生と機能に関与する分子を標的とする自己免疫または癌における今後の治療的アプローチのために非常に関連性があります。

<table><tbody><tr><td>オールトランスレチノイン酸</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>R2625-50MG&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト Foxp3-APC クローン 236A/E7</td><td>eBioscience</td><td>17-4777-42</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD25 マイクロビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-983</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD25-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-024</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD28 抗体、LEAF 精製&nbsp;</td><td>バイオレジェンド</td><td>302914</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD3抗体 LEAF Purified&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45RA, FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-247</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45RO PE clone UCHL1</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>345770</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a</td><td>eBioscience</td><td>48-0086-42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCTLA-4(CD152)、クローンBNI3、mIgG2ak、ブリリアントバイオレット421</td><td>BD Biosciences</td><td>562743</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトIFN-g FITCクローン4S。B3 です。mIgG1k</td><td>eBioscience</td><td>11-7319-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ブレフェルジンA含有溶液:GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>cDNA合成キット:SuperScript VILO(逆転写酵素)cDNA合成キット</td><td>Invitrogen</td><td>11754-250</td><td></td></tr><tr><td>密度遠心分離媒体:Ficoll-Paque</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 99.7%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS、熱不活化</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>固定生存率色素、eFluor 780&nbsp;&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14または65-0865-18&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3染色バッファーセット</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>注意:パラホルムアルデヒドが含まれています。抗体と組み合わせたキットでも購入できます。77-5774-40 抗ヒト Foxp3 染色セット APC クローン: 236A/E7 セット</td></tr><tr><td>GlutaMAX (200 mM L-アラニル-L-グルタミン)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>ヒトナイーブ CD4 T 細胞単離キット II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血清アルブミン 50 g/L</td><td>Baxter</td><td>1501057</td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces conglobatus 由来イオノマイシン >98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MACS LSカラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>マウス IgG1 K アイソタイプコントロール APC クローン: P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>17-4714-42</td><td></td></tr><tr><td>マウス IgG1 K アイソタイプコントロール FITC 50 &#956;g</td><td>eBioscience</td><td>11-4714-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>マウスIgG2aアイソタイプコントロール、ブリリアントバイオレット421、クローンMOPC-173</td><td>BD Biosciences</td><td>563464</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペットプラスチック、個別包装</td>された<td>Sarstedt</td><td>86.1172.001&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585-1MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ラパマイシン</td><td>EMD(メルク)</td><td>553210-100UG</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトIL-2、CF</td><td>R&D</td><td>202-IL-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト TGF-β 1, CF</td><td>RnD</td><td>240-B-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>RNA 単離キット: RNAqueous-Micro Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 ミディアム&nbsp;</td><td>インビトロジェン</td><td>72400-054&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>酪酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>B5887-250MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T細胞培養液:X-Vivo 15培地、ゲンタマイシン+フェノールLonza</td><td></td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay、FOXP3(ベストカバレッジ)&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182; アッセイID: Hs01085834_m1</td><td>注意: パラホルムアルデヒド</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351370; アッセイID: Hs04194366_g1&nbsp;&nbsp;</td><td>注意:パラホルムアルデヒドが含まれています</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369514</td><td></td></tr></tbody></table>

tgf-βを含むプロトコルを使用したナイーブcd4 + t細胞からのヒトcd4 + foxp3 +誘導された調節性t細胞（itregs）のインビトロ分化における

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

制御性T細胞(Treg)は、自己構造に対する免疫反応を抑制し、自己免疫疾患を予防する末梢耐性の不可欠な部分です。Tregsを養子として移植する、または癌のTregを枯渇させるための臨床的アプローチが進行中であり、有望な初期結果が得られています。
自然に発生するTreg（nTreg）の数は非常に限られているため、in vitro誘導Treg））iTreg）を使用して特定のTregの特徴を研究することは有利です。今日まで、制御性T細胞を描写するための最良の特異的タンパク質マーカーは、絶対的に特異的ではないものの、転写因子FOXP3です。末梢誘導性Tregの非冗長な役割を含むTregsの重要性にもかかわらず、iTregを生成するためのプロトコルは、特にヒト細胞について現在議論の余地があります。したがって、このプロトコルでは、さまざまなTreg誘導因子(TGF-βとIL-2のみ、またはレチノイン酸、ラパマイシン、または酪酸との組み合わせ)を並行して使用して、ヒトナイーブT細胞からのヒトCD4+FOXP3+ iTregsのin vitro分化について説明します。また、フローサイトメトリーとqRT-PCRによるこれらの細胞の表現型についても説明します。
これらのプロトコルは、FOXP3およびその他のTregシグネチャー遺伝子の再現性のある発現をもたらし、一般的なFOXP3制御メカニズムの研究だけでなく、特定の因子の影響を描写するためのプロトコル固有の効果の研究を可能にします。iTregは、Treg誘導の分子メカニズムだけでなく、さまざまな表現型の側面を研究するために利用することができます。詳細な分子研究は、比較的大きな細胞数を得ることができることによって促進されます。
>jove_content<これらのプロトコルによって生成されたiTregは、TGF-βとレチノイン酸およびラパマイシンによって誘導されたiTregが優れた抑制活性を示す抑制機能の研究などの機能アッセイにも使用できます。ただし、iTregの抑制能力はnTregとは異なる場合があり、適切な制御の使用が重要です。

図1は、実験のスキームを示します。 図2は、磁気的に分離されたナイーブCD4 + T細胞およびnTregsのための代表的な純度制御染色を示します。 Fのigure 3Aはゲート戦略フローサイトメトリーを示し、 図3Bは 、代表FOXP3及びCD25が示さiTregまたは制御条件下での培養6日目に染色フローサイトメトリーを示しています。 in vitroでの刺激を受けると、ほとんどの細胞は、ラパマイシンの存在下で還元されたCD25をアップレギュレートします。唯一のiTreg誘導因子の添加下で、FOXP3 +細胞の明確な集団はまた、iTregの条件の下でCD25 +細胞内に濃縮されている、明らかになります。 図3Cは、暗いク...

このプロトコルは、in vitroでのナイーブCD4 + T細胞から人為的な制御性T細胞（iTregs）の再現性の生成と表現型を説明しています。 Foxp3誘発のための異なるプロトコルは、それぞれのプロトコルを用いて得られた特定のiTregの表現型の研究を可能にします。

TGF-βを含むプロトコルを使用したナイーブCD4 + T細胞からのヒトCD4 + FOXP3 +誘導された調節性T細胞（iTregs）のインビトロ分化における

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

この実験の全体的な目標は、in vitroでナイーブCD4 T細胞からヒトFOXP3陽性制御性T細胞を誘導し、その表現型を分析することです。この方法は、制御性T細胞の分化が分子レベルでどのように起こるかなど、T細胞免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ヒトFOXP3陽性制御性T細胞の再現性のある作製と表現型解析が可能になることです。この方法は、制御性T細胞の分化に関する洞察を得ることができますが、他のCD4 T細胞サブセットや他の目的の免疫細胞を研究するために改変することもできます。PBMCと磁気ビットの絶縁ステップは、説明するのではなく示すと理解しやすいため、この方法を視覚的に示すことが重要です。末梢血T細胞を単離するには、まず、バフィーコートごとに5本の50ミリリットルチューブに15ミリリットルの室温密度勾配培地を追加し、室温PBSで最終的なバフィーコート容量を最大180ミリリットルにします。次に、密度勾配培地のチューブを横に傾け、溶液を混合せずに約35ミリリットルの希釈血液を密度勾配培地にゆっくりと層状にします。遠心分離により細胞を分離します。次に、各チューブの密度勾配とプラズマ相の間の白色PBMC層を新しい50ミリリットルの円錐形チューブに移します。PBMCを200ミリリットルの新鮮なPBSで洗浄し、プラスチック接着による末梢血単球の枯渇のためにペレットを完全な培地に再懸濁します。浮遊細胞を採取した後、PBMCを最大50ミリリットルの新鮮なPBSで3回洗浄し、最終ペレットを摂氏40マイクロリットルの40マイクロリットルの分離バッファーと10マイクロリットルのナイーブCD4陽性T細胞ビオチン抗体カクテルで10〜7番目の細胞に再懸濁し、十分に混合します。細胞を摂氏4度で10分間インキュベートし、次いで細胞を摂氏4度のPBSの40ミリリットルで洗浄し、ペレットを80マイクロリットルの分離緩衝液および20マイクロリットルの抗ビオチンマイクロビーズに1×10〜7番目の細胞で再懸濁し、摂氏4度で15分間インキュベートする。細胞をインキュベートしている間に、LSカラムを磁石に置き、3ミリリットルの分離バッファーで平衡化した後、50ミリリットルのPBSで細胞を洗浄し、ペレットを3ミリリットルの新鮮な分離バッファーに再懸濁します。次に、細胞をカラムに加え、ナイーブなCD4陽性T細胞含有フロースルーを15ミリリットルのチューブに集めます。カラムの滴下が止まったら、2 ミリリットルのアイソレーションバッファーでチューブをすすぎ、洗浄液をカラムに移します。最後の洗浄後、磁気的に選別されたT細胞を遠心分離によりペレット化し、続いて15ミリリットルの培地で2回洗浄すると、純度94%を超えるナイーブCD4陽性T細胞集団が得られます。制御性T細胞を誘導するには、抗CD3コーティングされた96ウェルプレートの対応するウェルに50マイクロリットルの適切な刺激を加えます。次に、マージンウェルを含む空のウェルに200マイクロリットルのPBSを充填し、プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%で予温します。37°C培地中で、休止ナイーブT細胞の濃度を1ミリリットルあたり10〜6細胞の密度の2.2〜2.6倍に調整し、各ウェルに50マイクロリットルの細胞を添加する。すべての細胞が播種されたら、光から保護するためにプレートをアルミホイルで包み、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。2〜3日後、増殖する細胞の小さなクラスターが後の時点でより大きなクラスターに出現するようになりますが、光学顕微鏡で見えるようになるはずです。4〜6日後、培地はわずかにオレンジ色から黄色がかった色に変化し、クラスター化された細胞ペレットが肉眼で見えるようになります。細胞表面マーカーの発現を評価するには、ピペットを使用して各ウェルの細胞を再懸濁し、細胞を新しい96ウェルU底プレートに移し、各ウェルの周囲に1つのウェルを空けて、スタンディングプロセス中のスピルオーバー汚染を防ぎます。すべての細胞が移されたら、プレートを遠心分離し、上清を捨てます。プレートを逆さまにして吸収紙の上に置いたまま、プレートを1回軽くたたいて、すぐに右側を上にします。ボルテックスして、残りの液体に細胞を再懸濁します。次に、25マイクロリットルの表面置きプレミックスを各ウェルに加え、プレートを暗所で摂氏4度で30分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、200マイクロリットルのPBSでウェルを2回洗浄し、上清を除去し、各洗浄後に細胞を再懸濁します。次に、FOXP3およびその他の目的のマーカーの生存率と細胞内染色を行います。これらのグラフでは、CD25陽性CD4陽性FOXP3陽性制御性T細胞のフローサイトメトリーゲーティング戦略が示されています。in vitro刺激を受けると、ほとんどの細胞がCD25をアップレギュレートし、その発現はラパマイシンの存在下で減少します。誘導性Treg因子が追加された場合にのみ、天然に存在するTregsと同じくらい高い細胞内タンパク質発現レベルを持つFOXP3陽性細胞の明確な集団が明らかになります。実際、誘導された各Treg条件は、細胞増殖の特異的で再現性のあるパターンを示しています。TGFベータは増殖のわずかな増加を誘導し、オールトランスレチノイン酸はT細胞の増殖を劇的に増加させ、培養物にラパマイシンを追加すると細胞クラスターサイズが大幅に減少します。誘導TregのQRT-PCR解析では、FOXP3 mRNAの発現は、コントロール刺激細胞と比較して、すべての誘導Treg培養で高く、ラパマイシン処理された誘導Tregは、誘導Treg培養物の中で最も低いレベルのFOXP3 mRNAを示すことが示されています。さらに、天然に存在するTregにおけるFOXP3 mRNAの発現は、誘導性制御性T細胞集団のいずれによっても示されるものよりも高いことが観察されます。この技術は、T細胞免疫学分野の研究者が、健康なドナーや自己免疫疾患やがんの患者におけるTregの生成と機能の分子メカニズムを探求する道を開くものです。このビデオを見れば、ヒトのナイーブCD4陽性T細胞を単離する方法や、得られたNUを制御性T細胞に分化して表現型化する方法について、十分に理解できるはずです。人間の血液やパラホルムアルデヒドを扱う作業は非常に危険であることを忘れないでください。したがって、これらの手順を実行する際には、前処理、すべてのワクチン接種、防護服の着用、適切な廃棄物処理の使用などの予防措置を考慮する必要があります。

in-vitro-differentiation-human-cd4-foxp3-induced-regulatory-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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TGF-βを含むプロトコルを使用したナイーブCD4 ⁺ T細胞からのヒトCD4 ⁺ FOXP3 ⁺誘導された調節性T細胞（iTregs）のインビトロ分化における

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